JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מציג פרוטוקול חדש להפעלת כוח מכני ישירות על גרעין התא באמצעות מיקרובים מגנטיים המועברים לתוך הציטופלסמה ולביצוע הדמיה פלואורסצנטית בו-זמנית של תאים חיים.

Abstract

שאלה בסיסית במכנוביולוגיה היא כיצד תאים חיים חשים גירויים מכניים חוץ-תאיים בהקשר של פיזיולוגיה ופתולוגיה של התא. תחושת המכנו התאית של גירויים מכניים חוץ-תאיים היא ככל הנראה דרך קולטני הממברנה, קומפלקס החלבונים הקשורים ושלד הציטוסקלטון. ההתקדמות האחרונה במכנוביולוגיה מדגימה כי גרעין התא בציטופלסמה עצמה יכול לחוש באופן עצמאי גירויים מכניים בו זמנית. עם זאת, הבנה מכניסטית של האופן שבו גרעין התא חש, מתמר ומגיב לגירויים מכניים לוקה בחסר, בעיקר בגלל האתגרים הטכניים בגישה ובכימות מכניקת הגרעין על ידי כלים קונבנציונליים. מאמר זה מתאר את התכנון, הייצור והיישום של מפעיל כוח מגנטי חדש המפעיל גירויים מכניים תלת-ממדיים מדויקים ולא פולשניים כדי לעוות ישירות את גרעין התא. באמצעות שימוש בתאים מהונדסים של CRISPR/Cas9, מחקר זה מדגים כי כלי זה, בשילוב עם הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית ברזולוציה גבוהה, מאפשר את גילוי הדינמיקה בזמן אמת של חלבון רגיש למכנו (YAP) בתאים בודדים כפונקציה של עיוות גרעין. לשיטה פשוטה זו יש פוטנציאל לגשר על הפער הטכנולוגי הנוכחי בקהילת המכנוביולוגיה ולספק תשובות לפער הידע הקיים ביחס בין גרעין המכנוטרנסדוקציה לתפקוד התא.

Introduction

מחקר זה נועד לפתח וליישם טכניקה חדשה להבהרת גרעין המכנוביולוגיה על ידי שילוב של המפעילים מגנטיים המפעילים כוח מכני ישירות על גרעין התא ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית המדמה בו זמנית את השינויים התת-תאיים המבניים והתפקודיים. התאים חשים אותות ביופיזיים חוץ-תאיים, כולל קשיחות רקמות 1,2,3,4, לחץ נוזל בין-תאי ולחץ גזירה 5,6,7, טופולוגיה/גיאומטריה של פני השטח 8,9,10,11,12, ולחץ מתח/דחיסה13,14, 15,16. אותות ביופיזיים מומרים לאותות ביוכימיים ומעוררים שינויים פוטנציאליים במורד הזרם של ביטוי גנים והתנהגויות תאים - תהליך המכונה מכנינוטרנסדוקציה 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . כדי לחקור תהליכי מכני-טרנסדוקציה, פותחו מספר עצום של טכניקות להפעלת כוח מכני על התאים, כגון מיקרוסקופיה של כוח אטומי28, מכשיר מתיחה של תאים29, חיישן כוח ביו-MEMS (מערכות מיקרו-אלקטרו-מכניות) 15,30,31, ריאולוגיה גזירה 32 ומערכת ראייה סטריאופונית 33 . סקירה שפורסמה לאחרונה מסכמת את הגישות להפעלת רמזים מכניים חוץ-תאיים ולהפריע למכניוסנסינג34. נכון להיום, רוב השיטות הללו מפעילות כוח על קרום הפלזמה של התא, והתאים מקבלים ישירות את האותות הביופיזיים החוץ-תאיים האלה באמצעות קולטני ממברנה כגון אינטגרין, קדהרין, תעלות יונים וקולטנים מצומדים לחלבון G. לאחר מכן, הם מעבירים את האות לשלד התוך תאי ולגרעין. לדוגמה, באמצעות טרנסלוקציה של חלבון הקשור כן (YAP) כאינדיקטור לחישת מכנו, תאים נראים חשים את האותות המכניים של נוקשות המצע והמתח החוץ-תאי מקרום התא ומעבירים אותם דרך השלד הציטוסקולרי לתוך הגרעין כדי לגרום לטרנסלוקציה של ציטופלסמה לגרעין YAP28,35.

עדויות עדכניות מצביעות על כך שגרעין התא עצמו הוא חיישן מכנו עצמאי 8,36,37. זה הוכח על ידי ניסויים שבוצעו על הגרעין המבודד שנקטף מתאים, שם התגלה כי גרעינים באופן אדפטיבי לשנות את הנוקשות שלהם בתגובה לכוח המכני המופעל ישירות עליהם36. בתנאים פיזיולוגיים רבים, גרעינים הן בתאים סרטניים והן בתאים בריאים חשים אותות ביופיזיקליים חוץ-תאיים ומשנים את תכונותיהם המכניות ואת מכלוליהם38,39,40. לדוגמה, עם האקסטרווזה, הנוקשות הגרעינית של תאי הגידול פוחתת ושומרת על רכות במשך יותר מ-24 שעות38. במהלך נדידה דרך חלל ביניים סגור, גרעיני תאי הגידול מאבדים לעתים קרובות ומשחזרים את שלמותם המבנית39. עם זאת, האופן שבו הגרעין חש את האות הביופיזי אינו ידוע, אם כי נמצאו מעורבים מספר חלבונים בעלי מעטפת גרעינית ומשפחות של חלבונים, כגון Lamin A/C ומקשר של קומפלקס נוקלאוסקלטון וציטוסקלטון (LINC)38,41. לפיכך, שיטות לא פולשניות חדשות שיכולות להפעיל כוח ישירות על הגרעין ינתקו את ההשפעה של העברת כוח מממברנת התא-פלזמה ושלד הציטוסקלטון, ויסייעו להבהיר את המנגנונים המולקולריים שלא היו נגישים בעבר של חישת מכנו-חישה גרעינית.

מחקר שהשתמש בפינצטה אופטית כדי לתמרן אברונים42 ומיקרובים שהוזרקו לתאים43 הראה את היכולת הטכנולוגית של הפעלת כוח ישירות על הגרעין. עם זאת, לטכניקת הפינצטה האופטית יש מספר מגבלות: (1) פינצטות אופטיות בעלות תפוקה נמוכה לעיתים קרובות מתמרנות רק תא אחד או מיקרובאד אחד בכל פעם; ו-(2) פוטו-דפורמציה פוטנציאלית ועיוות טמפרטורה של הגרעין דורשת עשרות pN36, ועוצמת הלייזר הנדרשת המתאימה היא כ-10 mW ל-pN44,45. עוצמת לייזר כזו מספיקה כדי לגרום לפוטו-נזק בתאים ולהפריע לתפקודי התאים במהלך הניסוי46.

כוח מגנטי המופעל באמצעות מיקרובים בתוך תאים חיים מראה את הפוטנציאל להפעיל כוח ישירות על הגרעין ומתגבר על המגבלות של פינצטה אופטית. ברגע שמיקרובים מועברים לתוך הציטופלסמה, שדה מגנטי יכול להפעיל כוח מגנטי על מספר מיקרובים בו זמנית באופן בעל תפוקה גבוהה. השדה המגנטי אינו משפיע על תפקודי התא47, אלא מייצר כוח מ-pN ל-nN, וזה מספיק כדי לגרום לעיוות גרעיני 36,48,49. עד כה, מניפולציה של חיידקים מגנטיים יושמה על קרום פלזמה תאית48, בתוך הציטופלסמה50, על F-actin51, בתוך הגרעין47, ועל הגרעין המבודד36. עם זאת, מניפולציה מגנטית של מיקרובים מעולם לא שימשה להפעלת כוח מכני ישיר על מעטפת הגרעין כדי לחקור מכנוטרנסדוקציה בגרעין.

במאמר זה פותחה טכניקה פשוטה להעברה לא פולשנית של מיקרובים מגנטיים לתוך הציטופלסמה, ושימוש במיקרובים האלה כדי להפעיל כוח מכני על הגרעין (איור 1). כאן, קווי תאי B2B אנושיים רגילים מהונדסים על ידי CRISPR/Cas9 המבטאים באופן אנדוגני mNeonGreen21-10/11-מתויג YAP משמשים לאימות השיטה. YAP הוא חלבון רגיש למכנו, והטרנסלוקציה של YAP מווסתת על ידי חישת מכאנו גרעינית14,28. גישת ה-knock-in המווסתת קריספר/Cas9 נבחרה כדי לתייג YAP אנדוגני עם חלבון פלואורסצנטי (FP) mNeonGreen21-10/11. למרות שידוע שלעריכת קריספר יש יעילות חלקית ואפקט מחוץ למטרה, הפרוטוקולים בפרסומים קודמים שילבו מיון פלואורסצנטי כדי לבחור להכנסת מסגרת קריאה פתוחה נכונה52,53,54. עם שכבת בחירה נוספת זו, לא נצפה אירוע תיוג מחוץ למטרה ב-20+ שורות תאים שנוצרו בעברב-52,53,54,55. זהו מבנה חלבון פלואורסצנטי מפוצל, אך באופן עקרוני, כל תג פלואורסצנטי הניתן לביטוי יכול להיות שמיש. גישת תיוג זו עדיפה על שיטות טרנסגניות או נוגדנים. ראשית, בניגוד לביטוי הטרנסגני, החלבון המתויג שומר על מינון גן של עותק יחיד ומתבטא בהקשר הפיזיולוגי של רשת הוויסות של הגנים המקומיים, תוך הגבלת סטיות בריכוז החלבון, לוקליזציה ואינטראקציה. שיטת התיוג ששימשה במחקר זה משיגה תפוקה ויעילות גבוהות יותר בסדר גודל מאשר תיוג FP מלא. הוא גם נמנע מאתגרים הקשורים לאימונופלואורסצנציה בשל ממצאי קיבוע והזמינות המוגבלת של נוגדנים איכותיים וספציפיים במיוחד. שנית, הגישה שבה נעשה שימוש במאמר זה עושה מינימום הפרעה לפיזיולוגיה של התא ומאפשרת גילוי בזמן אמת של כל ה-YAPs האנדוגניים באופן אותנטי. לעומת זאת, שיטות טרנסגניות נפוצות אחרות מובילות לעתים קרובות לביטוי יתר של YAP. ההפצה המלאכותית הנובעת מכך עלולה לגרום לציטוטוקסיות ולהשפיע על חישת מכאנו של תאים56,57,58.

מחקר זה מציג פרוטוקול להפעלת כוח ישירות על הגרעין באמצעות מיקרובים מגנטיים המועברים לתוך הציטופלסמה ולביצוע הדמיה פלואורסצנטית בו-זמנית של תאים חיים. לסיכום, הפרוטוקולים המוצגים כאן מדגימים כיצד (1) להעביר מיקרובים מגנטיים לתוך התא כשהם מחוץ לגרעין, (2) לתמרן את המיקרובים כדי להפעיל כוח מגנטי על הגרעין, (3) לבצע הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של התאים במהלך מניפולציה, ו-(4) לנתח באופן כמותי את יחס הגרעין/ציטופלסמה (N/C) של YAP לאורך כל תהליך יישום הכוח. התוצאות מצביעות על כך ש-(1) באמצעות אנדוציטוזה, מיקרובים מגנטיים יכולים להיות מועברים באופן לא פולשני לציטופלסמה של תאי B2B תוך 7 שעות (איור 2 ואיור 3); ו-(2) כוח מגנטי מכמת המופעל ישירות על הגרעין (איור 4, איור 5 ואיור 6) לבדו יכול לגרום לשינויים מגוונים ביחס YAP N/C בתאי B2B מהונדסים של CRISPR/Cas9 (איור 7 ואיור 8).

Protocol

1. תחזוקה של תאי B2B מהונדסים בקריספר/Cas9

  1. תרבית תאי B2B בבקבוק T25 עם RPMI-1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
  2. שמור על תאי B2B באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  3. תת-תרבית של תאי B2B כאשר המפגש מגיע ל-70% עד 80%.
  4. אחסן את קו התאים B2B בתרבית RPMI-1640 בינונית עם 10% (v/v) DMSO במקפיא של -80 °C.
  5. השתמש בתאי B2B עם מספר מעבר קטן מ-10 בניסויים.

2. תרבית תאים

  1. זרעו את התאים על צלחת פטרי עם תחתית זכוכית.
    1. הזיזו את הבקבוקון המכיל תאי B2B פנימה מהאינקובטור לארון ה-biosafety.
    2. הסר את מדיום התרבית בבקבוקון באמצעות פיפטה שאפתנית עם משאבת ואקום מחוברת.
    3. לשטוף את הבקבוקון עם 2 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS).
    4. הסר PBS באמצעות פיפטה שואפת.
    5. הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.05% כדי לנתק תאים מתחתית מצע הבקבוקון.
    6. שים את הבקבוקון בחממה במשך 5 דקות.
    7. העבירו את הבקבוקון לארון הבטיחות הביולוגית. הוסף 5 מ"ל של מדיום תרבות חדש לתוך הבקבוקון פיפטה את הפתרון למעלה ולמטה.
    8. הפקידו 50 μL של המדיום עם תאים (300 תאים / μL) על צלחת פטרי תחתית זכוכית. הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבות לתוך צלחת פטרי.
    9. מכניסים את צלחת הפטרי לחממה. המתן 12 שעות עד שהתאים יתחברו.
  2. תרבית את התאים עם מיקרובים מגנטיים.
    1. שוקלים 0.2 גרם של מיקרובי ברזל קרבוניל בקוטר ממוצע של 7 מיקרומטר (להלן 5 מיקרובים של 7 מיקרומטר, ראו טבלת החומרים).
    2. השתמש פיפטה כדי להשעות את microads ב 1 מ"ל של מדיום תרבית RPMI-1640.
    3. קח את צלחת פטרי עם תאי B2B לארון הבטיחות הביולוגית.
    4. הוסיפו 200 מיקרוליטר של המדיום המכיל מיקרובים לצלחת פטרי.
      הערה: הוסיפו את המדיום במהירות כדי למנוע משקעים של החיידקים.
    5. החזירו את צלחת הפטרי לאינקובטור עד שהחיידקים יופנמו על ידי התאים. בדוק את ההפנמה כל 6 שעות כדי לקבוע את הזמן האופטימלי להפנמה עבור קווי תאים שונים.
    6. כדי לבדוק את ההפנמה, בצע הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית כדי לדמיין את גבול המיקרוב, הגרעין והתא. אם המיקרוב מופנם על ידי התא, הוא יהיה בתוך גבולות התא.

3. הדמיה של גרעין

  1. מחממים 1.5 מ"ל של מדיום התרבות באינקובטור במשך 15 דקות.
  2. כבו את האור של ארון הבטיחות הביולוגית. קחו את צלחת הפטרי המכילה את התא, מדיום התרבית המחוממת, הכתם הגרעיני ו-Verapamil HCl לארון הביו-בטיחות.
    הערה: רכיבי צביעה גרעינית רגישים לאור. יש להימנע מחשיפה לאור במהלך הפעולה.
  3. דילול 1000x כתם גרעיני על ידי DMSO עד 100x.
  4. יש לדלל 100 mM Verapamil HCl על ידי DMSO ל-10 mM.
  5. הוסף 15 μL של 100x כתם גרעיני ו 15 μL של 10 mM Verapamil HCl ל 1.5 מ"ל של מדיום תרבית. מערבבים היטב על ידי צנרת למעלה ולמטה.
  6. הסר את מדיום התרבות מצלחת פטרי. הוסף את מדיום התרבות המכיל כתמים גרעיניים לתוך צלחת פטרי.
  7. החזירו את התאים לאינקובטור למשך יותר משעתיים.

4. הכנת חומרת יישום הכוח המגנטי

  1. הדפס בתלת-ממד את כל החלקים באמצעות אקרילוניטריל בוטאדיאן סטירן (ABS) והרכיב אותם בהתאם לתכנון ה-CAD (איור 1A). עיצוב ה-CAD כלול בטבלת החומרים.
  2. השתמשו בקלטת דו-צדדית כדי לחבר את המגנט למכשיר שנע על ידי המגנט (איור 1A).
  3. הניחו את המכשיר הנע במגנט ליד במת המיקרוסקופ. השתמשו בשלושת הידיות כדי לכוונן את המיקום המרחבי של המגנט עד שהוא יוכל לנוע מעל צלחת פטרי בין 13 מ"מ ל-120 מ"מ.
    הערה: ודא שהגבול העליון של המרחק בין המגנט לצלחת פטרי גדול ככל האפשר כדי למנוע הפעלת כוח לא רצויה על החיידקים המגנטיים. 120 מ"מ הוא הערך המרבי במערך ניסיוני זה. ודא שהמגנט אינו מפריע לחלקי המיקרוסקופ, כולל מטרות ושלבים ממונעים.
  4. הגדר את המגנט למיקום z הגבוה ביותר (ב- 120 מ"מ).

5. יישום כוח והדמיית תאים חיים

  1. הגדרת תא הסביבה להדמיה ארוכת טווח
    1. החל תמיסת אתנול 75% כדי לעקר ביסודיות ולנקות את תא הסביבה.
    2. מקם את תא הסביבה על הבמה הממונעת של המיקרוסקופ ההפוך.
    3. פתח את מיכל CO 2 והגדר את קצב זרימת ה- CO2 ל- 160 מ"ל לדקה.
    4. כוונן את טמפרטורת התא ל-44 °C (למעלה), 42 °C (אמבטיה) ו-40 °C (במה).
    5. הוסיפו 20 מ"ל של מים מטוהרים לאמבטיה של תא הסביבה כדי לשמור על 90% לחות.
    6. מוציאים את צלחת הפטרי בעלת תחתית הזכוכית המכילה תאי מטרה מהאינקובטור של תרבית הרקמה ומכניסים אותה לתא.
    7. החל את מהדק המתכת של תא הסביבה כדי לתקן את מיקום צלחת פטרי.
      הערה: צלחת פטרי חייבת להיות מהודקת היטב בתא מכיוון שהכוח המגנטי עשוי להזיז את המנה אם היא לא מהודקת.
    8. סגור את מכסה החדר.
  2. אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה
    1. מטב את גודל חור הסיכה: חור הסיכה חוסם את הפוטונים שאינם ממוקדים. גודל חור סיכה גדול יותר מניב יותר פוטונים שאינם ממוקדים, אך תמונה בהירה יותר. גודל חור סיכה קטן יותר מניב תמונה ממוקדת ועמומה יותר. הקפד למטב את גודל חור הסיכה כדי לקבל תמונות קונפוקליות במיקוד עם יחס אות לרעש המתאים.
    2. מטב את עוצמת הלייזר: עוצמת הלייזר קובעת את עוצמת העירור ובכך את עוצמת הפליטה של האור. עוצמת הלייזר הנמוכה מעניקה יחס אות לרעש נמוך. עוצמת לייזר גבוהה מדי תגרום להלבנת תמונות. כוונן את עוצמת הלייזר בהתאם.
    3. מטב את גודל הצעד והצעדים: צעדים וגודל צעדים קובעים כמה תמונות יצלמו בערימת Z. גדלי צעדים קטנים יותר וצעדים רבים יותר יגדילו את רזולוציית Z-stack אך גם יגדילו את הלבנת התמונות. בניסוי זה נעשה שימוש בגודל צעד של 1 מיקרומטר עבור התאים עם ~ 15 מיקרומטר גובה התא.
    4. מטב את זמן החשיפה: זמן החשיפה קובע כמה זמן ייחשף התא ללייזר העירור. זמן חשיפה נמוך יקטין את יחס האות לרעש. זמן חשיפה גבוה יגרום להלבנת תמונות. בניסוי זה נעשה שימוש בזמן חשיפה של פריים אחד לכל 4 שניות.
    5. אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה: שנה אחד מארבעת הפרמטרים באופן איטרטיבי ושמור על עקביות הפרמטרים האחרים. בכל פעם, מדוד את יחס YAP N/C של כל תמונה והשווה את השינוי ביחס YAP N/C כדי לקבוע את רמת הלבנת התמונות. חזור על תהליך האופטימיזציה עד להשגת איזון בין יחס אות לרעש, מהירות הדמיה והלבנת תמונות.
    6. הגדר את תצורות ההדמיה באמצעות פרמטרי ההדמיה הממוטבים להגדרות הדמיה מהירות יותר במהלך הניסויים.
      הערה: התצורות ששימשו במחקר זה מתוארות בסעיף 5.3 של פרמטרי ההדמיה. כדי למטב את פרמטרי ההדמיה של תצורות בסעיף 5.3, השתמש באותה שיטה כמו בשלב 5.2.5.
  3. יישום כוח קטן והדמיה קונפוקלית
    הערה: מיקרוסקופ Nikon Ti2-E שימש להדמיה במחקר זה, ושלבים מפורטים לרכישת תמונה מובאים להלן.
    1. פתח את המיקרוסקופ ההפוך. פתח את יישום התוכנה Elements.
    2. הגדר תצורה magnetic_find. בדוק רק ערוץ FITC. הגדר PMT HV = 70, היסט = 0, עוצמת לייזר = 10. הגדר את מהירות הסריקה לפריים אחד לכל 2 שניות על ידי לחיצה על לחצן 1/2 . הגדר את גודל חור הסיכה ל- 1.2 AU על-ידי לחיצה על לחצן 1.2 A.U. . תצורה זו תשמש בשלב 5.3.5.
    3. הגדר תצורה magnetic_YAP_Nucleus. בדוק את ערוץ FITC. הגדר PMT HV = 70, היסט = 0, עוצמת לייזר = 10. הגדר את מהירות הסריקה לפריים אחד לכל 4 שניות על ידי לחיצה על לחצן 1/2 . הגדר את גודל חור הסיכה ל- 1.2 AU על-ידי לחיצה על לחצן 1.2 A.U. . כדי לדמות את גבול הגרעין ואת עוצמת הכתם הגרעיני, בדוק את ערוץ Cy5. הגדר PMT HV = 70, היסט = 0, עוצמת לייזר = 10. גודל חור הסיכה מותאם להדמיית YAP תלת-ממדית. אל תלחץ שוב על לחצן 1.2 A.U . לאחר בדיקת ערוץ Cy5. תצורה זו תשמש בשלב 5.3.7.
    4. הפעל DIA דרך רכיבים במידת הצורך. פתח את SpinView, השתמש בשדה בהיר והתאם את המיקוד של האובייקט כדי לקבל תמונה ברורה של תאים במיקוד. השתמש במטרה של פי 10 כדי למצוא תאים בודדים מרובים מתאימים בשלושה תנאים: עם מיקרוב יחיד בפנים, עם מיקרובים מרובים בפנים, וללא מיקרובים בפנים. עבור למטרה 40x. תן שם לעמדה זו עם מספר המיקום המתאים.
    5. פתח רכיבים. לחץ על magnetic_find. לחץ על הלחצן הסר אינטרלוק.
    6. לחץ על סרוק והתאם את מיקום Z של מישור המוקד. לחץ על הלחצנים העליון והתחתון כדי להגדיר את הגבול התחתון והעליון עבור ערימת Z של התאים שנבחרו. הפסק לסרוק על-ידי לחיצה נוספת על סרוק.
    7. עבור לתצורת magnetic_YAP_Nucleus . הגדר את שם הקובץ כ - before_small_force.nd2. לחץ על הפעלה כפתור עם מחסנית Z מוקלטת.
    8. עבור לנתיב התאורה הימני והפעל את DIA. פתח את SpinView ולחץ על כפתור ההקלטה . בינתיים, סובבו את ידית המכשיר הנע מגנט כדי להזיז את המגנט מטה ל-46 מ"מ מעל תחתית צלחת פטרי. שמור רצף תמונות או וידאו בשדה בהיר. בדוק את הסרטון כדי לוודא שמיקרובים מראים תזוזה המושרה על ידי כוח מגנטי.
    9. חזור על שלבים 5.3.5-5.3.7; הגדר את שם הקובץ ל- after_small_force.nd2.
    10. עבור לנתיב התאורה הימני והפעל את DIA. לאחר מכן, פתח את SpinView ולחץ על כפתור ההקלטה . בינתיים, סובבו את ידית המכשיר הנע מגנט כדי להזיז את המגנט עד 120 מ"מ מעל תחתית צלחת פטרי. שמור רצף תמונות או וידאו בשדה בהיר.
    11. חזור על שלבים 5.3.5-5.3.7 והגדר את שם הקובץ ל- before_large_force.nd2.
  4. יישום כוח גדול והדמיה קונפוקלית
    1. הסר את המכסה של תא הסביבה כדי לאפשר למגנט להגיע ל-13 מ"מ מעל תחתית צלחת פטרי.
    2. עבור לנתיב התאורה הימני והפעל את DIA. פתח את SpinView ולחץ על כפתור ההקלטה . בינתיים, סובבו את ידית המכשיר הנע מגנט כדי להזיז את המגנט עד 13 מ"מ מעל תחתית צלחת פטרי. שמור רצף תמונות או וידאו בשדה בהיר. בדוק את הסרטון כדי לוודא שמיקרובים מראים תזוזה המושרה על ידי כוח מגנטי.
    3. חזור על שלבים 5.3.5-5.3.7 והגדר את שם הקובץ ל- after_large_force.nd2.
    4. עבור לנתיב התאורה הימני והפעל את DIA. לאחר מכן, פתח את SpinView ולחץ על כפתור ההקלטה . בינתיים, סובבו את ידית המכשיר הנע מגנט כדי להזיז את המגנט עד 120 מ"מ מעל תחתית צלחת פטרי. שמור רצף תמונות או וידאו בשדה בהיר.
    5. חזור על שלבים 5.3.5-5.3.7; הגדר את שם הקובץ ל- retract_large_force.nd2.
    6. סגור את המכסה של תא הסביבה.
  5. חזור על שלבים 5.2 ו- 5.3 עבור שדות תצוגה מרובים כדי לקבל נתונים נוספים במידת הצורך.

6. עיבוד תמונה וניתוח נתונים

  1. כימות יחס YAP N/C
    1. פתח את פיג'י אימג'יי. פתח את תמונות ה- .nd2 שצולמו בשלב 5.
    2. לחץ על נתח > הגדר מדידות. אזור בדיקה, צפיפות משולבת, ערך אפור ממוצע ומתארי צורות.
    3. השתמש בערוץ Cy5 כדי לזהות את הגרעין. לחצו על ' בחירות חופשיות' כדי להשתמש בכלי הבחירה החופשית כדי ליצור קווי מתאר של הגרעין. כמו כן, בדוק את המאקרו של המסכה הגרעינית האוטומטית ב- ImageJ (ראה טבלת חומרים).
    4. לחץ על נתח > מדידה בערוץ FITC. הערך הנמדד של הממוצע הוא עוצמת YAP גרעינית ממוצעת DN.
    5. השתמש בערוץ Cy5 כדי לזהות את הגרעין. השתמש בערוץ FITC כדי לזהות את התא. לחצו על 'בחירות חופשיות' כדי להשתמש בכלי הבחירה החופשית כדי לבחור אזור מעניין בתוך הציטופלסמה ולהימנע מהמיקרוב המגנטי. אסור שאזור עניין זה יכלול את הגרעין.
    6. לחצו על 'נתח > מדידה ' בערוץ FITC. הערך הנמדד של הממוצע הוא עוצמת YAP הציטופלסמית הממוצעת DC.
    7. חישוב יחס YAP N/C = D N / DC.
  2. כימות הצורה הגרעינית ועוצמת הכתמים הגרעיניים המנורמלים
    1. פתח את פיג'י אימג'יי. פתח את תמונות ה- .nd2 שצולמו בשלב 5.
    2. לחץ על נתח > הגדר מדידות. אזור בדיקה, צפיפות משולבת, ערך אפור ממוצע ומתארי צורות.
    3. השתמש בערוץ Cy5 כדי לזהות את הגרעין. לחצו על ' בחירות חופשיות' כדי להשתמש בכלי הבחירה החופשית כדי ליצור קווי מתאר של הגרעין.
    4. לחץ על נתח > מדידה בערוץ Cy5. הערך הנמדד של הממוצע הוא עוצמת הכתם הגרעיני. הערך הנמדד של Circ. היא מעגליות גרעינית.
    5. כדי להשוות את עוצמת הכתם הגרעיני במצב כוח שונה, כל עוצמת הכתם הגרעיני מחולקת בעוצמת הכתם הגרעיני ב-"before_small_force.nd2" כדי ליצור את עוצמת הכתם הגרעיני המנורמלת.

תוצאות

תכנון מכשיר הנעת מגנט ויישום כוח מגנטי
כדי להפעיל כוח על הגרעין דרך המיקרובים המגנטיים, תוכנן ונבנה מכשיר הנע מגנט כדי לשלוט במיקום המרחבי של המגנט. המכשיר הנע באמצעות מגנט מכיל מסגרת מרכזית, שלוש ידיות ומסילות להזזת המגנט המחובר בכיוונים x, y ו-z באופן עצמאי ברזולוציה המרחבית של ...

Discussion

הפנמה של מיקרובים מגנטיים (סעיף 2.2) היא קריטית מאחר שמיקרובים חוץ-תאיים אינם יכולים להפעיל כוח ישירות על הגרעין. הפעלת כוח והדמיה (סעיף 5.3) הם שלבים קריטיים בניסוי זה, והכוח הדרוש כדי לעוות את הגרעין ולגרום לתוצאות ביולוגיות משמעותיות עשוי להיות תלוי בדגימה. ניתן להגדיל עוד יותר את עוצמת הכו...

Disclosures

אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

פרויקט זה ממומן על ידי חבילת הסטארט-אפ של פרס UF Gatorade (X. T.), פרס הפיילוט של UFHCC (X. T. וד"ר דיטמר סימן), קרן הזרעים של UF Opportunity (X. T.), ותוכנית החוקרים של אוניברסיטת UFHCC (H. Y. Wang). אנו מעריכים מאוד את הדיונים האינטלקטואליים עם ד"ר ג'ונתן ליכט (UFHCC), ד"ר רולף רן (UFHCC), ד"ר כריסטופר וולפה (UFHCC), ד"ר בלנקה שארמה (BME), ד"ר מארק שפלאק (MAE ו- ECE), ד"ר דניאל פריס (BME), ד"ר מליסה סרנטינורנונט (MAE), ד"ר אשוק קומאר (MAE), ד"ר בנג'מין קסלובסקי (BME), ד"ר ברנט גילה (RSC), ד"ר פיליפ פנג (ECE), ד"ר גרגורי א. הודלה (BME), ד"ר סטיבן גיביזאני (OSSM), ד"ר יניסל קרוז-אלמיידה (CDBS), ד"ר רוג'ר פילינגים (CD-BS), ד"ר רוברט קאודל (OMS), ד"ר ג'ון נויברט (DN-OR), ד"ר ג'סטין היליארד (נוירוכירורגיה), ד"ר טיאן הא (אוניברסיטת הרווארד), ד"ר יוהואה טאן (האוניברסיטה הפוליטכנית של הונג קונג), ד"ר ג'סי L-S Au (המכון לפרמקולוגיה של מערכות כמותיות), ד"ר דיוויד האן (אוניברסיטת אריזונה), וצוות התמיכה של ניקון (ד"ר חוזה סראנו-ולז, לארי קורדון וג'ון אקמן). אנו אסירי תודה על התמיכה האפקטיבית של כל חברי מעבדות המחקר של טאנג, יאמאגוצ'י, שארמה, או, סימן וגואן וכל חברי הצוות של מחלקת UF MAE.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05 % TrypsinCorning25-051-CI
25 cm2 flaskCorning156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeadsN/AN/A
A1R confocal systemNikon
Carbonyl Iron Powder CMBASF30042253Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640)Gibco11875093
Desktop ComputerDellwith Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZBTokai HitTIZB
Fetal bovine serum (FBS)Gibco26140
Fiji ImageJNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dishMatTekP35G-1.5-14-C
MagnetK&J Magnetics, Inc.D99-N52
Monochrome CameraFLIRBFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platformNikonsoftware platform
Nucleus mask ImageJ macrohttps://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650Biotium#40082Nuclear stain
Penicillin-streptomycinGibco15140122
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010023
Ti2-E inverted microscopeNikon
XYZ mover (CAD files)https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
  50. Berret, J. -. F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

185Cas9YAP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved