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Resumen

Este estudio presenta un nuevo protocolo para aplicar directamente fuerza mecánica en el núcleo celular a través de microperlas magnéticas entregadas en el citoplasma y para realizar imágenes fluorescentes simultáneas de células vivas.

Resumen

Una pregunta fundamental en mecanobiología es cómo las células vivas perciben los estímulos mecánicos extracelulares en el contexto de la fisiología y patología celular. Se cree que la mecano-sensación celular de los estímulos mecánicos extracelulares es a través de los receptores de membrana, el complejo proteico asociado y el citoesqueleto. Los avances recientes en mecanobiología demuestran que el núcleo celular en el citoplasma puede detectar independientemente los estímulos mecánicos simultáneamente. Sin embargo, falta una comprensión mecanicista de cómo el núcleo celular detecta, transduce y responde a los estímulos mecánicos, principalmente debido a los desafíos técnicos para acceder y cuantificar la mecánica del núcleo mediante herramientas convencionales. Este documento describe el diseño, fabricación e implementación de un nuevo actuador de fuerza magnética que aplica estímulos mecánicos 3D precisos y no invasivos para deformar directamente el núcleo celular. Utilizando células diseñadas con CRISPR / Cas9, este estudio demuestra que esta herramienta, combinada con imágenes fluorescentes confocales de alta resolución, permite la revelación de la dinámica en tiempo real de una proteína asociada a sí mecanosensible (YAP) en células individuales en función de la deformación del núcleo. Este método simple tiene el potencial de cerrar la brecha tecnológica actual en la comunidad mecanobiológica y proporcionar respuestas a la brecha de conocimiento que existe en la relación entre la mecanotransducción del núcleo y la función celular.

Introducción

Este estudio tiene como objetivo desarrollar y aplicar una nueva técnica para dilucidar la mecanobiología del núcleo mediante la combinación de los actuadores magnéticos que aplican fuerza mecánica directamente sobre el núcleo celular y la microscopía de fluorescencia confocal que simultáneamente imágenes de los cambios subcelulares estructurales y funcionales. Las células detectan señales biofísicas extracelulares, incluida la rigidez tisular 1,2,3,4, la presión del líquido intersticial y la tensión de cizallamiento 5,6,7, la topología/geometría de la superficie8,9,10,11,12 y la tensión / tensión de compresión 13,14, 15,16. Las señales biofísicas se convierten en señales bioquímicas y desencadenan posibles cambios posteriores de la expresión génica y los comportamientos celulares, un proceso conocido como mecanotransducción 17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Para estudiar los procesos de mecanotransducción, se han desarrollado una miríada de técnicas para aplicar fuerza mecánica en las células, como la microscopía de fuerza atómica28, el dispositivo de estiramiento celular29, el sensor de fuerza bio-MEMS (sistemas microelectromecánicos) 15,30,31, la reología de cizallamiento 32 y el sistema de visión estéreo 33 . Una revisión reciente resume los enfoques para aplicar señales mecánicas extracelulares e interferir con la mecanodetección34. Hasta la fecha, la mayoría de estos métodos aplican fuerza sobre la membrana plasmática celular, y las células reciben directamente estas señales biofísicas extracelulares a través de receptores de membrana como integrina, cadherina, canales iónicos y receptores acoplados a proteínas G. Posteriormente, transmiten la señal al citoesqueleto y núcleo intracelular. Por ejemplo, utilizando la translocación de proteínas asociadas a sí (YAP) como indicador de mecanodetección, se muestra que las células detectan las señales mecánicas de rigidez del sustrato y tensión extracelular de la membrana celular y las transmiten a través del citoesqueleto al núcleo para inducir la translocación de citoplasma a núcleo YAP28,35.

La evidencia reciente sugiere que el núcleo celular en sí es un mecano-sensor independiente 8,36,37. Esto es probado por experimentos realizados en el núcleo aislado cosechado de las células, donde se reveló que los núcleos cambian adaptativamente su rigidez en respuesta a la fuerza mecánica aplicada directamente sobre ellos36. Durante muchas condiciones fisiológicas, los núcleos tanto en las células tumorales como en las sanas detectan señales biofísicas extracelulares y cambian sus propiedades mecánicas y ensamblajes38,39,40. Por ejemplo, tras la extravasación, la rigidez nuclear de las células tumorales disminuye y mantiene la suavidad durante más de 24 h38. Durante la migración a través del espacio intersticial confinado, los núcleos de las células tumorales frecuentemente pierden y recuperan su integridad estructural39. Sin embargo, se desconoce la forma en que el núcleo detecta la señal biofísica, aunque se ha encontrado que varias proteínas de la envoltura nuclear y familias de proteínas están involucradas, como Lamin A / C y el complejo de enlace de nucleoesqueleto y citoesqueleto (LINC)38,41. Por lo tanto, los nuevos métodos no invasivos que pueden aplicar fuerza directamente al núcleo desacoplarán el efecto de la transmisión de fuerza desde la membrana plasmática celular y el citoesqueleto, y ayudarán a dilucidar los mecanismos moleculares previamente inaccesibles de la mecanodetección nuclear.

La investigación que empleó pinzas ópticas para manipular orgánulos42 y microperlas inyectadas en las células43 mostró la capacidad tecnológica de aplicar fuerza directamente sobre el núcleo. Sin embargo, la técnica de pinzas ópticas tiene varias limitaciones: (1) las pinzas ópticas de bajo rendimiento a menudo solo manipulan una célula o microperla a la vez; y (2) el fotodaño potencial y la deformación del artefacto de temperatura de la energía nuclear requieren decenas de pN36, y la potencia láser necesaria correspondiente es de aproximadamente 10 mW por pN44,45. Tal intensidad del láser es suficiente para desencadenar fotodaño en las células y perturbar las funciones celulares durante el experimento46.

La fuerza magnética aplicada a través de microperlas dentro de las células vivas muestra el potencial de aplicar fuerza directamente sobre el núcleo y supera las limitaciones de las pinzas ópticas. Una vez que las microperlas se entregan en el citoplasma, un campo magnético puede ejercer una fuerza magnética sobre múltiples microperlas simultáneamente de una manera de alto rendimiento. El campo magnético no influye en las funciones celulares47, pero genera fuerza de pN a nN, que es suficiente para inducir la deformación nuclear 36,48,49. Hasta la fecha, la manipulación de microperlas magnéticas se ha aplicado en la membrana plasmática celular48, dentro del citoplasma50, en la actina F51, dentro del núcleo47 y en el núcleo aislado36. Sin embargo, la manipulación magnética de microperlas nunca se ha utilizado para aplicar fuerza mecánica directa sobre la envoltura nuclear para estudiar la mecanotransducción en el núcleo.

En este documento, se desarrolla una técnica simple para administrar microperlas magnéticas de forma no invasiva en el citoplasma y utilizar estas microperlas para aplicar fuerza mecánica sobre el núcleo (Figura 1). Aquí, se utilizan líneas celulares B2B normales humanas diseñadas por CRISPR / Cas9 que expresan endógenamente YAP marcado con mNeonGreen21-10 / 11 para validar el método. YAP es una proteína mecanosensible, y la translocación de YAP está regulada por la mecanodetección nuclear 14,28. Se eligió el enfoque knock-in regulado por CRISPR/Cas9 para marcar YAP endógeno con una proteína fluorescente (FP) mNeonGreen21-10/11. Aunque se sabe que la edición CRISPR tiene una eficiencia incompleta y un efecto fuera del objetivo, los protocolos en publicaciones anteriores integraron la clasificación de fluorescencia para seleccionar la inserción correcta del marco de lectura abierto52,53,54. Con esta capa adicional de selección, no se observó ningún evento de etiquetado fuera del objetivo en 20+ líneas celulares generadas previamente52,53,54,55. Esta es una construcción de proteína fluorescente dividida, pero en principio, cualquier etiqueta fluorescente expresable podría ser utilizable. Este enfoque de etiquetado es superior a los métodos transgénicos o de anticuerpos. Primero, a diferencia de la expresión transgénica, la proteína marcada mantiene la dosis del gen de copia única y se expresa en el contexto fisiológico de la red reguladora de genes nativos, limitando las desviaciones en la concentración, localización e interacción de proteínas. El método de etiquetado utilizado en este estudio logra un rendimiento y una eficiencia más altos en un orden de magnitud que el etiquetado FP completo. También evita los desafíos asociados con la inmunofluorescencia debido a los artefactos de fijación y la disponibilidad limitada de anticuerpos de alta calidad y alta especificidad. En segundo lugar, el enfoque utilizado en este documento hace una perturbación mínima a la fisiología celular y permite la revelación en tiempo real de todos los YAP endógenos auténticamente. En contraste, otros métodos transgénicos comunes a menudo conducen a la sobreexpresión de YAP. La distribución artificial resultante puede potencialmente causar citotoxicidad y afectar la mecanodetección de las células56,57,58.

Este estudio presenta un protocolo para aplicar fuerza directamente sobre el núcleo a través de microperlas magnéticas entregadas en el citoplasma y para realizar imágenes fluorescentes simultáneas de células vivas. En resumen, los protocolos presentados aquí demuestran cómo (1) entregar microperlas magnéticas en la célula mientras está fuera del núcleo, (2) manipular las microperlas para aplicar fuerza magnética en el núcleo, (3) realizar imágenes fluorescentes confocales de las células durante la manipulación, y (4) analizar cuantitativamente la relación nuclear / citoplasma (N / C) de YAP durante todo el proceso de aplicación de fuerza. Los resultados sugieren que (1) a través de endocitosis, las microperlas magnéticas pueden administrarse de forma no invasiva en el citoplasma de las células B2B dentro de las 7 h (Figura 2 y Figura 3); y (2) la fuerza magnética cuantificada aplicada directamente sobre el núcleo (Figura 4, Figura 5 y Figura 6) por sí sola puede desencadenar diversos cambios en la relación YAP N/C en células B2B diseñadas con CRISPR / Cas9 (Figura 7 y Figura 8).

Protocolo

1. Mantenimiento de células B2B diseñadas con CRISPR/Cas9

  1. Cultivo de células B2B en un matraz T25 con RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina.
  2. Mantener las células B2B en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% deCO2.
  3. Subcultivo de las células B2B cuando la confluencia alcanza el 70% al 80%.
  4. Almacene la línea celular B2B en medio de cultivo RPMI-1640 con DMSO al 10% (v/v) en un congelador de -80 °C.
  5. Utilice las celdas B2B con un número de pasaje inferior a 10 en los experimentos.

2. Cultivo celular

  1. Siembra las células en una placa de Petri con fondo de vidrio.
    1. Mueva el matraz que contiene células B2B dentro de la incubadora al gabinete de bioseguridad.
    2. Retirar el medio de cultivo del matraz con una pipeta aspiradora con una bomba de vacío conectada.
    3. Lavar el matraz con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    4. Retire PBS con la pipeta aspiradora.
    5. Añadir 0,5 ml de solución de tripsina al 0,05% para desprender las células del fondo del sustrato del matraz.
    6. Coloque el matraz en la incubadora durante 5 minutos.
    7. Mover el matraz al armario de bioseguridad. Añadir 5 ml de nuevo medio de cultivo en el matraz y pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo.
    8. Depositar 50 μL del medio con células (300 células/μL) en la placa de Petri con fondo de vidrio. Añadir 2 ml de medio de cultivo en la placa de Petri.
    9. Coloque la placa de Petri en la incubadora. Espere 12 h para que las celdas se unan.
  2. Cultive las células con microperlas magnéticas.
    1. Pesar 0,2 g de microperlas de hierro carbonilo de diámetro medio de 7 μm (en lo sucesivo denominadas microperlas de hierro carbonilo de 7 μm, véase la Tabla de materiales).
    2. Utilice una pipeta para suspender las microperlas en 1 ml de medio de cultivo RPMI-1640.
    3. Lleve la placa de Petri con células B2B al gabinete de bioseguridad.
    4. Añadir 200 μL del medio que contiene microperlas en la placa de Petri.
      NOTA: Agregue el medio rápidamente para evitar la precipitación de las microperlas.
    5. Vuelva a colocar la placa de Petri en la incubadora hasta que las microperlas sean internalizadas por las células. Verifique la internalización cada 6 h para determinar el momento óptimo para la internalización para diferentes líneas celulares.
    6. Para verificar la internalización, realice imágenes de fluorescencia confocal para visualizar el límite microperla, nuclear y celular. Si la microperla es internalizada por la célula, estará dentro del límite celular.

3. Visualización del núcleo

  1. Calentar 1,5 ml del medio de cultivo en la incubadora durante 15 min.
  2. Apague la luz del gabinete de bioseguridad. Lleve la placa de Petri que contiene la célula, el medio de cultivo calentado, la tinción nuclear y el HCl verapamilo en el gabinete de bioseguridad.
    NOTA: Los componentes de tinción nuclear son sensibles a la luz. Evite la exposición a la luz durante la operación.
  3. Diluir la tinción nuclear 1000x por DMSO a 100x.
  4. Diluir 100 mM de verapamilo HCl por DMSO a 10 mM.
  5. Añadir 15 μL de tinción nuclear 100x y 15 μL de HCl verapamilo 10 mM a 1,5 mL de medio de cultivo. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  6. Retire el medio de cultivo de la placa de Petri. Añadir el medio de cultivo que contiene tinción nuclear en la placa de Petri.
  7. Vuelva a colocar las células en la incubadora durante más de 2 h.

4. Preparación del hardware de aplicación de fuerza magnética

  1. Imprima en 3D todas las piezas utilizando acrilonitrilo butadieno estireno (ABS) y móntelas siguiendo el diseño CAD (Figura 1A). El diseño CAD se incluye en la Tabla de materiales.
  2. Use cinta adhesiva de doble cara para fijar el imán al dispositivo que mueve el imán (Figura 1A).
  3. Coloque el dispositivo de movimiento magnético junto a la etapa del microscopio. Utilice las tres perillas para ajustar la ubicación espacial del imán hasta que pueda moverse por encima de la placa de Petri entre 13 mm y 120 mm.
    NOTA: Asegúrese de que el límite superior de la distancia entre el imán y la placa de Petri sea lo más grande posible para evitar la aplicación de fuerza no deseada en las microperlas magnéticas. 120 mm es el valor máximo en esta configuración experimental. Asegúrese de que el imán no interfiera con las piezas del microscopio, incluidos los objetivos y las etapas motorizadas.
  4. Coloque el imán en la posición z más alta (a 120 mm).

5. Aplicación forzada e imágenes de células vivas

  1. Configuración de la cámara ambiental para obtener imágenes a largo plazo
    1. Aplique una solución de etanol al 75% para esterilizar y limpiar completamente la cámara ambiental.
    2. Coloque la cámara ambiental en la etapa motorizada del microscopio invertido.
    3. Abra el tanque deCO2 y ajuste el caudal de entrada de CO2 a 160 ml / min.
    4. Ajuste la temperatura de la cámara a 44 °C (arriba), 42 °C (baño) y 40 °C (etapa).
    5. Agregue 20 ml de agua purificada en el baño de la cámara ambiental para mantener el 90% de humedad.
    6. Saque la placa de Petri con fondo de vidrio que contiene células diana de la incubadora de cultivo de tejidos y colóquela en la cámara.
    7. Aplique la abrazadera metálica de la cámara ambiental para fijar la posición de la placa de Petri.
      NOTA: La placa de Petri debe sujetarse firmemente en la cámara porque la fuerza magnética puede mover la placa si no se sujeta.
    8. Cierre la tapa de la cámara.
  2. Optimización de los parámetros de imagen
    1. Optimice el tamaño del agujero de alfiler: el agujero de alfiler bloquea los fotones desenfocados. Un tamaño de agujero de alfiler más grande produce más fotones desenfocados pero una imagen más brillante. Un tamaño estenopeico más pequeño produce una imagen más enfocada y tenue. Asegúrese de optimizar el tamaño del agujero de alfiler para obtener imágenes confocales enfocadas con la relación señal-ruido adecuada.
    2. Optimizar la intensidad del láser: La intensidad del láser determina la intensidad de la excitación y, por lo tanto, la luz de emisión. La baja intensidad del láser proporciona una baja relación señal-ruido. Una intensidad láser demasiado alta causará fotoblanqueo. Ajuste la intensidad del láser en consecuencia.
    3. Optimizar el tamaño del paso y los pasos: Los pasos y el tamaño del paso determinan cuántas imágenes se tomarán en una pila Z. Los tamaños de paso más pequeños y más pasos aumentarán la resolución de la pila Z, pero también aumentarán el fotoblanqueo. En este experimento, se utilizó un tamaño de paso de 1 μm para las células con ~ 15 μm de altura celular.
    4. Optimice el tiempo de exposición: El tiempo de exposición determina cuánto tiempo estará expuesta la célula al láser de excitación. Un tiempo de exposición bajo disminuirá la relación señal-ruido. Un tiempo de exposición alto causará fotoblanqueo. En este experimento se utilizó un tiempo de exposición de 1 fotograma por 4 s.
    5. Optimización de los parámetros de imagen: cambie uno de los cuatro parámetros de forma iterativa y mantenga la coherencia de los demás parámetros. Cada vez, mida la relación YAP N/C de cada imagen y compare el cambio en la relación YAP N/C para determinar el nivel de fotoblanqueo. Repita el proceso de optimización hasta lograr un equilibrio entre la relación señal-ruido, la velocidad de imagen y el fotoblanqueo.
    6. Defina las configuraciones de imágenes utilizando los parámetros de imagen optimizados para una configuración de imágenes más rápida durante los experimentos.
      NOTA: Las configuraciones utilizadas en este estudio se describen en la sección 5.3 de parámetros de imagen. Para optimizar los parámetros de imagen de las configuraciones de la sección 5.3, utilice el mismo método que en el paso 5.2.5.
  3. Aplicación de fuerza pequeña e imágenes confocales
    NOTA: El microscopio Nikon Ti2-E se utilizó para obtener imágenes en este estudio, y los pasos detallados para la adquisición de imágenes se dan a continuación.
    1. Abra el microscopio invertido. Abra la aplicación de software Elements.
    2. Defina la magnetic_find de configuración. Compruebe solo el canal FIFC. Ajuste PMT HV = 70, Offset = 0, Intensidad del láser = 10. Establezca la velocidad de escaneo en 1 fotograma por 2 s haciendo clic en el botón 1/2 . Establezca el tamaño estenopeico en 1,2 UA haciendo clic en el botón 1,2 UA. Esta configuración se utilizará en el paso 5.3.5.
    3. Defina la magnetic_YAP_Nucleus de configuración. Consulta el canal FIFC. Ajuste PMT HV = 70, Offset = 0, Intensidad del láser = 10. Establezca la velocidad de escaneo en 1 fotograma por 4 s haciendo clic en el botón 1/2 . Establezca el tamaño estenopeico en 1,2 UA haciendo clic en el botón 1,2 UA. Para obtener imágenes del límite del núcleo y la intensidad de la tinción nuclear, compruebe el canal Cy5. Ajuste PMT HV = 70, Offset = 0, Intensidad del láser = 10. El tamaño estenopeico está optimizado para imágenes YAP 3D. No vuelva a hacer clic en el botón 1.2 A.U . después de verificar el canal Cy5. Esta configuración se utilizará en el paso 5.3.7.
    4. Active DIA a través de Elements si es necesario. Abra SpinView, use un campo brillante y ajuste el enfoque del objeto para obtener una imagen clara de las celdas. Use un objetivo de 10x para encontrar múltiples células individuales apropiadas en tres condiciones: con una sola microperla dentro, con múltiples microperlas dentro y sin ninguna microperla dentro. Cambie a un objetivo 40x. Asigne a esta posición el número de posición apropiado.
    5. Elementos abiertos. Haga clic en magnetic_find. Haga clic en el botón Eliminar bloqueo.
    6. Haga clic en Escanear y ajuste la posición Z del plano focal. Haga clic en los botones superior e inferior para establecer el límite inferior y superior de la pila Z de las celdas seleccionadas. Detenga el escaneo haciendo clic en Escanear nuevamente.
    7. Cambie a magnetic_YAP_Nucleus configuración. Establezca el nombre de archivo como before_small_force.nd2. Haga clic en el botón Ejecutar con la pila Z grabada.
    8. Cambie a la ruta de luz derecha y encienda DIA. Abra SpinView y haga clic en el botón Grabación . Mientras tanto, gire la perilla del dispositivo de movimiento magnético para mover el imán hacia abajo a 46 mm por encima del fondo de la placa de Petri. Guarde secuencias de imágenes o videos de campo brillante. Mira el video para confirmar que las microperlas muestran el desplazamiento inducido por la fuerza magnética.
    9. Repita los pasos 5.3.5-5.3.7; Establezca el nombre de archivo en after_small_force.nd2.
    10. Cambie a la ruta de luz derecha y encienda DIA. A continuación, abra SpinView y haga clic en el botón Grabación . Mientras tanto, gire la perilla del dispositivo de movimiento magnético para mover el imán hasta 120 mm por encima del fondo de la placa de Petri. Guarde secuencias de imágenes o videos de campo brillante.
    11. Repita los pasos 5.3.5-5.3.7 y establezca el nombre de archivo en before_large_force.nd2.
  4. Aplicación de gran fuerza e imágenes confocales
    1. Retire la tapa de la cámara ambiental para permitir que el imán alcance 13 mm por encima del fondo de la placa de Petri.
    2. Cambie a la ruta de luz derecha y encienda DIA. Abra SpinView y haga clic en el botón Grabación . Mientras tanto, gire la perilla del dispositivo de movimiento magnético para mover el imán hacia abajo a 13 mm por encima del fondo de la placa de Petri. Guarde secuencias de imágenes o videos de campo brillante. Mira el video para confirmar que las microperlas muestran el desplazamiento inducido por la fuerza magnética.
    3. Repita los pasos 5.3.5-5.3.7 y establezca el nombre de archivo en after_large_force.nd2.
    4. Cambie a la ruta de luz derecha y encienda DIA. A continuación, abra SpinView y haga clic en el botón Grabación . Mientras tanto, gire la perilla del dispositivo de movimiento magnético para mover el imán hasta 120 mm por encima del fondo de la placa de Petri. Guarde secuencias de imágenes o videos de campo brillante.
    5. Repita los pasos 5.3.5-5.3.7; Establezca el nombre de archivo en retract_large_force.nd2.
    6. Cierre la tapa de la cámara ambiental.
  5. Repita los pasos 5.2 y 5.3 para varios campos de visión para obtener más datos si es necesario.

6. Procesamiento de imágenes y análisis de datos

  1. Cuantificación de la relación YAP N/C
    1. Abra Fiji ImageJ. Abra las imágenes .nd2 tomadas en el paso 5.
    2. Haga clic en Analizar > establecer medidas. Área de verificación, densidad integrada, valor gris medio y descriptores de forma.
    3. Utilice el canal Cy5 para identificar el núcleo. Haga clic en Selecciones a mano alzada para utilizar la herramienta de selección libre para delinear el núcleo. Además, compruebe la macro de máscara nuclear automática en ImageJ (consulte la Tabla de materiales).
    4. Haga clic en Analizar > medir en el canal FIFC. El valor medido de la media es la intensidad nuclear promedio de YAP DN.
    5. Utilice el canal Cy5 para identificar el núcleo. Utilice el canal FITC para identificar la célula. Haga clic en Selecciones a mano alzada para utilizar la herramienta de selección libre para seleccionar una región de interés dentro del citoplasma y evitar la microperla magnética. Esta región de interés no debe incluir el núcleo.
    6. Haga clic en Analizar > medir en el canal FIFC. El valor medido de la media es la intensidad YAP citoplasmática media DC.
    7. Calcule la relación YAP N/C = D N / DC.
  2. Cuantificación de la forma nuclear y la intensidad normalizada de la tinción nuclear
    1. Abra Fiji ImageJ. Abra las imágenes .nd2 tomadas en el paso 5.
    2. Haga clic en Analizar > establecer medidas. Área de verificación, densidad integrada, valor gris medio y descriptores de forma.
    3. Utilice el canal Cy5 para identificar el núcleo. Haga clic en Selecciones a mano alzada para utilizar la herramienta de selección libre para delinear el núcleo.
    4. Haga clic en Analizar > medir en el canal Cy5. El valor medido de la media es la intensidad de la tinción nuclear. El valor medido de Circ. es circularidad nuclear.
    5. Para comparar la intensidad de la tinción nuclear en un estado de fuerza diferente, toda la intensidad de la tinción nuclear se divide por la intensidad de la tinción nuclear en "before_small_force.nd2" para generar la intensidad de la tinción nuclear normalizada.

Resultados

Diseño de un dispositivo de movimiento magnético y aplicación de fuerza magnética
Para aplicar fuerza sobre el núcleo a través de las microperlas magnéticas, se diseñó y construyó un dispositivo de movimiento magnético para controlar la posición espacial del imán. El dispositivo de movimiento magnético contiene un marco central, tres perillas y rieles para mover el imán conectado en direcciones x, y y z de forma independiente a la resolución espacial de 1,59 mm por ciclo (

Discusión

La internalización de microperlas magnéticas (sección 2.2) es crítica porque las microperlas extracelulares no pueden aplicar fuerza directamente al núcleo. La aplicación de fuerza y la obtención de imágenes (sección 5.3) son pasos críticos en este experimento, y la fuerza necesaria para deformar el núcleo e inducir consecuencias biológicas significativas podría depender de la muestra. La magnitud de la fuerza en este experimento (0,8 nN y 1,4 nN) se puede aumentar aún más para desencadenar la detección d...

Divulgaciones

No hay conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este proyecto está financiado por UF Gatorade Award Start-up Package (X. T.), el UFHCC Pilot Award (X. T. y el Dr. Dietmar Siemann), UF Opportunity Seed Fund (X. T.) y UFHCC University Scholars Program (H. Y. Wang). Agradecemos sinceramente las discusiones intelectuales y el apoyo técnico del Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Christopher Vulpe (UFHCC), Dr. Blanka Sharma (BME), Dr. Mark Sheplak (MAE y ECE), Dr. Daniel Ferris (BME), Dra. Malisa Sarntinoranont (MAE), Dr. Ashok Kumar (MAE), Dr. Benjamin Keselowsky (BME), Dr. Brent Gila (RSC), Dr. Philip Feng (ECE), Dr. Gregory A. Hudalla (BME), Dr. Steven Ghivizzani (OSSM), Dr. Yenisel Cruz-Almeida (CDBS), Dr. Roger Fillingim (CD-BS), Dr. Robert Caudle (OMS), Dr. John Neubert (DN-OR), Dr. Justin Hiliard (Neurocirugía), Dr. Tian He (Universidad de Harvard), Dr. Youhua Tan (Universidad Politécnica de Hong Kong), Dr. Jessie L-S Au (Instituto de Farmacología de Sistemas Cuantitativos), Dr. David Hahn (Universidad de Arizona), y el equipo de soporte de Nikon (Drs. José Serrano-Vélez, Larry Kordon y Jon Ekman). Estamos profundamente agradecidos por el apoyo efectivo de todos los miembros de los laboratorios de investigación de Tang, Yamaguchi, Sharma, Au, Siemann y Guan y todos los miembros del personal del Departamento MAE de UF.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05 % TrypsinCorning25-051-CI
25 cm2 flaskCorning156340
7-µm mean diameter carbonyl iron microbeadsN/AN/A
A1R confocal systemNikon
Carbonyl Iron Powder CMBASF30042253Magnetic microbead
Culture medium (RPMI-1640)Gibco11875093
Desktop ComputerDellwith Windows 10 operating system
Environmental chamber TIZBTokai HitTIZB
Fetal bovine serum (FBS)Gibco26140
Fiji ImageJNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Glass-bottom petri dishMatTekP35G-1.5-14-C
MagnetK&J Magnetics, Inc.D99-N52
Monochrome CameraFLIRBFS-U3-70S7M-C
NIS-Elements software platformNikonsoftware platform
Nucleus mask ImageJ macrohttps://github.com/KOLIUG/Nuclear mask
NucSpot Live 650Biotium#40082Nuclear stain
Penicillin-streptomycinGibco15140122
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco10010023
Ti2-E inverted microscopeNikon
XYZ mover (CAD files)https://github.com/KOLIUG/XYZ-mover

Referencias

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  2. Janmey, P. A., Fletcher, D. A., Reinhart-King, C. A. Stiffness sensing by cells. Physiological Reviews. 100 (2), 695-724 (2020).
  3. Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 95 (4), 1261-1269 (2020).
  4. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  5. Hofmann, M., et al. Lowering of tumor interstitial fluid pressure reduces tumor cell proliferation in a xenograft tumor model. Neoplasia. 8 (2), 89-95 (2006).
  6. Yankaskas, C. L., et al. The fluid shear stress sensor TRPM7 regulates tumor cell intravasation. Science Advances. 7 (28), (2021).
  7. Kim, E., et al. A biosynthetic hybrid spidroin-amyloid-mussel foot protein for underwater adhesion on diverse surfaces. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (41), 48457-48468 (2021).
  8. Tajik, A., et al. Transcription upregulation via force-induced direct stretching of chromatin. Nature Materials. 15 (12), 1287-1296 (2016).
  9. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow. Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).
  10. Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation. Biomaterials. 69, 174-183 (2015).
  11. Ren, B., et al. Study of sacrificial ink-assisted embedded printing for 3D perfusable channel creation for biomedical applications. Applied Physics Reviews. 9 (1), 011408 (2022).
  12. Coyle, S., et al. Cell alignment modulated by surface nano-topography-Roles of cell-matrix and cell-cell interactions. Acta Biomaterialia. 142, 149-159 (2022).
  13. Sawada, Y., et al. Force sensing by mechanical extension of the Src family kinase substrate p130Cas. Cell. 127 (5), 1015-1026 (2006).
  14. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  15. Tang, X., et al. Specific and non-specific adhesion in cancer cells with various metastatic potentials. Mechanobiology of Cell-Cell and Cell-Matrix Interactions. , 105-122 (2011).
  16. Tang, X., Saif, T. A. Adhesivity of colon cancer cells during in vitro metastasis. International Journal of Applied Mechanics. 5 (03), 1350025 (2013).
  17. Chaudhuri, O., et al. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  18. Ohashi, K., Fujiwara, S., Mizuno, K. Roles of the cytoskeleton, cell adhesion and rho signalling in mechanosensing and mechanotransduction. The Journal of Biochemistry. 161 (3), 245-254 (2017).
  19. Hamill, O. P., Martinac, B. Molecular basis of mechanotransduction in living cells. Physiological Reviews. 81 (2), 685-740 (2001).
  20. Liang, C., et al. Towards an integrative understanding of cancer mechanobiology: Calcium, YAP, and microRNA under biophysical Forces. Soft Matter. 18, 1112-1148 (2022).
  21. Tan, Y., et al. Matrix softness regulates plasticity of tumour-repopulating cells via H3K9 demethylation and Sox2 expression. Nature Communications. 5 (1), 1-12 (2014).
  22. Poh, Y., et al. Dynamic force-induced direct dissociation of protein complexes in a nuclear body in living cells. Nature Communications. 3 (1), 1-10 (2012).
  23. Tang, X., et al. A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential. Molecular Cancer. 13 (1), 1-15 (2014).
  24. Wu, J., et al. Effects of dynein on microtubule mechanics and centrosome positioning. Molecular Biology of the Cell. 22 (24), 4834-4841 (2011).
  25. Tang, X., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 7197-7206 (2011).
  26. Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. How far cardiac cells can see each other mechanically. Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).
  27. Tang, X., et al. Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells. Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).
  28. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171 (6), 1397-1410 (2017).
  29. Gudipaty, S. A., et al. Mechanical stretch triggers rapid epithelial cell division through Piezo1. Nature. 543 (7643), 118-121 (2017).
  30. Tang, X., et al. Attenuation of cell mechanosensitivity in colon cancer cells during in vitro metastasis. PLoS One. 7 (11), 50443 (2012).
  31. Cha, C., et al. Top-down synthesis of versatile polyaspartamide linkers for single-step protein conjugation to materials. Bioconjugate Chemistry. 22 (12), 2377-2382 (2012).
  32. Chen, X., et al. Glycosaminoglycans modulate long-range mechanical communication between cells in collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (15), (2022).
  33. Boyle, J. J., Pless, R. B., Thomopoulos, S., Genin, G. M. Direct estimation of surface strain fields from a stereo vision system. Journal of Biomechanical Engineering. 142 (7), 074503 (2020).
  34. Kim, S., Uroz, M., Bays, J. L., Chen, C. S. Harnessing mechanobiology for tissue engineering. Developmental Cell. 56 (2), 180-191 (2021).
  35. Driscoll, T. P., et al. Cytoskeletal to nuclear strain transfer regulates YAP signaling in mesenchymal stem cells. Biophysical Journal. 108 (12), 2783-2793 (2015).
  36. Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature Cell Biology. 16 (4), 376-381 (2014).
  37. Vashisth, M. Scaling concepts in 'omics: Nuclear lamin-B scales with tumor growth and often predicts poor prognosis, unlike fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (48), (2021).
  38. Roberts, A. B., et al. Tumor cell nuclei soften during transendothelial migration. Journal of Biomechanics. 121, 110400 (2021).
  39. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  40. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  41. Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. The Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
  42. Shelby, J., Patrick, J., Edgar, S., Chiu, D. T. Monitoring cell survival after extraction of a single subcellular organelle using optical trapping and pulsed-nitrogen laser ablation. Photochemistry and Photobiology. 81 (4), 994-1001 (2005).
  43. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Diffusion and directed motion in cellular transport. Physical Review E. 66 (1), 011916 (2002).
  44. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23 (1), 247-285 (1994).
  45. Rohrbach, A. Stiffness of optical traps: quantitative agreement between experiment and electromagnetic theory. Physical Review Letters. 95 (16), 168102 (2005).
  46. Neuman, K. C., et al. Characterization of photodamage to Escherichia coli in optical traps. Biophysical Journal. 77 (5), 2856-2863 (1999).
  47. Kanger, J. S., Subramaniam, V., Driel, R. V. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic microbeads. Chromosome Research. 16 (3), 511-522 (2008).
  48. Bausch, A. R., et al. Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic microbead microrheometry. Biophysical Journal. 75 (4), 2038-2049 (1998).
  49. Fisher, J. K., et al. Three-dimensional force microscope: a nanometric optical tracking and magnetic manipulation system for the biomedical sciences. Review of Scientific Instruments. 76 (5), 053711 (2005).
  50. Berret, J. -. F. Local viscoelasticity of living cells measured by rotational magnetic spectroscopy. Nature Communications. 7, 10134 (2016).
  51. Hu, B., Dobson, J., El Haj, A. J. Control of smooth muscle α-actin (SMA) up-regulation in HBMSCs using remote magnetic microbead mechano-activation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (1), 45-55 (2014).
  52. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
  53. Feng, S., et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications. 8, 370 (2017).
  54. Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3501-3508 (2016).
  55. Tulpule, A., et al. Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules. Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).
  56. Ansari, A. M., et al. Cellular GFP toxicity and immunogenicity: potential confounders in in vivo cell tracking experiments. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (5), 553-559 (2016).
  57. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  58. Ratz, M., et al. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592 (2015).
  59. Suzuki, H., Ho, C., Kasagi, N. A chaotic mixer for magnetic microbead-based micro cell sorter. Journal of Microelectromechanical Systems. 13 (5), 779-790 (2004).
  60. Luo, Q., et al. All-optical mechanobiology interrogation of yes-associated protein in human cancer and normal cells using a multi-functional system. Journal of Visualized Experiments. (178), e62934 (2021).
  61. Koushki, N., et al. Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP. BioRxiv. , (2020).

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