JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول كيفية توليد الخلايا العضلية بالضربة القاضية باستخدام CRISPR / Cas9 ، بدءا من تصميم الحمض النووي الريبي الموجه إلى الاستنساخ الخلوي وتوصيف النسخ القاضية.

Abstract

أحد التطبيقات المهمة للتكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بين المسافات (CRISPR) / Cas 9 هو تطوير خطوط الخلايا القاضية ، وتحديدا لدراسة وظيفة الجينات / البروتينات الجديدة المرتبطة بالمرض ، والتي تم تحديدها أثناء التشخيص الجيني. لتطوير مثل هذه الخطوط الخلوية ، يجب فك تشابك قضيتين رئيسيتين: إدخال أدوات كريسبر (Cas9 والحمض النووي الريبي الدليلي) بكفاءة عالية في الخلايا المختارة ، وتقييد نشاط Cas9 على الحذف المحدد للجين المختار. البروتوكول الموصوف هنا مخصص لإدخال أدوات كريسبر في الخلايا التي يصعب نقلها، مثل الخلايا العضلية. ويستند هذا البروتوكول إلى استخدام فيروسات lentiviruses، التي يتم إنتاجها باستخدام البلازميدات المتاحة للجمهور، والتي يتم وصف جميع خطوات الاستنساخ الخاصة بها لاستهداف جين ذي أهمية. تم إجراء التحكم في نشاط Cas9 باستخدام تكييف لنظام موصوف سابقا يسمى KamiCas9 ، حيث يسمح نقل الخلايا باستخدام فيروس lentivirus بتشفير الحمض النووي الريبي الإرشادي الذي يستهدف Cas9 بالإلغاء التدريجي لتعبير Cas9. تم تطبيق هذا البروتوكول على تطوير خط خلايا العضلات البشرية RYR1-knock ، والذي تم تمييزه بشكل أكبر على المستوى البروتيني والوظيفي ، لتأكيد خروج قناة الكالسيوم المهمة هذه المشاركة في إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا في العضلات وفي اقتران الإثارة والانكماش. يمكن بسهولة تطبيق الإجراء الموصوف هنا على جينات أخرى في خلايا العضلات أو في خلايا أخرى يصعب نقلها وإنتاج أدوات قيمة لدراسة هذه الجينات في الخلايا البشرية.

Introduction

مع تقدم تسلسل الجينات وتحديد الطفرات في الجينات ذات الوظائف غير المعروفة في نسيج معين ، فإن تطوير النماذج الخلوية ذات الصلة لفهم وظيفة الجين المستهدف الجديد وتأكيد مشاركته في الآليات الفسيولوجية المرضية ذات الصلة يشكل أداة أساسية. بالإضافة إلى ذلك ، هذه النماذج ذات أهمية كبيرة للتطورات العلاجية المستقبلية 1,2 ، وتشكل بديلا مثيرا للاهتمام لتطوير نماذج حيوانية بالضربة القاضية بما يتماشى بشكل مستقيم مع التوصيات الدولية للحد من استخدام الحيوانات في التجريب. يعد تحرير الجينات باستخدام CRISPR / Cas9 من بين أقوى الأدوات المتاحة حاليا ، مما سمح بتطوير العديد من نماذج الضربة القاضية / الضربة القاضية ، والتحقق من صحة الجينات المستهدفة باستخدام CRISPR / Cas9 هو من بين التطبيقات الأكثر استخداما على نطاق واسع ل CRISPR / Cas93. يعتمد نجاح تحرير الجينات على القدرة على إدخال أدوات كريسبر (الحمض النووي الريبي الإرشادي و nuclease Cas9) في نموذج الخلية المستهدفة ، والتي يمكن أن تشكل تحديا في العديد من الخلايا التي يصعب نقلها ، مثل خلايا العضلات4. يمكن التغلب على هذا التحدي باستخدام الفيروس ، وعادة ما يكون الفيروس lentivirus ، والذي يتمتع بميزة كبيرة لنقل العديد من أنواع الخلايا بكفاءة وتقديم الجينات المحورة. لكن عيبه الرئيسي هو دمج الجين المتحول في جينوم الخلية المضيفة ، مما يؤدي إلى تغيير محتمل في الجينات الموضعية في موقع التكامل وإلى التعبير الدائم عن الجين المتحول ، والذي في حالة nuclease Cas9 سيؤدي إلى عواقب وخيمة5. تم اقتراح حل ذكي من قبل Merienne وزملاؤه6 ، والذي يتكون من إدخال الحمض النووي الريبي الإرشادي في الخلايا الذي يستهدف جين Cas9 نفسه ، مما يؤدي إلى تعطيل Cas9. يتم تقديم تكييف لهذه الاستراتيجية هنا كبروتوكول سهل الاستخدام ومتعدد الاستخدامات يسمح بضرب أي جين تقريبا في الخلايا التي يصعب نقلها.

الهدف من البروتوكول المقدم هنا هو الحث على تعطيل جين ذي أهمية في خلايا العضلات الخالدة. يمكن استخدامه للقضاء على أي جين ذي أهمية ، في أنواع مختلفة من الخلايا الخالدة. يحتوي البروتوكول الموصوف هنا على خطوات لتصميم الحمض النووي الريبي الإرشادي واستنساخها إلى بلازميدات فيروسية ، لإنتاج أدوات كريسبر في ناقلات الفيروسات اللينتيفيروسية ، لتحويل الخلايا باستخدام فيروسات لينتيفيروسات مختلفة ، واستنساخ الخلايا لإنتاج خط خلوي محرر متجانس.

باستخدام هذا البروتوكول ، تم تطوير خلايا العضلات الهيكلية البشرية المخلدة مع حذف مستقبلات الريانودين من النوع الأول (RyR1) ، وهي قناة كالسيوم أساسية تشارك في إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا وتقلص العضلات7. تم تأكيد خروج الضربة القاضية (KO) للجين على مستوى البروتين باستخدام اللطخة الغربية ، وعلى المستوى الوظيفي باستخدام تصوير الكالسيوم.

Protocol

تم الحصول على خزعات العضلات من بنك الأنسجة للبحوث (Myobank ، وهو شريك في شبكة الاتحاد الأوروبي EuroBioBank ، باريس ، فرنسا) وفقا للتوصيات الأوروبية والتشريعات الفرنسية. وتم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع الأفراد. تم إنتاج الأرومات العضلية المخلدة من قبل الدكتور V. Mouly (معهد علم الفطريات ، باريس ، فرنسا) ، وتمت الموافقة على البروتوكولات من قبل لجنة أخلاقيات معهد علم الميولوجيا (MESRI ، n AC-2019-3502).

1. تصميم دليل كريسبر

  1. تحديد منطقة الجين المراد حذفه. ابحث عن تسلسلها الجينومي باستخدام أدوات متصفح الجينوم مثل ensembl.org أو genome.ucsc.edu وحدد الإحداثيات الكروموسومية للمنطقتين للبحث عن دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) ، على جانبي المنطقة المراد حذفه.
    1. بالنسبة للجين المستخدم هنا ، احصل على تسلسل FASTA لجين RYR1 وتسلسل exon 101 على النحو التالي. في المجموعة ، ابحث عن RYR1 في أحدث إصدار من الجينوم البشري ، وحدد الإدخال الأول ، وانقر فوق نص تسلسل ترميز البروتين. ثم انقر فوق Exons لإعادة التوجيه إلى قائمة exons للجين.
    2. انقر فوق تنزيل التسلسل وحدد التسلسل الجينومي فقط لتنزيل تسلسل الإجماع الكامل للجين بأكمله. قم بالتمرير لأسفل قائمة الإكسونات والإنترونات الخاصة بالجين وحدد الشخص (الأشخاص) المستهدف.
    3. أوجد تسلسل النيوكليوتيدات المقابل في الجين. حدد تسلسلات النيوكليوتيدات للإنترونات مباشرة في المنبع والمصب من exon ليتم حذفها ، والتي سيتم استخدامها للبحث عن gRNAs.
  2. صمم اثنين من gRNA ، يسمى الدليل 1 والدليل 2 هنا ، في المناطق المحددة في الخطوة 1.1 (الإنترونات في المنبع والمصب في المنطقة المراد حذفها) باستخدام أدوات عبر الإنترنت مثل Crispor.tefor.net8. اختر اثنين من gRNAs مفصولة ببضع مئات من أزواج القاعدة (bp) ، وتسلسل كل gRNA هو بالضبط 20 نيوكليوتيدات طويلة دون الشكل المجاور للفاصل الأولي (PAM). اختر أفضل الأدلة المتاحة من أجل الحد من الخروج عن الهدف. انظر الشكل 1 للحصول على مثال على تصميم الدليل.
    1. من المتوقع حذف التسلسل بين الدليلين ، ويؤدي إلى خروج الجين محل الاهتمام ، وبالتالي اختيار موضع الدليلين بحيث يحذف تسلسلا أساسيا أو إكسون أساسيا في الجين محل الاهتمام. تأكد من أن التسلسل المحذوف / exon غير موجود حصريا في نسخة بديلة من الجين و / أو أنه يشفر جزءا مهما من البروتين ، وبالتالي فإن حذفه سيؤدي إلى ضربة قاضية وظيفية.
      ملاحظة: على الرغم من أنه من المتوقع أن يحدث موقع الانقسام Cas9 على بعد 3 نقاط أساس في المنبع من الشكل المجاور للفاصل الأولي (PAM) ، إلا أن الانقسام على مسافة أكبر يمكن أن يحدث أيضا ، وبالتالي فإن الحل الجيد هو عدم الاعتماد على التوطين الدقيق لموقع الانقسام ، مثل الانقسام في الإنترون.
  3. حدد تسلسل المكمل العكسي (RC) لكل gRNA ، بدون PAM ، من أجل الحصول على التسلسلات التالية: الدليل 1 والدليل 1-RC والدليل 2 والدليل 2-RC.
  4. اطلب من الاشعال المعروضة في الجدول 1 إجراء استنساخ للبلازميدات. طوال البروتوكول ، استخدم الاشعال بتركيز 10 نانومتر في H2O المعقمة.
    ملاحظة: تتوافق التسلسلات المضافة إلى gRNAs في هذه الاشعال (الجريئة والمسطرة) مع تسلسل البلازميد قبل وبعد الدليل ، promotor ، و Transactivating Crispr RNA (tracrRNA) ، على التوالي ، ولا ينبغي تعديلها من أجل ضمان تداخل جيد بين الاشعال والبلازميد.

2. استنساخ البلازميد

ملاحظة: في هذه الخطوة، سيتم إدخال gRNAs في العمود الفقري البلازميد لإنتاج lentivirus. يتم إنتاج كاسيت يقوم بترميز اثنين من gRNAs لأول مرة بواسطة تفاعلات البوليميراز المتتالية (PCR) ، باستخدام الاشعال المتداخلة. ثم يتم إدخال الكاسيت الجديد في بلازميد العمود الفقري للفيروسات اللنية #87919.

  1. احصل على البلازميدات التالية: البلازميد #87919 ، ترميز الحمض النووي الريبي لتوجيه كريسبر في ناقل فيروسي عدي وترميز البلازميد #87904 لتسلسل SpCas9 في ناقل فيروسي عدي.
  2. بناء الكاسيت
    ملاحظة: يرد ملخص لبروتوكول الاستنساخ في الشكل 2.
    1. قم بتشغيل تفاعل PCR (A) ، مع 2 ميكرولتر من البلازميد # 87919 ، و 2 ميكرولتر من primer_XmaIF ، و 2 ميكرولتر من primer_Guide1R ، و 25 ميكرولتر من مزيج البوليميراز ، و 19 ميكرولتر من H2O. قم بتشغيل برنامج PCR التالي (البرنامج 1): تمسخ أولي 5 دقائق عند 98 درجة مئوية ، متبوعا ب 30 دورة من: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 60 درجة مئوية، 1 دقيقة 45 ثانية عند 72 درجة مئوية، واستطالة نهائية لمدة 7 دقائق عند 72 درجة مئوية. Tm من الاشعال الموصوفة في الخطوة 1.4 هو 60 درجة مئوية.
      ملاحظة: على الرغم من أن وقت الاستطالة في البرنامج 1 يبدو طويلا جدا ، فقد تم اختيار وقت الاستطالة هذا لضمان إنتاج ما يكفي من المواد بالحجم المناسب. في الواقع ، بسبب التسلسلات المتكررة في البلازميد (يتم تكرار تسلسل tracrRNA بعد أدلة الحمض النووي الريبي ثلاث مرات في البلازميد # 87919) ، فإن تضخيم PCR للحمض النووي المتوقع أمر صعب ، ويتم إنتاج نطاقات أصغر إضافية في PCR المتتالية. وبالتالي ، بسبب المنافسة بين منتجات PCR المختلفة ، إما تم زيادة وقت الاستطالة (لصالح أطول واحد والحصول على ما يكفي من المواد النقية في النهاية) ، أو تم استخدام PCR الهبوطي (البرنامج 2) للجزء الطويل (مثل الموصوف ل PCR (النهائي) في الخطوة 2.2.6).
    2. افصل منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 1٪ في المخزن المؤقت Tris-Borate-EDTA (TBE) ، وقم بقص وتنقية جزء 300 نقطة أساس. قم بإجراء التنقية باستخدام مجموعة مخصصة باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، مع الإزالة في حجم نهائي يبلغ 20 ميكرولتر.
    3. قم بتشغيل تفاعل PCR (B) ، مع 2 ميكرولتر من البلازميد # 87919 ، و 2 ميكرولتر من primer_Guide1F ، و 2 ميكرولتر من primer_Guide2R ، و 25 ميكرولتر من مزيج البوليميراز ، و 19 ميكرولتر من H2O باستخدام برنامج PCR 1. افصل منتجات PCR على هلام الأغاروز بنسبة 1٪ في TBE ، وقم باستئصال وتنقية جزء 400 نقطة أساس في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت. استخدم الجزء المنقى مباشرة أو اخزنه عند -20 درجة مئوية للخطوة 2.2.5.
    4. قم بتشغيل تفاعل PCR (C) ، مع 2 ميكرولتر من البلازميد # 87919 ، و 2 ميكرولتر من primer_Guide2F ، و 2 ميكرولتر من primer_BlpIR ، و 25 ميكرولتر من مزيج البوليميراز ، و 19 ميكرولتر من H2O باستخدام برنامج PCR 1. افصل منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 1٪ في مخزن مؤقت TBE. اقتطاع وتنقية جزء 600 نقطة أساس في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج. إما استخدام الجزء المنقى مباشرة أو تخزينها في -20 درجة مئوية للخطوة 2.2.6.
      ملاحظة: قد يكون هناك جزء آخر عند 900 نقطة أساس مرئية، بسبب تهجين التمهيدي على المناطق المتكررة في البلازميد، كما هو موضح في ملاحظة الخطوة 2.2.1. إذا كان موجودا ، فيجب التخلص من هذه الفرقة.
    5. قم بتشغيل تفاعل PCR (D) ، مع 2 ميكرولتر من الاستخلاص PCR A (من الخطوة 2.2.2) ، و 2 ميكرولتر من إزالة PCR B (من الخطوة 2.2.3) ، و 2 ميكرولتر من primer_XmaIF ، و 2 ميكرولتر من primer_Guide2R ، و 25 ميكرولتر من مزيج البوليميراز ، و 19 ميكرولتر من H2O ، باستخدام برنامج PCR 1. افصل منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 1٪ في مخزن مؤقت TBE ؛ اقتطاع وتنقية جزء 700 نقطة أساس في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج. إما استخدام الجزء المنقى مباشرة أو تخزينها في -20 درجة مئوية للخطوة 2.2.6.
      ملاحظة: قد تكون النطاقات الأخرى مرئية عند >1000 نقطة أساس و 400 نقطة أساس و 300 نقطة أساس ، بسبب تهجين الاشعال في المناطق المتكررة ويجب التخلص منها.
    6. قم بتشغيل تفاعل PCR (النهائي) ، مع 4 ميكرولتر من الاستخلاص PCR C (من الخطوة 2.2.4) ، و 4 ميكرولتر من الاستخلاص PCR D (من الخطوة 2.2.5) ، و 4 ميكرولتر من primer_XmaIF ، و 4 ميكرولتر من primer_BlpIR ، و 50 ميكرولتر من مزيج البوليميراز ، و 34 ميكرولتر من H2O. البرنامج المستخدم هو التالي (برنامج PCR 2): تمسخ أولي لمدة 5 دقائق عند 98 درجة مئوية. ست دورات من: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 66 درجة مئوية (انخفاض في درجة حرارة التهجين بمقدار 1 درجة مئوية لكل دورة) ، 1 دقيقة 45 عند 72 درجة مئوية ؛ 35 دورة من: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية، 30 ثانية عند 60 درجة مئوية، 1 دقيقة 45 عند 72 درجة مئوية، واستطالة نهائية لمدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.
      ملاحظة: برنامج PCR لهذا التضخيم النهائي هو PCR هبوط ، يختلف عن السابق ، بسبب الحجم الكبير للتضخيم النهائي الذي يحتوي على تسلسلين متكررين tracrRNA بعد كل دليل مباشرة.
    7. افصل منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 1٪ في مخزن مؤقت TBE ؛ قم بقص وتنقية الكاسيت النهائي ، الذي يهاجر عند حوالي 1300 نقطة أساس في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت. تحديد كمية المنتج المسحوق. استخدم الجزء المنقى مباشرة أو اخزنه عند -20 درجة مئوية للخطوة 2.3.2.1. هذا هو المنتج النهائي الذي سيتم إدخاله في البلازميد lentivirus.
      ملاحظة: قد تكون الشظايا الأخرى مرئية عند >1000 نقطة أساس و 400 نقطة أساس و 300 نقطة أساس ، المقابلة لشظايا PCR غير المكتملة التي يجب التخلص منها.
  3. إدخال كاسيت gRNAs في العمود الفقري للبلازميد lentivirus.
    1. خطي البلازميد عن طريق الهضم المزدوج للبلازميد #87919 مع إنزيمات التقييد XmaI و BlpI.
      1. تحضير التفاعل مع 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت الموصى به ، و 15 ميكرولتر من البلازميد (1 ميكروغرام / ميكرولتر) ، و 7.5 ميكرولتر من إنزيم BlpI (عند 10 U / μL) ، و 7.5 ميكرولتر من إنزيم XmaI (عند 10 U / μL) ، و112.5ميكرولتر من H 2 O. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، ثم لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية. قم بتحميل الكمية الإجمالية على هلام أغاروز بنسبة 1٪ ، وقطع وتنقية البلازميد ~ 10 كيلو بايت مع مجموعة مناسبة. يتم إجراء الاستخلاص في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، ويتم تحديد المنتج المكشوف كميا باستخدام قياس الكثافة البصرية.
        ملاحظة: استخدم بروتوكول تنقية مناسب لجزء كبير من الحمض النووي، مثل البروتوكول الموصوف بواسطة Sun و coll9.
    2. ربط كاسيت gRNA والبلازميد. تحضير مزيج التفاعل مع كاسيت gRNA من الخطوة 2.2.7 والبلازميد الخطي من الخطوة 2.3.1.1 ، إضافة 2 ميكرولتر من الإنزيم و H2O للحصول على حجم نهائي من 10 p_guides ميكرولتر.
      ملاحظة: يجب أن تكون كمية كاسيت الحمض النووي بين 50-100 نانوغرام وكمية البلازميد بين 100-200 نانوغرام، مع نسبة مولية 2: 1.
  4. استخدم 2 ميكرولتر من البلازميد المحضر حديثا لتحويل E.Coli المختص كيميائيا مثل Stbl3 (50 ميكرولتر) أو XL10-Gold وانتشر على صفيحة أجار LB مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين بعد نمو 1 ساعة عند 37 درجة مئوية بدون مضاد حيوي. تحضن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اختر بعض المستعمرات وقم بإجراء إعداد صغير باستخدام مجموعة تجارية باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  5. قم بإجراء تضخيم PCR على الحمض النووي المصغر مع Primer_XmaI Primer_BlpR باستخدام برنامج PCR 1 (انظر الشكل 2). افصل منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 1٪ في مخزن مؤقت TBE. حدد بعض المستعمرات (~ 5) مع شريط في الحجم المتوقع من حوالي 1300 نقطة أساس.
  6. قم بإجراء تسلسل الحمض النووي للمستعمرات المختارة ، باستخدام Primer_XmaI أو Primer_BlpR ، لتأكيد الإدخال الصحيح لكاسيت gRNA.
    ملاحظة: يتم استخدام إحدى المستعمرات التي تم التحقق من تسلسلها في الدراسة ، وتسمى البلازميد p_guides.
  7. كرر ذلك من الخطوة 2.2 (بناء الكاسيت) مع Primers-Killer F و R ، و Primers-mCherry F و R. استخدم مستعمرة واحدة تم التحقق من تسلسلها لمزيد من التحليل. يسمى البلازميد p_Killer.

3. إنتاج الفيروس العاص

  1. قم بإنتاج وتنقية كمية كبيرة من جميع البلازميدات المطلوبة باستخدام مجموعة أدوات ماكسي الجاهزة الخالية من السموم الداخلية باتباع تعليمات الشركة المصنعة. تحضير الأليكوتات عند 2 ميكروغرام / ميكرولتر.
  2. تحضير الخلايا (اليوم 1)
    1. قم بإعداد 18 طبقا من 145 سم منزوع البذور مع 1 × 106 خلايا HEK293 لكل طبق في 16 مل من الوسط المكون من بيروفات النسر المعدل (DMEM) عالي الجلوكوز من Dulbecco ، مع استكمال 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. تضخيم الخلايا عند 37 درجة مئوية ، في حاضنة 5٪ CO2 لمدة 3 أيام.
      ملاحظة: يجب أن يتم إنتاج الفيروس اللينتيري بحذر في مختبر السلامة الأحيائية من المستوى 2، باستخدام معدات حماية مكيفة، بما في ذلك البدلة الواقية التي يمكن التخلص منها، والغطاء الواقي، والقفازات. يجب إجراء جميع التجارب تحت غطاء تدفق صفحي (خزانة أمان BSLII) مع نصائح مرشح. يجب تعطيل جميع المحلول الذي يحتوي على فيروسات lentiviruses وجميع النفايات البلاستيكية / الزجاجية المستخدمة باستخدام الإيثانول 70٪ أو أي معطل آخر للفيروسات.
  3. نقل الخلايا (اليوم 4)
    1. تحقق من التقاء الخلايا ، للتأكد من أنها وصلت إلى 60٪ -65٪ التقاء.
    2. قم بإعداد محلول النقل الذي يحتوي لكل صفيحة على: 20.8 ميكروغرام من البلازميد محل الاهتمام (p-guides ، أو p-Killer ، أو pCas9 # 87904) ، 4.8 ميكروغرام من البلازميد الذي يشفر المغلف (VSV-G ، # 8454) ، 20.8 ميكروغرام من البلازميد psPAX2 (# 12260) للتغليف الفيروسي العدسي ، 136 ميكرولتر من فوسفات الكالسيوم واضبط مع H2O إلى حجم نهائي قدره 1000 ميكرولتر. أضف هذا المحلول قطريا وتحت الإثارة إلى 1 مل من 2x محلول ملحي مخزن مؤقتا ب HEPES (HBS).
      ملاحظة: لا تقم بإعداد مزيج لجميع الألواح في نفس الوقت لضمان التحضير الأمثل للكواشف. قم بإعداد مزيج لستة أطباق في نفس الوقت ، على سبيل المثال ، ل 18 لوحة ، قم بإعداد ثلاث مرات مزيج لستة أطباق.
    3. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق على الأقل وإضافة 2 مل من المحلول قطرة إلى الخلايا. قم بتجانس كاشف النقل مع تحريك لطيف للصفيحة للخلف وإلى الأمام والأعلى والأسفل ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO2 لمدة 5 ساعات على الأقل.
      ملاحظة: من هذه النقطة وحتى نهاية إنتاج lentivirus ، ارتد معدات حماية إضافية ، بما في ذلك زوج ثان من القفازات وأكمام الحماية و plastron القابل للتصرف.
    4. بعد خمس ساعات من النقل ، قم بإزالة الوسط من الألواح وشطفه باستخدام PBS للتخلص من كواشف النقل. أضف 12 مل من الوسط الطازج واحتضن 48 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  4. جمع الجسيمات الفيروسية (اليوم 6)
    1. جمع وتجميع الوسط من جميع اللوحات. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، لتكوير الحطام الخلوي. قم بتصفية supernatant باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر (يلزم وجود مرشحات متعددة).
    2. جهاز طرد مركزي عند 68,300 × g لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية في دوار دلو متأرجح. قم بإزالة المادة الفائقة واترك الأنابيب مقلوبة رأسا على عقب تحت خزانة الأمان على ورقة لمدة 5-10 دقائق لإزالة أكبر قدر ممكن من السائل ، ثم أضف 100 ميكرولتر من وسط انتشار HEK لكل حبيبة. بعد 2 ساعة على الأقل عند 4 درجات مئوية ، أعد تعليق الكريات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. تجمع جميع الكريات المعاد تعليقها.
      ملاحظة: يمكن ترك الكريات في الوسط بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية قبل الاقتباس.
    3. Aliquot lentivirus في حجم عينة 10 ميكرولتر أو 25 ميكرولتر (اعتمادا على الاستخدام) والتجميد المفاجئة مع النيتروجين السائل. يخزن على درجة حرارة -80 درجة مئوية. لا تقم بتجميد aliquot الذي تم إذابته.
  5. كرر الخطوات من 3.2 إلى 3.4 مع البلازميدات الأخرى ذات الأهمية لإنتاج أدلة LV و LV-Killer و LV-Cas9.
    ملاحظة: كبديل ، يمكن شراء فيروسات lentiviruses من شركة أو منشأة فيروسات.

4. معايرة فيروس Lentivirus

ملاحظة: يتم إجراء معايرة الفيروسات على خلايا HEK293. من المهم أن تتضمن المعايرة بالتحليل الحجمي في الخطوات اللاحقة عددا دقيقا من فيروسات lentivirus لكل خلية (مهما كانت دفعة lentivirus) ، للخلايا ذات الاهتمام. يسمى عدد الجسيمات الفيروسية التي تنقل الخلية بكفاءة تعدد العدوى (MOI): وبالتالي يتوافق MOI 10 مع إدخال 10 جزيئات فيروسية لكل خلية. نظرا لأن دورة التجميد / الذوبان تؤثر على صلاحية الفيروس ، يتم إجراء المعايرة بالتحليل الحجمي باستخدام أليكوت فيروس لينتيفيروس مجمد ، وسيتم إجراء كل تجربة لاحقة باستخدام أليكوت جديد من نفس التجمع. يتم وصف إحدى طرق المعايرة بالتحليل الحجمي هنا ، ولكن يمكن استخدام طرق أخرى.

  1. في اليوم الأول ، البذور 1 × 105 خلايا لكل لوحة في خمس لوحات 35 مم مع أغطية زجاجية في القاع ولوحين 35 مم بدون غطاء.
  2. في اليوم 2 ، من اللوحتين بدون أغطية ، قم بجمع وحساب عدد الخلايا بعد التربسينات ، وحدد متوسط كمية الخلايا لكل لوحة (N).
  3. تحضير 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف عند 1/10 في وسط الانتشار. قم بتحويل الصفائح الخمسة المستزرعة بأحجام مختلفة من الفيروس المخفف ، من 1 إلى 50 ميكرولتر من الفيروس المخفف. بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم الأحجام التالية لتحويل الصفائح الخمسة: 1 ميكرولتر ، 5 ميكرولتر ، 10 ميكرولتر ، 20 ميكرولتر ، 50 ميكرولتر.
  4. في اليوم الرابع ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق حضانة الأغطية في RT لمدة 20 إلى 30 دقيقة في 4٪ paraformaldehyde. بالنسبة ل LV-Cas9 ، قم بتخلل الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton X100 في محلول ملحي مخزن مؤقت للفوسفات (PBS) لمدة 10 دقائق في RT ، وتشبع في PBS-0.1٪ Triton X100-2٪ مصل الماعز - 0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) لمدة 20 دقيقة في RT ، وتسمية لمدة 45 دقيقة في RT مع الأجسام المضادة الأولية V5 (تخفيف 1/400) تليها حضانة لمدة 30 دقيقة في RT مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت. قم بتسمية النوى باستخدام Hoescht (10 ميكروغرام / مل في PBS) لمدة 10 دقائق في RT.
  5. قم بتركيب الأغطية على شريحة وراقب باستخدام مجهر فلورسنت مجهز بهدف 20x. بالنسبة لأدلة LV و LV-Killer ، بعد التثبيت ، انتقل مباشرة إلى وضع العلامات على النوى وقم بتركيب الأغطية. لكل زلة غطاء، احسب العدد الإجمالي للنوى (إجمالي عدد الخلايا) في مجال الرؤية وعدد الخلايا المصنفة (إما ب V5 أو mCherry)، وحدد نسبة الخلايا المصنفة لكل زلة غطاء.
  6. حدد غطاء تكون فيه نسبة الخلايا المحولة 10٪ على الأقل ولا تتجاوز 50٪. حدد كفاءة النقل (X) لهذا الغطاء ، ولاحظ حجم الفيروس المخفف (V ، في μL) المستخدم للحصول على كفاءة النقل هذه.
    figure-protocol-16546
  7. حدد عيار الفيروس (في الجسيمات المعدية ، ممثلة في IP / mL) وفقا للصيغة التالية:
    figure-protocol-16728
    عامل التخفيف هو تخفيف الفيروس lentivirus الذي يتم إجراؤه في الخطوة 4.3. حصلنا بشكل روتيني على عيار نهائي من 1 × 109 ip / mL ل LV-Cas9 و 1 × 1010 ip / mL لدليل LV ، يتم تحديده في خلايا HEK.

5. نقل Myoblast

ملاحظة: يتم نقل الخلايا العضلية المخلدة على التوالي مع فيروسات lentivirus الثلاثة التي تم إنتاجها سابقا. يتم الحفاظ عليها بكثافة أقل من 50٪ في وسط انتشار يتكون من F10 من Ham مع 20٪ FBS ، 2٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 2٪ Ultroser G ، ومستزرعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.

  1. تحديد حجم الفيروس lentivirus اللازم لعلاج العدد المختار من الخلايا باستخدام MOI 10 ل LV-Cas9 و LV-guides و MOI 20 ل LV القاتل ، وفقا للصيغة التالية:
    figure-protocol-17566
    ملاحظة: في تجربة موازية، تمت مقارنة كفاءة النقل على الأرومات العضلية وHEK، باستخدام فيروس lentivirus الضابطة (lenti-GFP)، وقررنا أن هناك حاجة إلى خمسة أضعاف فيروسات lentivirus لنقل الخلايا العضلية بكفاءة مقارنة بخلية HEK. وبالتالي ، فإن MOI 10 المقاسة على HEK تتوافق مع جزيئين فيروسيين لكل أرومة عضلية. يتم حساب MOI المستخدمة هنا على خلايا HEK.
  2. في اليوم الأول ، بذور 96 لوحة بئر مع 10000 خلية في 100 ميكرولتر من وسط الانتشار لكل بئر. في اليوم 2، قم بنقل الخلايا الموجودة أسفل خزانة الأمان عن طريق إضافة الحجم المناسب من أدلة LV و LV-Cas9 المحسوبة في الخطوة 5.1. أعد الخلايا إلى الحاضنة حتى اليوم 7.
    ملاحظة: قد لا يؤدي استخدام MOI أعلى من 25 ، خاصة بالنسبة ل LV-Cas9 ، إلى تحسين عدد الخلايا المحررة بسبب ارتفاع موت الخلايا عند تركيز عال من lentivirus.
  3. في اليوم 7 ، قم بإجراء التربسين وعد الخلايا. زرع الخلايا عند التقاء 40٪ إلى 50٪ في لوحة جديدة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة. بعد خمس ساعات ، قم بتحويل الخلايا باستخدام LV-Killer عند MOI من 20 (الحجم المحسوب في الخطوة 5.1). تضخيم الخلايا لمدة 5 إلى 10 أيام بعد النقل ، لمدة مقطعين على الأقل ، والحفاظ عليها دائما عند التقاء منخفض يبلغ <50٪. الخلايا جاهزة للخطوة التالية ، استنساخ الخلايا ، عندما يعود نموها إلى طبيعته (يقدر بوقت الانقسام).
    ملاحظة: قد يكون الانتشار أبطأ قليلا بعد النقل. يمكن تحديد نمو الخلايا الطبيعي قبل هذا الإجراء التجريبي عن طريق تقدير وقت انقسام الخلايا.

6. استنساخ الخلايا

ملاحظة: نظرا لأن نقل myoblast صعب ولا يصل أبدا إلى كفاءة 100٪ ، حتى عند استخدام lentivirus ، فإن استنساخ الخلايا مطلوب من أجل الحصول على خط خلية مصحح بالكامل. هذا ممكن فقط مع الخلايا الخالدة ، أو الخلايا التي يمكن زراعتها وتضخيمها خلال بضعة أسابيع / أشهر.

  1. التربسين وعد الخلايا. تمييع الخلايا في وسط الانتشار عند 10 خلايا / مل وزرع الخلايا في خلية واحدة / بئر في لوحات 96 بئر تحتوي على 100 ميكرولتر / بئر من الوسط.
    ملاحظة: يعتمد عدد اللوحات المراد بذورها على احتمال تحرير الجينات المتوقع ، ويتم استخدام 2 إلى 10 لوحات بشكل روتيني.
  2. راقب الخلايا من أجل النمو وقم بتضخيم كل بئر تدريجيا في صفيحة أكبر حتى تصل إلى صفيحة 35 مم على الأقل ، مع الحفاظ على التقاء الخلايا العضلية أقل من 50٪. يمكن أن تستمر هذه الخطوة من 2 إلى 6 أسابيع ، اعتمادا على الخلايا المستخدمة وقدرتها على النمو بمجرد عزلها في البئر.

7. اختيار استنساخ

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لتحديد أي من الحيوانات المستنسخة المتنامية قد تم تعديلها بشكل مناسب.

  1. صمم مجموعة من الاشعال تتكون من تمهيدي يقع قبل الدليل الأول (Primer_BeforeGuide1F) وتمهيدي آخر يقع بعد الدليل الثاني (Primer_AfterGuide2R) من أجل تضخيم المنطقة التي تحيط بالتسلسل المعدل المفترض. انظر الجدول 1 للاطلاع على الاشعال المستخدمة هنا.
  2. جمع الخلايا من كل استنساخ ، وتجنيب ما لا يقل عن 300000 خلية للتضخيم في المستقبل ، واستخراج الحمض النووي الجيني باستخدام أي بروتوكول قياسي على الخلايا المتبقية.
    1. إذا كان هناك عدد كبير من الحيوانات المستنسخة تنمو ، للتخلص من تلك غير المحررة ، فقم بإجراء اختبار سريع عن طريق تجميع الخلايا من خمسة مستنسخات في نفس الأنبوب لاستخراج الحمض النووي من هذا التجمع واختباره باستخدام PCR. كرر ذلك مع أكبر عدد ممكن من الحيوانات المستنسخة حسب الضرورة. بعد ذلك ، قم بفصل التجمعات التي تحتوي على خلايا تم تحريرها لإجراء تحليل فردي.
  3. التحكم في التحرير بواسطة PCR على النحو التالي. قم بإعداد تفاعل PCR باستخدام 1 ميكرولتر من Primer_BeforeGuide1F ، و 1 ميكرولتر من Primer_AfterGuide2R ، و 12.5 ميكرولتر من مزيج البوليميراز ، و 3 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني ، و 7.5 ميكرولتر من H2O. تضخيم في جهاز تدوير حراري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ومعلمات التمهيدي. تشغيل على هلام الأغاروز 1٪ لتحديد الحيوانات المستنسخة المعدلة.
  4. تحكم في التحرير عن طريق التسلسل على النحو التالي. قم بإجراء تسلسل Sanger للنسخ المستنسخة المحددة لتأكيد الحذف وتحديد كيفية إجراء التحرير في كل نسخة. احتفظ بأكثر من نسخة معدلة للتأكد من أن الجين المستهدف فقط قد تم تعديله وهو المسؤول عن التأثير الفسيولوجي الذي لوحظ واحتفظ باستنساخ غير محرر سيتم استخدامه كاستنساخ تحكم (CTRL) في التجارب اللاحقة.
  5. قم بتوسيع النسخ المستنسخة المحددة. بمجرد أن يصل التقاء كل استنساخ إلى حوالي 50٪ ، قم بالتربسين بالخلايا وقم بصفيحة الخلايا في طبق أكبر ، حتى يتم إنتاج ما يكفي من الخلايا لأداء التوصيفات الكيميائية الحيوية والوظيفية (عادة أكثر من 1 × 106 لكل استنساخ) ، وتخزين الأليكوتات المجمدة لكل استنساخ للاستخدام في المستقبل.

8. توصيف الحيوانات المستنسخة المحررة

ملاحظة: بمجرد اختيار عدد قليل من الحيوانات المستنسخة وتأكيدها عن طريق تسلسل الحمض النووي ، يمكن تأكيد حذف الجين المستهدف على مستوى البروتين باستخدام اللطخة الغربية ، وعلى المستوى الوظيفي إذا كان الفحص الخلوي الوظيفي متاحا لهذا الجين. في حالة RYR1-KO ، نظرا لأن RyR1 عبارة عن قناة كالسيوم ، فقد تم إجراء التوصيف الوظيفي باستخدام تصوير الكالسيوم على الخلايا المستزرعة.

  1. تعبير البروتين في النسخ المستنسخة المحررة
    ملاحظة: يتم التعبير عن RyR1 فقط في الأنابيب العضلية المتباينة10. تم تقييم تعبيره في الأنابيب العضلية باستخدام اللطخة الغربية ، لتأكيد الحذف على مستوى البروتين في RyR1 ، وكذلك حذف بروتين Cas9.
    1. صفيحة 200000 خلية في وسط الانتشار (الموصوف أعلاه ، الخطوة 5) على سطح يبلغ طوله حوالي 1.76 سم2 في صفيحة 35 مم مغلفة باللامينين (سطح يتوافق مع قطرة 200 ميكرولتر من اللامينين عند 10 ملغ / مل في PBS مع الكالسيوم). بمجرد أن تلتصق الخلايا باللوحة بعد احتضانها لمدة 2-3 ساعات عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، قم بتحويل وسط المزرعة إلى وسط تمايز يتكون من DMEM منخفض الجلوكوز + 10٪ مصل الحصان + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، وأعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 6 أيام.
    2. بعد 6 أيام من التمايز ، قم بجمع الخلايا وتحليلها باستخدام 200 ميكرولتر من RIPA المكمل بمثبطات الأنزيم البروتيني. تحديد تركيز البروتين باستخدام طريقة فولين لوري11.
    3. قم بتحميل 15 ميكروغرام من البروتين ، بعد تمسخ لمدة 30 دقيقة في RT في مخزن تمسخ Laemmli ، على هلام أكريلاميد متدرج بنسبة 5٪ -15٪. بعد الفصل الكهربائي ، انقل البروتينات الموجودة على Immobilon P عند 0.8 فولت لمدة 4 ساعاتو 11.
    4. بعد تشبع الغشاء لمدة 30 دقيقة في RT في PBS يحتوي على 0.1٪ Tween 20 و 5٪ حليب جاف خالي الدسم ، احتضن الغشاء بالأجسام المضادة الأولية المخففة في نفس المخزن المؤقت لمدة 2 ساعة في RT أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، واغسل الغشاء 5x لمدة 5 دقائق مع PBS-0.1٪ Tween 20 واحتضن الغشاء بالأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في RT. الأجسام المضادة الأساسية المستخدمة هي: الأجسام المضادة ضد V5-tag (التخفيف: 1/5000) للكشف عن Cas9 ، anti-GAPDH (التخفيف: 1/1000) كعنصر تحكم في التحميل ، الأجسام المضادة المضادة RyR1 12,13 (التخفيف: 1/10.000) ، الأجسام المضادة ضد الوحدة الفرعية alpha 1 من DHPR (التخفيف: 1/1000) والأجسام المضادة ضد سلسلة الميوسين الثقيلة MF20 (التخفيف: 1/1000).
    5. اغسل الغشاء 5x لمدة 5 دقائق باستخدام PBS-0.1٪ Tween 20 ، وجفف فائض السائل وأضف الركيزة الكيميائية. تابع على النحو الموصى به من قبل مزود الركيزة للكشف عن الإشارة الكيميائية.
  2. التوصيف الوظيفي للنسخ المستنسخة المحررة
    ملاحظة: تم تقييم وظيفة RyR1 باستخدام تصوير الكالسيوم في الأنابيب العضلية المتباينة ، المنتجة من استنساخ CTRL أو KO14.
    1. طبق 50000 خلية على سطح 0.2 سم2 في وسط أطباق 35 مم مغلفة باللامينين (السطح مغطى بقطرة صفيحة 50 ميكرولتر ، عند 10 ملغ / مل في PBS مع الكالسيوم) وحث التمايز لمدة 6 أيام كما هو موضح في الخطوة 8.1.1. إعداد ثلاث لوحات لكل تحفيز ، للحصول على ثلاثة أضعاف بيولوجية.
    2. قم بتحميل الأنابيب العضلية ب 50 ميكرولتر من الفلو 4 مباشرة ، مخففة 1: 1 في وسط التمايز ومحتضنة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا مرتين مع المخزن المؤقت KREBS مع استكمال الجلوكوز في 1 ملغ / مل.
    3. قم بقياس اختلافات التألق باستخدام مجهر فلورسنت مقلوب أو مجهر بؤري باستخدام هدف 10x. قم بتثبيت اللوحة على مرحلة المجهر وابدأ عملية الاستحواذ بمعدل 1 إطار في الثانية لمدة 90 ثانية.
    4. قم بإزالة KREBS المتبقية وتحفيز الخلايا في الإطار 25 عن طريق إضافة 2 مل من KCl لإزالة الاستقطاب الغشائي (التركيز النهائي 140 mM) أو 2 مل من 4 CmC (التركيز النهائي 500 μM) للتحفيز المباشر RyR1. تأكد من وجود 10 أنابيب عضلية على الأقل في الحقل المسجل.
    5. حدد مقدار تباين التألق في كل أنبوب عضلي ، باستخدام برنامج مخصص. حدد للتحليل ما لا يقل عن 10 أنابيب عضلية لكل طبق (من الناحية المثالية 20-30 myotubes لكل طبق) ، وارسم خطا (أو منطقة اهتمام (ROI)) على المحور الطويل لكل أنبوب عضلي وجمع التألق F على طول هذا الخط لجميع الإطارات.
    6. أوجد قيمة الفلورسنت الأولية، F0، المقابلة للإطارات من 1 إلى 24. ارسم تباين الفلورسنت (F-F0)/F0 كدالة للوقت من 0 إلى 90 ثانية. كرر التجربة ثلاث مرات للحصول على تباين التألق من 90 أنبوب عضلي على الأقل من ثلاث ثقافات مختلفة. قم بتجميع جميع النتائج الخاصة بالأنابيب العضلية 90 واحسب متوسط ± SEM ل (F-F0) / F0 في كل إطار زمني. حدد كمية ذروة إطلاق الكالسيوم لكل تحفيز وكل استنساخ.

النتائج

تم تطبيق هذا البروتوكول على الأرومات العضلية المخلدة من موضوع صحي15 (ما يسمى خلايا HM ، للخلايا العضلية البشرية) ، حيث تم تمييز RyR1 سابقا16 ، من أجل ضرب جين RYR1 الذي يشفر بروتين RyR1 . تم تصميم أدلة الحمض النووي الريبي لحذف التسلسل الذي يشمل جزءا من exon 101 و intron 101 من الج...

Discussion

تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية على الطريق إلى توصيف الجينات ذات الوظيفة غير المعروفة المشاركة في الأمراض في تطوير نماذج خلوية ذات صلة لدراسة وظيفة هذه الجينات. يعد استخدام تحرير الجينات باستخدام CRISPR / Cas9 مجالا بحثيا متناميا بشكل كبير ، ويعد تطوير نماذج خروج المغلوب كما هو موضح هنا من بين أكث?...

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من خلال منح من الرابطة الفرنسية لمكافحة اعتلال العضلات (AFM-Téléthon) ومن Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-CACNA1S antibodySigma-AldrichHPA048892Primary antibody
Blp INE BioLabsR0585SRestriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection KitTakara631312 Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgGGeneTexGTX221667-01HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgGGeneTexGTX221666HRP secondary antibody
Fluo-4 directMolecular ProbesF10472Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb Cell Signaling Technology#2118Primary antibody
HindIIIFermentasER0501Restriction enzyme
InFusion HD Precision PlusTakara638920Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GCThermoFisher ScientificF532LMix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibodyDHSBMF20Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EFMacherey-NagelREF 740424Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMacherey-Nagel740609DNA purification
NucleoSpin TissueMacherey-Nagel740952Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coliThermoFisher ScientificC737303Chemically competent cells
Plasmid #87904Addgene87904Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919Addgene87919Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260Addgene12260Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454Addgene8454Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal AntibodyInvitrogeneR96025 Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent CellsAgilent200317Chemically competent cells
Xma INE BioLabsR0180SRestriction enzyme

References

  1. Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
  2. Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
  3. Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
  4. Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
  5. Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
  6. Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
  7. Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
  8. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  9. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  10. Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
  11. Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
  12. Garibaldi, M., et al. Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
  13. Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
  14. Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
  15. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
  16. Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
  17. Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
  18. Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
  19. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved