Разработка нокаутирующих мышечных клеточных линий с использованием лентивирусно-опосредованного редактирования генов CRISPR/Cas9

Резюме

Протокол описывает, как генерировать нокаутирующие миобласты с помощью CRISPR/Cas9, начиная от проектирования направляющих РНК до клеточного клонирования и характеристики нокаутирующих клонов.

Аннотация

Одним из важных применений кластерных регуляторных межпространственных коротких палиндромных повторов (CRISPR)/Cas 9 является разработка нокаутирующих клеточных линий, в частности, для изучения функции новых генов/белков, связанных с заболеванием, выявленных в ходе генетической диагностики. Для развития таких клеточных линий необходимо распутать две основные проблемы: вставка инструментов CRISPR (Cas9 и направляющая РНК) с высокой эффективностью в выбранные клетки и ограничение активности Cas9 специфической делецией выбранного гена. Протокол, описанный здесь, посвящен вставке инструментов CRISPR в трудно трансфектируемые клетки, такие как мышечные клетки. Этот протокол основан на использовании лентивирусов, продуцируемых с плазмидами, общедоступными, для которых все этапы клонирования описаны для нацеливания на интересующий ген. Контроль активности Cas9 был выполнен с использованием адаптации ранее описанной системы под названием KamiCas9, в которой трансдукция клеток лентивирусом, кодирующим направляющую РНК, нацеленную на Cas9, позволяет прогрессировать отмену экспрессии Cas9. Этот протокол был применен к разработке RYR1-нокаутирующей линии мышечных клеток человека, которая была дополнительно охарактеризована на белковом и функциональном уровне, чтобы подтвердить нокаут этого важного кальциевого канала, участвующего в внутриклеточном высвобождении кальция мышц и в связи возбуждение-сокращение. Процедура, описанная здесь, может быть легко применена к другим генам в мышечных клетках или в других трудно трансфектируемых клетках и производить ценные инструменты для изучения этих генов в клетках человека.

Введение

С прогрессом секвенирования генов и идентификацией мутаций в генах неизвестных функций в конкретной ткани разработка соответствующих клеточных моделей для понимания функции нового гена-мишени и подтверждения его участия в связанных патофизиологических механизмах представляет собой важный инструмент. Кроме того, эти модели имеют большое значение для будущих терапевтических разработок ^1,2 и представляют собой интересную альтернативу разработке нокаутированных моделей животных в прямой линии с международными рекомендациями по сокращению использования животных в экспериментах. Редактирование генов с использованием CRISPR / Cas9 является одним из самых мощных инструментов, доступных в настоящее время, что позволило разработать множество нокаут-моделей, а целевая проверка генов с использованием CRISPR / Cas9 является одним из наиболее широко используемых применений CRISPR / Cas9³. Успех редактирования генов зависит от способности вводить инструменты CRISPR (направляющие РНК и нуклеазу Cas9) в модель клеток-мишеней, что может быть проблемой во многих труднопереводимых клетках, таких как мышечные клетки⁴. Эта проблема может быть преодолена с помощью вируса, обычно лентивируса, который имеет большое преимущество для эффективного преобразования многих типов клеток и доставки их трансгена. Но его основным недостатком является интеграция трансгена в геном клетки-хозяина, что приводит к потенциальному изменению генов, локализованных в месте интеграции, и к постоянной экспрессии трансгена, что в случае нуклеазы Cas9 приведет к разрушительным последствиям⁵. Умный раствор был предложен Мерьенн и его коллегами⁶, который состоит из введения в клетки направляющей РНК, нацеленной на сам ген Cas9, что приводит к инактивации Cas9. Адаптация этой стратегии представлена здесь в виде удобного и универсального протокола, позволяющего нокаутировать практически любой ген в труднотрансфектируемых клетках.

Целью представленного здесь протокола является индуцирование инактивации гена, представляющего интерес, в увековеченных мышечных клетках. Его можно использовать для нокаутирования любого гена, представляющего интерес, в различных типах увековеченных клеток. Протокол, описанный здесь, содержит шаги по разработке направляющих РНК и их клонированию в лентивирусные плазмиды, для производства инструментов CRISPR в лентивирусных векторах, для трансдукции клеток с различными лентивирусами и для клонирования клеток для получения однородной отредактированной клеточной линии.

Используя этот протокол, были разработаны увековеченные клетки скелетных мышц человека с делецией рецептора рианодина типа 1 (RyR1), важного кальциевого канала, участвующего во внутриклеточном высвобождении кальция и сокращении мышц⁷. Нокаут (KO) гена был подтвержден на уровне белка с использованием вестерн-блоттинга и на функциональном уровне с использованием кальциевой визуализации.

протокол

Биопсии мышц были получены из Банка тканей для исследований (Myobank, партнер в сети ЕС EuroBioBank, Париж, Франция) в соответствии с европейскими рекомендациями и французским законодательством. Письменное информированное согласие было получено от всех лиц. Увековеченные миобласты были любезно изготовлены доктором В. Мули (Институт миологии, Париж, Франция), а протоколы были одобрены этическим комитетом Института миологии (MESRI, n AC-2019-3502).

1. Дизайн руководства CRISPR

1. Определите область гена, подлежащего удалению. Найдите его геномную последовательность с помощью инструментов браузера генома, таких как ensembl.org или genome.ucsc.edu и определите хромосомные координаты двух областей, чтобы найти направляющую РНК (гРНК) по обе стороны области, подлежащую удалению.
   1. Для гена, используемого здесь, получите последовательность FASTA гена RYR1 и последовательность экзона 101 следующим образом. В ensembl выполните поиск RYR1 в самой последней версии генома человека, выберите первую запись и нажмите на расшифровку кодирующей последовательности белка. Затем нажмите на Exons , чтобы перенаправить на список экзонов гена.
   2. Нажмите «Загрузить последовательность» и выберите «Только геномная последовательность », чтобы загрузить полную консенсусную последовательность всего гена. Прокрутите вниз список экзонов и интронов гена и выберите целевой (ы).
   3. Найдите соответствующую нуклеотидную последовательность в гене. Выберите нуклеотидные последовательности интронов непосредственно вверх и вниз по течению экзона, которые будут удалены, которые будут использоваться для поиска гРНК.
2. Разработайте две гРНК, называемые здесь руководством 1 и руководством 2, в регионах, определенных на этапе 1.1 (интроны вверх и вниз по течению региона, подлежащего удалению), используя онлайн-инструменты, такие как Crispor.tefor.net⁸. Выберите две гРНК, разделенные несколькими сотнями пар оснований (bp), причем последовательность каждой гРНК составляет ровно 20 нуклеотидов в длину без смежного мотива протоспейсера (PAM). Выберите лучшие доступные направляющие, чтобы ограничить выход за пределы цели. Пример проектирования направляющих приведен на рисунке 1 .
   1. Ожидается, что последовательность между двумя направляющими будет удалена и, что приведет к выбиванию интересующего гена, таким образом, выберите положение двух направляющих таким образом, чтобы оно удалило существенную последовательность или существенный экзон в интересующем гене. Убедитесь, что удаленная последовательность/экзон не присутствует исключительно в альтернативном транскрипте гена и/или что он кодирует важную часть белка, таким образом, его делеция приведет к функциональному нокауту.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя предполагается, что участок расщепления Cas9 произойдет в 3 bp выше по течению от смежного мотива протоспейсера (PAM), расщепление на большем расстоянии также может произойти, поэтому хорошее решение не должно зависеть от точной локализации места расщепления, такого как расщепление в интроне.
3. Определите последовательность обратного комплемента (RC) для каждой гРНК без PAM, чтобы иметь следующие последовательности: Guide 1 и Guide 1-RC, Guide 2 и Guide 2-RC.
4. Закажите праймеры, представленные в таблице 1 , для выполнения клонирования плазмид. На протяжении всего протокола применяют праймеры в концентрации 10 нМ в стерильном_Н2О.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности, добавленные к гРНК в этих праймерах (выделенные жирным шрифтом и подчеркнутые), соответствуют последовательности плазмиды до и после направляющей, промоторной и трансактивирующей CRISPR РНК (тракрРНК) соответственно и не должны модифицироваться для обеспечения хорошего перекрытия между праймерами и плазмидой.

2. Плазмидное клонирование

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе гРНК будут вставлены в плазмидную основу для производства лентивируса. Кассета, кодирующая две гРНК, сначала производится путем последовательных полимеразных цепных реакций (ПЦР) с использованием перекрывающихся праймеров. Затем новая кассета вставляется в лентивирусную основную плазмиду #87919.

1. Получите следующие плазмиды: плазмиду #87919, кодирующую направляющие РНК CRISPR в лентивирусном векторе и плазмиду #87904, кодирующую последовательность SpCas9 в лентивирусном векторе.
2. Кассетная конструкция
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол о клонировании кратко изложен в Рисунок 2.
   1. Запустите реакцию ПЦР (А) с 2 мкл плазмиды #87919, 2 мкл primer_XmaIF, 2 мкл primer_Guide1R, 25 мкл полимеразной смеси и 19 мкл_Н2О. Запустите следующую программу ПЦР (программа 1): начальная денатурация 5 мин при 98 °C, за которой следуют 30 циклов: 30 с при 98 °C, 30 с при 60 °C, 1 мин 45 с при 72 °C и конечное удлинение 7 мин при 72 °C. Tm грунтовок, описанных на шаге 1.4, составляет 60 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя время удлинения в программе 1 кажется довольно длительным, это время удлинения было выбрано для обеспечения производства достаточного количества материала нужного размера. Действительно, из-за повторяющихся последовательностей в плазмиде (последовательность тракрРНК после проводников РНК повторяется три раза в плазмиде #87919) ПЦР-амплификация ожидаемой ДНК затруднена, и в последовательных ПЦР образуются дополнительные более мелкие полосы. Таким образом, из-за конкуренции между различными продуктами ПЦР для длинного фрагмента было увеличено либо время удлинения (в пользу самого длинного и достаточного количества очищенного материала в конце), либо для длинного фрагмента была использована ПЦР (программа 2), как описано для ПЦР (заключительная) на этапе 2.2.6).
   2. Отделите продукты ПЦР на 1% агарозном геле в буфере Tris-Borate-EDTA (TBE), рассейте и очистите фрагмент 300 bp. Выполните очистку с помощью специального комплекта в соответствии с инструкцией производителя, с элюированием в конечном объеме 20 мкл. Либо используйте очищенный фрагмент напрямую, либо храните при -20 °C для шага 2.2.5.
   3. Запустите реакцию ПЦР (B) с 2 мкл плазмиды #87919, 2 мкл primer_Guide1F, 2 мкл primer_Guide2R, 25 мкл полимеразной смеси и 19 мкл_H2Oс использованием программы ПЦР 1. Отделите продукты ПЦР на 1% агарозном геле в ТБЭ, рассейте и очистите фрагмент 400 bp в 20 мкл буфера элюирования. Либо используйте очищенный фрагмент непосредственно, либо храните при -20 °C для шага 2.2.5.
   4. Запустите реакцию ПЦР (С) с 2 мкл плазмиды #87919, 2 мкл primer_Guide2F, 2 мкл primer_BlpIR, 25 мкл полимеразной смеси и 19 мкл_H2Oс использованием программы ПЦР 1. Отделите продукты ПЦР на 1% агарозном геле в буфере TBE. Акцизируйте и очистите фрагмент 600 bp в 20 мкл буфера элюирования. Либо используйте очищенный фрагмент непосредственно, либо храните при -20 °C для шага 2.2.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть виден еще один фрагмент при 900 bp из-за гибридизации праймера на повторяющихся областях в плазмиде, как описано в ПРИМЕЧАНИИ к шагу 2.2.1. Если она присутствует, эта полоса должна быть отброшена.
   5. Запустите реакцию ПЦР (D) с 2 мкл элюирования ПЦР А (со стадии 2.2.2), 2 мкл элюирования ПЦР В (со стадии 2.2.3), 2 мкл primer_XmaIF, 2 мкл primer_Guide2R, 25 мкл полимеразной смеси и 19 мкл_H2Oс программой ПЦР 1. Отделить продукты ПЦР на 1% агарозном геле в буфере TBE; иссечь и очистить фрагмент 700 bp в 20 мкл буфера элюирования. Либо используйте очищенный фрагмент непосредственно, либо храните при -20 °C для шага 2.2.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие полосы могут быть видны при >1000 bp, 400 bp и 300 bp из-за гибридизации праймеров на повторяющихся областях и должны быть отброшены.
   6. Запустить ПЦР (конечную) реакцию с 4 мкл элюирования ПЦР С (со стадии 2.2.4), 4 мкл элюирования ПЦР D (со стадии 2.2.5), 4 мкл primer_XmaIF, 4 мкл primer_BlpIR, 50 мкл полимеразной смеси и 34 мкл_Н2О. Используется следующая программа (программа ПЦР 2): начальная денатурация в течение 5 мин при 98 °C; шесть циклов: 30 с при 98 °C, 30 с при 66 °C (снижение температуры гибридизации на 1 °C за цикл), 1 мин 45 при 72 °C; 35 циклов: 30 с при 98 °C, 30 с при 60 °C, 1 мин 45 при 72 °C и конечное удлинение 5 мин при 72 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программа ПЦР для этой окончательной амплификации представляет собой ПЦР с касанием, отличающуюся от предыдущей, из-за большого размера конечной амплификации, которая содержит две повторяющиеся последовательности тракрРНК сразу после каждого проводника.
   7. Отделить продукты ПЦР на 1% агарозном геле в буфере TBE; иссечь и очистить конечную кассету, которая мигрирует примерно на 1 300 bp в 20 мкл буфера элюирования. Количественно оцените элюированный продукт. Либо используйте очищенный фрагмент непосредственно, либо храните при температуре -20 °C для этапа 2.3.2.1. Это конечный продукт, который будет вставлен в лентивирусную плазмиду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие фрагменты могут быть видны при >1000 bp, 400 bp и 300 bp, что соответствует неполным фрагментам ПЦР, которые должны быть отброшены.
3. Вставка кассеты гРНК в лентивирусную плазмидную магистраль.
   1. Линеаризация плазмиды путем двойного переваривания плазмиды No87919 с ферментами рестрикции XmaI и BlpI.
      1. Готовят реакцию с 15 мкл рекомендуемого буфера, 15 мкл плазмиды (1 мкг/мкл), 7,5 мкл фермента BlpI (при 10 Ед/мкл), 7,5 мкл фермента XmaI (при 10 Ед/мкл) и 112,5 мкл_Н2О. Инкубата в течение 1 ч при 37 °С, а затем в течение 20 мин при 65 °С. Загрузите общее количество на 1% агарозный гель, вырежьте и очистите плазмиду ~10 кб с помощью соответствующего набора. Элюирование выполняют в 20 мкл буфера, а элюированный продукт количественно определяют с помощью измерения оптической плотности.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующий протокол очистки для больших фрагментов ДНК, такой как протокол, описанный Sun и coll⁹.
   2. Лигат кассеты гРНК и плазмиды. Готовят реакционную смесь с кассетой гРНК со стадии 2.2.7 и линеаризированной плазмидой со стадии 2.3.1.1, добавляют 2 мкл фермента и_Н2О, чтобы иметь конечный объем 10 мкл. Инкубат в течение 15 мин при 50 °С для получения конечной плазмиды, называемой p_guides.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество кассеты ДНК должно составлять от 50 до 100 нг, а количество плазмиды - от 100 до 200 нг с молярным соотношением 2:1.
4. Используйте 2 мкл свежеприготовленной плазмиды для преобразования химически компетентной кишечной палочки , такой как Stbl3 (50 мкл) или XL10-Gold, и наносите на агаровую пластину LB со 100 мкг/мл ампициллина после 1 ч роста при 37 °C без антибиотика. Инкубировать при 37 °C в течение ночи. Выберите несколько колоний и выполните мини-подготовку, используя коммерческий комплект, следуя инструкциям производителя.
5. Выполните амплификацию ПЦР на днк минипрепа с Primer_XmaI и Primer_BlpR с помощью программы ПЦР 1 (см. Рисунок 2). Отделите продукты ПЦР на 1% агарозном геле в буфере TBE. Выберите несколько колоний (~5) с полосой ожидаемого размера около 1300 bp.
6. Выполняют секвенирование ДНК выбранных колоний, используя Primer_XmaI или Primer_BlpR, для подтверждения правильной вставки кассеты гРНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одна из проверенных последовательностей колоний дополнительно используется в исследовании, а плазмида называется p_guides.
7. Повторите шаг 2.2 (конструкция кассеты) с Primers-Killer F и R, а также Primers-mCherry F и R. Используйте одну колонию, проверенную последовательностью, для дальнейшего анализа. Плазмида называется p_Killer.

3. Лентивирусная продукция

1. Производят и очищают большое количество всех необходимых плазмид с помощью комплекта макси-подготовки без эндотоксинов в соответствии с инструкциями производителя. Приготовьте аликвоты при 2 мкг/мкл. Хранить при -20 °C
2. Подготовка клеток (День 1)
   1. Приготовьте 18 пластин по 145 см, посеянных 1 х 10⁶ клетками HEK293 на пластину в 16 мл среды, состоящей из модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием пирувата глюкозы, дополненного 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллином / стрептомицином. Усиливают клетки при 37 °C, в 5% CO₂ инкубаторе в течение 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Производство лентивируса должно осуществляться с осторожностью в лаборатории уровня биобезопасности 2 с использованием адаптированных средств защиты, включая одноразовый защитный костюм, защитный колпачок и перчатки. Все эксперименты должны проводиться под ламинарной проточной вытяжкой (шкаф безопасности BSLII) с наконечниками фильтров. Весь раствор, содержащий лентивирусы, и все использованные пластиковые/стеклянные отходы должны быть инактивированы этанолом 70% или другим инактиватором вируса.
3. Трансфекция клеток (День 4)
   1. Проверьте слияние ячеек, чтобы убедиться, что они достигли 60-65% слияния.
   2. Приготовьте трансфекционный раствор, содержащий для каждой пластины: 20,8 мкг интересующей плазмиды (p-гиды, или p-киллер, или pCas9 #87904), 4,8 мкг плазмиды, кодирующей оболочку (VSV-G, #8454), 20,8 мкг плазмиды psPAX2 (#12260) для лентивирусной упаковки, 136 мкл фосфата кальция и отрегулируйте_h2Oдо конечного объема 1000 мкл. Добавьте этот раствор по каплям и под перемешиванием до 1 мл 2x HEPES-буферизованного физиологического раствора (HBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не готовьте смесь для всех пластин одновременно, чтобы обеспечить оптимальную подготовку реагентов; приготовьте смесь для шести тарелок одновременно, например, для 18 тарелок, приготовьте три раза смесь для шести тарелок.
   3. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение не менее 10 мин и добавлять 2 мл раствора по каплям в клетки. Гомогенизируют трансфекционный реагент с мягким перемешиванием пластины назад, вперед, вверх и вниз, инкубируют при 37 °C, 5% CO₂ в течение не менее 5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента и до конца производства лентивируса носите дополнительное защитное снаряжение, включая вторую пару перчаток, защитные рукава и одноразовый пластрон.
   4. Через пять часов после трансфекции удалите среду с пластин и промойте PBS, чтобы избавиться от трансфекционных реагентов. Добавить 12 мл свежей среды и инкубировать 48 ч при 37 °C, 5% CO₂.
4. Сбор вирусных частиц (День 6)
   1. Соберите и объедините среду со всех тарелок. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин при 4 °С, до гранулированного клеточного мусора. Фильтруйте супернатант с помощью фильтра 0,45 мкм (требуется несколько фильтров).
   2. Центрифуга при 68 300 х г в течение 2 ч при 4 °C в качающемся роторе ковша. Удалите супернатант и дайте трубкам перевернуться под шкафом безопасности на бумаге в течение 5-10 минут, чтобы удалить как можно больше жидкости, а затем добавьте 100 мкл пролиферационной среды HEK на гранулу. По крайней мере через 2 ч при 4 °C повторно суспендируйте гранулы путем пипетки вверх и вниз. Объедините все повторно суспендированные гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы можно оставить в среде на ночь при температуре 4 °C перед аликотированием.
   3. Лентивирус Аликвот в размере образца 10 мкл или 25 мкл (в зависимости от применения) и мгновенно замораживает жидким азотом. Хранить при температуре -80 °C. Не замораживайте аликвоту, которая была разморожена.
5. Повторите шаги с 3.2 по 3.4 с другими интересующими плазмидами, чтобы получить LV-направляющие, LV-Killer и LV-Cas9.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы лентивирусы можно приобрести у компании или вирусного учреждения.

4. Титрование лентивируса

ПРИМЕЧАНИЕ: Титрование вируса проводится на клетках HEK293. Титрование важно включить в последующие этапы точное количество лентивирусов на клетку (независимо от партии лентивируса) для интересующих клеток. Количество вирусных частиц, которые эффективно трансдуцируют клетку, называется множественностью инфекции (MOI): MOI 10, таким образом, соответствуют введению 10 вирусных частиц на клетку. Поскольку цикл замораживания/оттаивания влияет на жизнеспособность лентивируса, титрование проводят с замороженной лентивирусной аликвотой, и каждый последующий эксперимент будет проводиться с новой аликвотой того же пула. Один метод титрования описан здесь, но могут быть использованы и другие методы.

1. На 1-й день высевают 1 х 10⁵ ячеек на пластину в пяти 35-мм пластинах со стеклянными крышками на дне и двух 35-мм пластинах без чехлов.
2. На 2-й день из двух пластин без обшивки соберите и подсчитайте количество клеток после трипсинизации и определите среднее количество клеток на пластину (N).
3. Готовят 100 мкл лентивируса, разведенного на 1/10 в пролиферационной среде. Трансдуцируют пять культивируемых пластинок с различными объемами разбавленного вируса, от 1 до 50 мкл разбавленного вируса. Для этого протокола используют следующие объемы для преобразования пяти пластин: 1 мкл, 5 мкл, 10 мкл, 20 мкл, 50 мкл. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C, в 5% CO₂.
4. На 4-й день фиксируют клетки путем инкубации покровных пластинок при RT в течение 20-30 мин в 4% параформальдегиде. Для LV-Cas9 пропитывают клетки 0,1% тритона X100 в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) в течение 10 мин при RT, насыщают в PBS-0,1% Triton X100-2% Козьей сыворотки - 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 20 мин при RT и этикетку в течение 45 мин при RT с первичным антителом анти-V5 (разведение 1/400) с последующей 30-мин инкубацией в RT с флуоресцентным вторичным антителом. Маркируйте ядра Хештом (10 мкг/мл в PBS) в течение 10 мин при RT.
5. Установите крышки на слайд и наблюдайте с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного 20-кратным объективом. Для LV-направляющих и LV-Killer после фиксации переходят непосредственно к маркировке ядер и монтируют крышки. Для каждого облицовочного листа подсчитайте общее количество ядер (общее количество клеток) в поле зрения и количество помеченных клеток (либо V5, либо mCherry) и определите соотношение клеток, помеченных для каждого облицовочного листа.
6. Выберите крышку, в которой соотношение трансдуцированных клеток составляет не менее 10% и не превышает 50%. Определите эффективность трансдукции (X) для этого покровного листа и обратите внимание на объем разбавленного вируса (V, в мкл), используемого для получения этой эффективности трансдукции.
   
7. Определяют титр (в инфекционных частицах, представленных в виде ip/mL) вируса по следующей формуле:
   
   Коэффициент разбавления представляет собой разбавление лентивируса, выполненное на стадии 4.3. Мы регулярно получаем окончательный титр 1 x 10⁹ ip/mL для LV-Cas9 и 1 x 10¹⁰ ip/mL для LV-направляющих, определяемый в ячейках HEK.

5. Миобластная трансдукция

ПРИМЕЧАНИЕ: Увековеченные миобласты последовательно трансдуцируются тремя ранее продуцированными лентивирусами. Они поддерживаются при плотности ниже 50% в пролиферационной среде, состоящей из F10 Хама, дополненной 20% FBS, 2% пенициллина / стрептомицина, 2% Ultroser G и культивируемой при 37 ° C, 5% CO₂.

1. Определить объем лентивируса необходимо для лечения выбранного количества клеток с помощью MOI 10 для LV-Cas9 и LV-гидов и MOI 20 для LV-киллера, по следующей формуле:
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: В параллельном эксперименте эффективность трансдукции сравнивалась на миобластах и HEK с использованием контрольного лентивируса (lenti-GFP), и мы определили, что для эффективной трансдукции миобласта требуется в пять раз больше лентивирусов по сравнению с клеткой HEK. Таким образом, MOI 10, измеренный на HEK, соответствует двум вирусным частицам на миобласт. Используемые здесь MOI рассчитываются на клетках HEK.
2. На 1-й день высевают 96-луночные пластины с 10 000 клеток в 100 мкл пролиферационной среды на лунку. На 2-й день переведите ячейки под шкаф безопасности, добавив соответствующий объем LV-направляющих и LV-Cas9, рассчитанных на шаге 5.1. Верните клетки в инкубатор до 7 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование MOI выше 25, особенно для LV-Cas9, может не улучшить количество отредактированных клеток из-за более высокой гибели клеток при высокой концентрации лентивируса.
3. На 7 день выполняют трипсинизацию и подсчитывают клетки. Засейте клетки при слиянии от 40% до 50% в новую пластину и верните клетки в инкубатор. Через пять часов трансдуцируют клетки с помощью LV-киллера при MOI 20 (объем, рассчитанный на шаге 5.1). Амплируйте клетки в течение 5-10 дней после трансфекции, по крайней мере, в течение двух проходов, и всегда поддерживайте их при низкой конфюминации <50%. Клетки готовы к следующему этапу, клеточному клонированию, когда их рост возвращается к норме (оценивается по времени деления).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пролиферация может быть немного медленнее после трансдукции. Нормальный рост клеток может быть определен до этой экспериментальной процедуры путем оценки времени деления клеток.

6. Клеточное клонирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку трансдукция миобластов затруднена и никогда не достигает 100% эффективности, даже при использовании лентивируса требуется клеточное клонирование, чтобы получить полностью скорректированную клеточную линию. Это возможно только с увековеченными клетками или клетками, которые могут быть культивированы и усилены в течение нескольких недель / месяцев.

1. Трипсинизируют и подсчитывают клетки. Разбавьте клетки в пролиферационной среде при 10 клетках/мл и засейте клетки в 1 клетку/лунку в 96-луночных пластинах, содержащих 100 мкл/лунку среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество пластин, подлежащих посеву, зависит от вероятности ожидаемого редактирования генов, обычно используется от 2 до 10 пластин.
2. Следите за ростом клеток и постепенно усиливайте каждую лунку в более крупной пластине, пока не достигнете по крайней мере 35 мм пластины, сохраняя при этом слияние миобластов ниже 50%. Этот шаг может длиться 2-6 недель, в зависимости от используемых клеток и их способности расти после выделения в колодце.

7. Выбор клонирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для определения того, какие из растущих клонов были соответствующим образом изменены.

1. Спроектируйте набор грунтовок, состоящих из грунтовки, расположенной перед первой направляющей (Primer_BeforeGuide1F), и другой грунтовки, расположенной после второй направляющей (Primer_AfterGuide2R), чтобы усилить область, заключающую предположительно измененную последовательность. Грунтовки, используемые здесь, см. в таблице 1 .
2. Соберите клетки из каждого клона, сохраните не менее 300 000 клеток для будущей амплификации и извлеките геномную ДНК, используя любой стандартный протокол на оставшихся клетках.
   1. Если растет большое количество клонов, чтобы отбросить неотредактированные, выполните экспресс-тест, объединив клетки из пяти клонов в одной трубке, чтобы извлечь ДНК из этого пула и протестировать с помощью ПЦР. Повторите с таким количеством клонов, сколько необходимо. Затем отделите пулы, которые содержали отредактированные клетки, для выполнения индивидуального анализа.
3. Контролируйте редактирование с помощью ПЦР следующим образом. Готовят реакцию ПЦР с 1 мкл Primer_BeforeGuide1F, 1 мкл Primer_AfterGuide2R, 12,5 мкл полимеразной смеси, 3 мкл геномной ДНК и 7,5 мкл_Н2О. Амплифицируют в термоциклере в соответствии с инструкциями производителя и параметрами праймеров. Используйте 1% агарозный гель для идентификации отредактированных клонов.
4. Управляйте редактированием с помощью последовательности следующим образом. Выполните секвенирование выбранных клонов Сэнгером, чтобы подтвердить удаление и определить, как редактирование было выполнено в каждом клоне. Сохраните более одного отредактированного клона, чтобы убедиться, что только целевой ген был модифицирован и отвечает за наблюдаемый физиологический эффект, и сохраните неотредактированный клон, который будет использоваться в качестве контрольного клона (CTRL) в последующих экспериментах.
5. Разверните выбранные клоны. Как только слияние каждого клона достигнет около 50%, трипсинизируют клетки и помещают клетки в большую чашку, пока не будет произведено достаточное количество клеток для выполнения биохимических и функциональных характеристик (обычно более 1 х 10⁶ на клон), и храните замороженные аликвоты каждого клона для будущего использования.

8. Характеристика отредактированных клонов

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как несколько клонов были выбраны и подтверждены секвенированием ДНК, делеция целевого гена может быть подтверждена на уровне белка с использованием вестерн-блот и на функциональном уровне, если функциональный клеточный анализ доступен для этого гена. В случае RYR1-KO, поскольку RyR1 является кальциевым каналом, функциональная характеристика была выполнена с использованием кальциевой визуализации на культивируемых клетках.

1. Экспрессия белка в отредактированных клонах
   ПРИМЕЧАНИЕ: RyR1 экспрессируется только в дифференцированных миотубах¹⁰. Его экспрессия была оценена в миотрубах с использованием вестерн-блоттинга, чтобы подтвердить делецию на уровне белка RyR1, а также делецию белка Cas9.
   1. Пластина 200 000 клеток в пролиферационной среде (описанная выше, стадия 5) на поверхности около 1,76^см2 в пластине размером 35 мм, покрытой ламинином (поверхность, соответствующая капле ламинина 200 мкл при 10 мг/мл в PBS с кальцием). Как только клетки прилипнут к пластине после инкубации в течение 2-3 ч при 37 °C, 5% CO₂, переложите культуральную среду на среду дифференцировки, состоящую из DMEM с низким содержанием глюкозы + 10% сыворотки лошади + 1% пенициллина / стрептомицина, и верните клетки в инкубатор в течение 6 дней.
   2. После 6 дней дифференцировки собирают и лизируют клетки 200 мкл RIPA, дополненного ингибиторами протеазы. Определяют концентрацию белка с помощью метода¹¹ Фолина Лоури.
   3. Загрузить 15 мкг белка, после денатурации в течение 30 мин при РТ в денатурационном буфере Леммли, на 5%-15% градиентный акриламидный гель. После электрофоретического разделения переносят белки на Иммобилон Р при 0,8 В в течение 4 ч¹¹.
   4. После насыщения мембраны в течение 30 мин при RT в PBS, содержащей 0,1% Tween 20 и 5% обезжиренного сухого молока, инкубируют мембрану с первичными антителами, разведенными в том же буфере в течение 2 ч при RT или на ночь при 4 °C, промыть мембрану 5x в течение 5 мин PBS-0,1% Tween 20 и инкубировать мембрану с вторичными антителами в течение 1 ч при RT. Основными используемыми антителами являются: антитела против V5-метки (разведение: 1/5000) для обнаружения Cas9, анти-GAPDH (разведение: 1/1000) в качестве контроля нагрузки, анти-RyR1 антитело ^12,13 (разведение: 1/10.000), антитело против альфа-1 субъединицы DHPR (разведение: 1/1000) и антитело против тяжелой цепи миозина MF20 (разведение: 1/1000).
   5. Промыть мембрану 5х в течение 5 мин PBS-0,1% Tween 20, высушить избыток жидкости и добавить хемилюминесцентную субстрату. Действуйте в соответствии с рекомендациями поставщика субстрата для обнаружения хемилюминесцентного сигнала.
2. Функциональная характеристика отредактированных клонов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Функцию RyR1 оценивали с помощью кальциевой визуализации в дифференцированных миотрубах, полученных из клонов CTRL или KO¹⁴.
   1. Пластина 50 000 клеток на поверхности 0,2^см2 в центре 35 мм посуды покрыта ламинином (поверхность, покрытая каплей ламинина 50 мкл, при 10 мг/мл в PBS кальцием) и индуцируют дифференцировку в течение 6 дней, как описано на этапе 8.1.1. Подготовьте три тарелки для каждой стимуляции, чтобы иметь биологический трипликат.
   2. Нагружают миотрубы 50 мкл флуо-4-прямого, разбавляют 1:1 в дифференцировочной среде и инкубируют в течение 30 мин при 37 °С. Промыть клетки дважды буфером KREBS, дополненным глюкозой в 1 мг/мл.
   3. Измерьте вариации флуоресценции с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа или конфокального микроскопа с помощью 10-кратного объектива. Установите пластину на ступень микроскопа и начните съемку со скоростью 1 кадр в секунду в течение 90 с.
   4. Удалить оставшиеся KREBS и стимулировать клетки в рамке 25 путем добавления 2 мл KCl для мембранной деполяризации (конечная концентрация 140 мМ) или 2 мл 4 CmC (конечная концентрация 500 мкМ) для прямой стимуляции RyR1. Убедитесь, что в зарегистрированном поле присутствует не менее 10 миотубов.
   5. Количественно оцените вариации флуоресценции в каждой миотубе, используя специальное программное обеспечение. Выберите для анализа не менее 10 миотуб на блюдо (в идеале 20-30 миотуб на блюдо), нарисуйте линию (или область интереса (ROI)) на длинной оси каждой миотрубы и соберите флуоресценцию F вдоль этой линии для всех кадров.
   6. Определите начальное значение флуоресцента F0, соответствующее кадрам от 1 до 24. График флуоресцентного изменения (F-F0)/F0 в зависимости от времени от 0 до 90 с. Повторите эксперимент три раза, чтобы получить вариацию флуоресценции по меньшей мере из 90 миотубок из трех разных культур. Объедините все результаты для 90 миотуб и рассчитайте средний ± SEM (F-F0)/F0 на каждом временном интервале. Количественно оцените пиковую амплитуду высвобождения кальция для каждой стимуляции и каждого клона.

Результаты

Этот протокол был применен к увековеченным миобластам от здорового субъекта¹⁵ (так называемые клетки HM, для миобластов человека), в которых RyR1 ранее был охарактеризован¹⁶, чтобы выбить ген RYR1 , кодирующий белок RyR1. Конструкция направляющей РНК была сделана д...

Обсуждение

Важным шагом на пути к характеристике генов неизвестной функции, участвующих в патологиях, является разработка соответствующих клеточных моделей для изучения функции этих генов. Использование редактирования генов с использованием CRISPR / Cas9 является экспоненциально растущей областью ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CACNA1S antibody	Sigma-Aldrich	HPA048892	Primary antibody
Blp I	NE BioLabs	R0585S	Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit	Takara	631312	Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG	GeneTex	GTX221667-01	HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG	GeneTex	GTX221666	HRP secondary antibody
Fluo-4 direct	Molecular Probes	F10472	Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	#2118	Primary antibody
HindIII	Fermentas	ER0501	Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus	Takara	638920	Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC	ThermoFisher Scientific	F532L	Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody	DHSB	MF20	Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	REF 740424	Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609	DNA purification
NucleoSpin Tissue	Macherey-Nagel	740952	Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli	ThermoFisher Scientific	C737303	Chemically competent cells
Plasmid #87904	Addgene	87904	Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919	Addgene	87919	Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260	Addgene	12260	Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454	Addgene	8454	Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody	Invitrogene	R96025	Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells	Agilent	200317	Chemically competent cells
Xma I	NE BioLabs	R0180S	Restriction enzyme