تحسين سرعة الأذين عبر المريء لتقييم قابلية الرجفان الأذيني لدى الفئران

Summary

يصف البروتوكول الحالي تحسين المعلمات التجريبية عند استخدام سرعة الأذين عبر المريء لتقييم قابلية الرجفان الأذيني في الفئران.

Abstract

أثبتت نماذج الفئران لعوامل الخطر الوراثية والمكتسبة للرجفان الأذيني (AF) قيمتها في التحقيق في المحددات الجزيئية للرجفان الأذيني. يمكن إجراء التحفيز الكهربائي المبرمج باستخدام سرعة الأذين عبر المريء كإجراء للبقاء على قيد الحياة ، وبالتالي تمكين الاختبار التسلسلي في نفس الحيوان. ومع ذلك ، توجد العديد من بروتوكولات السرعة ، مما يعقد قابلية التكاثر. يهدف البروتوكول الحالي إلى توفير استراتيجية موحدة لتطوير معلمات تجريبية خاصة بالنموذج لتحسين قابلية التكرار بين الدراسات. يتم إجراء الدراسات الأولية لتحسين الأساليب التجريبية للنموذج المحدد قيد التحقيق ، بما في ذلك العمر في وقت الدراسة والجنس ومعلمات بروتوكول السرعة (على سبيل المثال ، طريقة السرعة وتعريف قابلية AF). الأهم من ذلك ، يتم توخي الحذر لتجنب طاقات التحفيز العالية ، لأن هذا يمكن أن يسبب تحفيز الضفيرة العقدية مع تنشيط غير مقصود السمبتاوي ، والذي يتجلى في كتلة الأذينية البطينية المبالغ فيها (AV) أثناء السرعة وغالبا ما يرتبط بتحريض AF الأثري. يجب استبعاد الحيوانات التي تظهر هذه المضاعفات من التحليل.

Introduction

يمثل الرجفان الأذيني (AF) مسارا مشتركا نهائيا للعديد من عوامل الخطر المكتسبة والجينية. بالنسبة للدراسات التي تبحث في الآليات الفيزيولوجية المرضية لركيزة AF ، تعد نماذج الفئران مفيدة نظرا لسهولة التلاعب الجيني وحقيقة أنها ، بشكل عام ، تعيد إنتاج حساسية AF التي لوحظت في البشر للأنماط الظاهرية السريرية المختلفة¹،^2،3. ومع ذلك ، نادرا ما تصاب الفئران ب AF⁴ التلقائي ، مما يستلزم استخدام دراسات تنظيم الأذين الاستفزازية.

يمكن إجراء التحفيز الكهربائي المبرمج (PES) لتقييم الفيزيولوجيا الكهربية الأذينية للفئران وحساسية الرجفان الأذيني باستخدام سرعة داخل القلب⁵ أو 6 عبر المريء. في حين أن النهج عبر المريء مفيد بشكل خاص كإجراء للبقاء على قيد الحياة ، إلا أن استخدامه معقد بسبب العديد من البروتوكولات التجريبية المنشورة ^7,8 ومصادر التباين التي يمكن أن تعيق التكاثر⁹. علاوة على ذلك ، فإن مقارنات البروتوكول المحدودة المبلغ عنها تجعل اختيار بروتوكول سرعة مناسب أمرا صعبا.

يهدف البروتوكول الحالي إلى استخدام استراتيجية منهجية لتطوير طرق PES عبر المريء الخاصة بالنموذج لتقييم حساسية الفئران AF من أجل زيادة قابلية التكاثر. الأهم من ذلك ، يتم إجراء دراسات تجريبية أولية لتحسين بروتوكول السرعة من خلال حساب العمر والجنس وتقلب وضع السرعة ، مع تصميم السرعة لتقليل التحفيز السمبتاوي غير المقصود الذي يمكن أن يربك النتائج⁹.

Protocol

تمت الموافقة على هذا الإجراء من قبل لجنة فاندربيلت المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات ويتوافق مع دليل رعاية واستخدام المختبر. تم تطوير البروتوكول باستخدام كل^{من 9 الجينية} والمكتسبة¹⁰ (على سبيل المثال ، ارتفاع ضغط الدم) نماذج الفئران من حساسية AF. كان المشغل أعمى عن النمط الظاهري للفأر قيد الدراسة.

1. اختيار الحيوان

1. بالنسبة للنماذج الجينية، أخضع الفئران للسرعة الأذينية كل أسبوعين (أي كل أسبوعين) كما هو موضح أدناه (انظر الخطوة 6.) لتحديد الفترة المثلى لحساسية الرجفان الأذيني.
   1. ابدأ بالسرعة كل أسبوعين في عمر 8 أسابيع. استخدم رفقاء القمامة من النوع البري كعناصر تحكم لتقليل التباين. ادرس كلا الجنسين ، حيث قد لا يطور المرء النمط الظاهري^{AF 9}.
2. بالنسبة للنماذج المكتسبة ، قم بإجراء السرعة بعد أن تحقق الفئران النضج البدني (~ 12 أسبوعا من العمر)¹⁰. كما ذكر أعلاه ، دراسة كلا الجنسين.
3. خلال هذه الدراسات الأولية ، قم بإجراء كل من سرعة الاندفاع⁸ (باستخدام طول دورة سرعة ثابت [CL]) وسرعة متناقصة⁷ (مع سرعة CL أقصر تدريجيا) لتحديد وضع السرعة الأمثل. افصل كل إجراء بحد أدنى 24 ساعة.
   ملاحظة: مع دراسة عدد متزايد من الفئران ، راجع البيانات المتراكمة لتحديد العمر والجنس ووضع السرعة الأمثل الذي يعزز التركيز البؤري التلقائي في الفئران الحساسة للتركيز البؤري التلقائي ولكن ليس عناصر التحكم.
   1. تحليل البيانات باستخدام تعريفات متعددة لحساسية الرجفان البؤري التلقائي (على سبيل المثال ، عدد حلقات الرجفان الأذيني⁸ ، وإجمالي مدة التركيز البؤري التلقائي 9 ، وحدوث الرجفان الأذيني⁴ ، وحدوث الرجفان الأذيني المستمر ، والذي يعرف عادة بأنه 10 ثانية 11 أو 15 ثانية¹² ، وحتى 5 دقائق^13،14) حيث قد تعرض بعض الطرز نمطا ظاهريا للتركيز البؤري التلقائي لتعريف واحد وليس كل التعريفات⁹.
      ملاحظة: يختلف تعريف حلقة الرجفان الأذيني وقابلية الرجفان الأذيني بين الدراسات المنشورة ^4,7. تعرف نوبات الرجفان الأذيني⁸ عادة بأنها نشاط أذيني سريع مع استجابة بطينية غير منتظمة تحدث لمدة 1 ثانية على الأقل (الشكل 1). بالإضافة إلى الرجفان الأذيني، قد يؤدي تنظيم الأذين أيضا إلى تحفيز الرفرفة الأذينية إما مع استجابة بطينية منتظمة أو غير منتظمة.
4. استخدم المعلمات المحسنة الخاصة بالنموذج وتعريف قابلية الرجفان الأذيني للدراسات اللاحقة على الفئران الإضافية.

2. إعداد الحيوانات

1. تخدير الفأر في غرفة الحث باستخدام 3٪ إيزوفلوران (انظر جدول المواد) في 1 لتر / دقيقة من الأكسجين بنسبة 100٪.
   ملاحظة: إيزوفلوران ضار. قد يهيج الجلد أو العين ويمكن أن يسبب الدوخة والتعب والصداع ، من بين سمية الجهاز العصبي المركزي الأخرى. استخدمه في منطقة جيدة التهوية باستخدام طريقة كسح مناسبة (على سبيل المثال ، علبة الكربون المنشط).
2. بعد فقدان منعكس الدواسة ، ضع الماوس في وضع ضعيف على وسادة تدفئة مصممة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند حوالي 37 درجة مئوية مع لصق الأطراف الخلفية على سطح الوسادة.
3. ضع مرهم ترطيب العين على العينين لمنع الجفاف.
4. ضع قناع مخدر بإحكام على أنف الماوس. ابدأ بالحفاظ على التخدير باستخدام 1٪ إيزوفلوران في 1 لتر / دقيقة من الأكسجين بنسبة 100٪. تأكد من خلو فتحتي الأنف من الانسدادات لأن الفئران تلزم أنفها.
5. احصل على مخطط كهربية القلب السطحي (ECG ، الرصاص I) عن طريق وضع أقطاب إبرة ECG 27 G تحت الجلد (انظر جدول المواد) متصلة بمكبر للصوت البيولوجي وأجهزة الحصول على البيانات في الأطراف الأمامية. قم بتأريض الإشارة عن طريق وضع قطب إبرة في الطرف الخلفي الأيسر.

3. وضع القسطرة

1. قم بإزالة قناع isoflurane لفترة وجيزة من الماوس.
2. أدخل قسطرة قطب كهربائي ثماني القطب 2-F (عرض القطب والتباعد = 0.5 مم) متصلة بمحفز وعازل محفز (انظر جدول المواد) في المريء (الشكل 2).
   1. أدخل إلى عمق يقارب المسافة من الفم (مع تمديد الرقبة) إلى أعلى الغضروف الخنجري مباشرة.
3. أعد وضع قناع الأيزوفلوران فوق فتحتي أنف الماوس.
4. ابدأ الحصول على البيانات بالتسجيل المستمر ل ECG lead I باستخدام برنامج التحليل (انظر جدول المواد).
5. اضبط وضع عازل التحفيز على ثنائي القطب. استخدم أقصى زوج من الأقطاب الكهربائية أثناء التحفيز.
6. ضع القسطرة بشكل صحيح داخل المريء لتمكين التقاطها. للقيام بذلك ، قم بتطبيق حافز 1.5 مللي أمبير بعرض نبضة 2 مللي ثانية عند CL أقصر قليلا من الجيوب الأنفية CL (على سبيل المثال ، استخدم CL 100 مللي ثانية إذا كان الجيوب الأنفية CL 120 مللي ثانية). ضع القسطرة بعناية حتى يتم الحصول على التقاط الأذين بشكل متسق.

4. تحديد العتبة

1. لتحديد عتبة الالتقاط الانبساطي الأذيني (TH) ، ابدأ السرعة عند 1.5 مللي أمبير بعرض نبضة يبلغ 2 مللي ثانية عند CL المستخدم لالتقاط الأذينين. تقليل سعة التحفيز بزيادات قدرها 0.05 مللي أمبير حتى فقدان أسر الأذين ، مع زيادة لاحقة حتى الالتقاط.
   ملاحظة: أقل سعة يتم عندها الحصول على التقاط الأذين المتسق هي TH الأذيني. نظرا للقلق من التحفيز السمبتاوي عند سعات التحفيز العالية ، والتي تنعكس من خلال كتلة AV المفرطة أثناء السرعة مع تحريض AF⁹ ، فإن الحد الأقصى المقبول TH هو 0.75 مللي أمبير. إذا لزم الأمر ، قم بتغيير موضع القسطرة لتحقيق TH ≤0.75 مللي أمبير.
2. اضبط سعة التحفيز على ضعف TH.

5. تحديد الخصائص الفيزيولوجية الكهربية

1. قياس المعلمات الفيزيولوجية الكهربية، بما في ذلك وقت استعادة العقدة الجيبية (SNRT)، وطول دورة Wenckebach (WCL)، وفترة الانكسار الفعال الأذيني البطيني (AVERP) قبل السرعة الأذينية السريعة لتحريض الرجفان الأذيني¹⁵.

6. حساسية عدم انتظام ضربات القلب الأذيني

1. قم بإجراء السرعة عند ضعف TH بعرض نبضة يبلغ 2 مللي ثانية باستخدام إما سرعة الاندفاع عند CLs مختلفة أو سرعة متناقصة كما هو محدد من الدراسات الأولية (الخطوات 1.1.-1.4.).
2. بالنسبة لسرعة الاندفاع ، قم بالسرعة عند CL الأولي البالغ 50 مللي ثانية لمدة 15 ثانية مع القطارات اللاحقة التي تحدث عند CLs من 40 مللي ثانية و 30 مللي ثانية و 25 مللي ثانية و 20 مللي ثانية و 15 مللي ثانية ^8,10. أوقف السرعة مؤقتا لمدة 30 ثانية بعد كل قطار سرعة للسماح بالتعافي قبل المتابعة. إذا حدث التركيز البؤري التلقائي بعد قطار السرعة ، فانتظر لمدة 30 ثانية بعد الإنهاء قبل متابعة السرعة اللاحقة.
3. لتناقص السرعة ، قم بالسرعة عند CL من 40 مللي ثانية وقم بتقليل CL بمقدار 2 مللي ثانية كل 2 ثانية حتى النهاية عند 20 مللي ثانية⁷. قم بإجراء قطارات السرعة في ثلاث نسخ¹⁶ أو¹⁷ خماسية ، مع توقف مؤقت لمدة 30 ثانية للتعافي بعد كل قطار. كما هو مذكور أعلاه ، إذا تطور AF ، انتظر لمدة 30 ثانية بعد الإنهاء قبل المتابعة.
   ملاحظة: عند تحسين معلمات البروتوكول أثناء التجارب الأولية (أي الخطوات 1.1.-1.5) ، قم بإجراء سرعة متناقصة باستخدام خمسة قطارات. قم بإجراء تحليل لاحق لتحديد ما إذا كانت ثلاثة أو خمسة قطارات توفر أكبر حساسية.
4. قم بإنهاء الإجراء بعد 30 ثانية من إيقاع الجيوب الأنفية بعد آخر قطار سرعة أو بعد حلقة مدتها 10 دقائق من التركيز البؤري التلقائي ، أيهما يأتي أولا.

7. ما بعد الإجراء

1. إيقاف الحصول على البيانات.
2. قم بإزالة أقطاب القسطرة وتخطيط القلب برفق.
3. توقف عن التخدير.
4. ضع الفأر المخدر في قفص وراقبه لمدة 10 دقائق لضمان الشفاء.
5. احفظ ملف البيانات. في حالة الاختبار التسلسلي ، انتظر لمدة لا تقل عن 24 ساعة قبل تكرار إجراء السرعة.

النتائج

تقيم دراسات تنظيم الأذين عبر المريء الخصائص الفيزيولوجية الكهربية للعقد الأذينية SA و AV من خلال تحديد SNRT و AVERP ، بالإضافة إلى حساسية AF⁶ (الشكل 1). يتيح تسجيل ECG قياسات مدة الموجة P ، والفاصل الزمني PR ، ومدة QRS ، وفترات QT / QTc. يمكن أن يوفر التسجيل المستمر لمخطط كهربية ?...

Discussion

لا يسمح تنظيم الأذين عبر المريء بالدراسات التسلسلية في نفس الحيوان فحسب ، بل تكون مدته عادة أقصر من الدراسات داخل القلب (~ 20 دقيقة) ، وبالتالي تقليل استخدام التخدير وآثاره على المعلمات الفيزيولوجية الكهربية.

من الأهمية بمكان تحسين الطرق في البداية لكل طراز ماوس فردي. تزيد ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G ECG electrodes	ADInstruments	MLA1204
2-F octapolar electrode catheter	NuMED	CIBercath
Activated carbon canister	VetEquip	931401
Analysis software	ADInstruments	LabChart v8.1.13
Biological amplifier	ADInstruments	FE231
Data acquisition hardware	ADInstruments	PowerLab 26T
Eye ointment	MWI Veterinary	NC1886507
Heating pad	Braintree Scientific	DPIP
Isoflurane	Piramal	66794-017-25
Stimulator	Bloom Associates	DTU-210
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	Model A365