Optimierung der transösophagealen Vorhofstimulation zur Beurteilung der Vorhofflimmeranfälligkeit bei Mäusen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Optimierung experimenteller Parameter bei der Verwendung der transösophagealen Vorhofstimulation zur Beurteilung der Anfälligkeit für Vorhofflimmern bei Mäusen.

Zusammenfassung

Mausmodelle genetischer und erworbener Risikofaktoren für Vorhofflimmern (AF) haben sich bei der Untersuchung der molekularen Determinanten von Vorhofflimmern als wertvoll erwiesen. Die programmierte elektrische Stimulation kann mittels transösophagealer Vorhofstimulation als Überlebensverfahren durchgeführt werden und ermöglicht so Serientests am selben Tier. Es gibt jedoch zahlreiche Pacing-Protokolle, was die Reproduzierbarkeit erschwert. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, eine standardisierte Strategie zur Entwicklung modellspezifischer experimenteller Parameter bereitzustellen, um die Reproduzierbarkeit zwischen Studien zu verbessern. Vorstudien werden durchgeführt, um die experimentellen Methoden für das spezifische untersuchte Modell zu optimieren, einschließlich Alter zum Zeitpunkt der Studie, Geschlecht und Parameter des Schrittmacherprotokolls (z. B. Art der Stimulierung und Definition der AF-Empfindlichkeit). Wichtig ist, dass darauf geachtet wird, hohe Reizenergien zu vermeiden, da dies zu einer Stimulation des Ganglionplexi mit versehentlicher parasympathischer Aktivierung führen kann, die sich durch einen übertrioventrikulären (AV) Block während der Stimulation manifestiert und oft mit künstlicher AF-Induktion einhergeht. Tiere, die diese Komplikation aufweisen, müssen von der Analyse ausgeschlossen werden.

Einleitung

Vorhofflimmern (AF) stellt einen letzten gemeinsamen Weg für mehrere erworbene und genetische Risikofaktoren dar. Für Studien, die die pathophysiologischen Mechanismen des AF-Substrats untersuchen, sind Mausmodelle vorteilhaft, da sie leicht genetisch manipulierbar sind und im Allgemeinen die beim Menschen beobachtete AF-Suszeptibilität für verschiedene klinische Phänotypen^{reproduzieren 1,2,3}. Mäuse entwickeln jedoch selten spontane AF⁴, was die Verwendung provokativer atrialer Pacing-Studien erforderlich macht.

Die programmierte elektrische Stimulation (PES) kann durchgeführt werden, um die murine Vorhofelektrophysiologie und die Empfindlichkeit gegenüber Vorhofflimmern entweder intrakardial⁵ oder transösophageal⁶ zu beurteilen. Während der transösophageale Ansatz als Überlebensverfahren besonders vorteilhaft ist, wird seine Anwendung durch die zahlreichen veröffentlichten experimentellen Protokolle ^7,8 und Variabilitätsquellen, die die Reproduzierbarkeit behindern können, erschwert⁹. Darüber hinaus machen begrenzte berichtete Protokollvergleiche die Auswahl eines geeigneten Pacing-Protokolls schwierig.

Das aktuelle Protokoll zielt darauf ab, mit einer systematischen Strategie modellspezifische transösophageale PES-Methoden zur Beurteilung der Empfindlichkeit von murinem Vorhofflimmern zu entwickeln, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Wichtig ist, dass erste Pilotstudien durchgeführt werden, um das Pacing-Protokoll zu optimieren, indem Alter, Geschlecht und Pacing-Modus-Variabilität berücksichtigt werden, wobei das Pacing darauf ausgelegt ist, eine versehentliche parasympathische Stimulation zu minimieren, die die Ergebnisse verfälschen kann⁹.

Protokoll

Dieses Verfahren wurde vom Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und steht im Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Das Protokoll wurde sowohl unter Verwendung von genetischen⁹ als auch^{mit 10} (z. B. Bluthochdruck) Mausmodellen der AF-Empfindlichkeit entwickelt. Der Bediener war blind für den Phänotyp der untersuchten Maus.

1. Tierauswahl

1. Für genetische Modelle unterziehen Sie Mäuse einer zweiwöchentlichen (d. h. alle zwei Wochen) atrialen Pacing, wie unten beschrieben (siehe Schritt 6.), um die optimale Periode der AF-Anfälligkeit zu bestimmen.
   1. Beginnen Sie mit dem zweiwöchentlichen Tempo im Alter von 8 Wochen. Verwenden Sie Wildtyp-Wurfgeschwister als Kontrollen, um die Variabilität zu reduzieren. Untersuchen Sie beide Geschlechter, da man möglicherweise keinen AF-Phänotyp⁹ entwickelt.
2. Führen Sie für erworbene Modelle ein Pacing durch, nachdem Mäuse die körperliche Reife erreicht haben (~ 12 Wochen alt)¹⁰. Wie oben erwähnt, studieren Sie beide Geschlechter.
3. Führen Sie während dieser Vorstudien sowohl Burst Pacing⁸ (unter Verwendung einer festen Schrittzykluslänge [CL]) als auch Dekrement-Pacing⁷ (mit einer progressiv kürzeren Pacing-CL) durch, um den optimalen Pacing-Modus zu bestimmen. Trennen Sie jeden Vorgang um mindestens 24 Stunden.
   HINWEIS: Wenn eine zunehmende Anzahl von Mäusen untersucht wird, überprüfen Sie die gesammelten Daten, um das optimale Alter, Geschlecht und den optimalen Schrittmachermodus zu bestimmen, der Vorhofflimmern bei AF-anfälligen Mäusen, aber nicht bei Kontrollen fördert.
   1. Analysieren Sie die Daten unter Verwendung mehrerer Definitionen der AF-Suszeptibilität (z. B. Anzahl der AF-Episoden⁸, Gesamtdauer des Vorhofflimmerns 9, AF-Inzidenz⁴ und anhaltende AF-Inzidenz, üblicherweise definiert als 10 s 11 oder 15 s 12 und sogar bis zu 5 min^13,14), da einige Modelle einen AF-Phänotyp für eine^, aber nicht für alle Definitionen anzeigen ^{können 9}.
      HINWEIS:Die Definition einer AF-Episode und die AF-Empfindlichkeit unterscheiden sich zwischen den veröffentlichten Studien ^4,7. AF-Episoden⁸ werden üblicherweise als schnelle Vorhofaktivität mit einer unregelmäßig unregelmäßigen ventrikulären Reaktion definiert, die für mindestens 1s auftritt (Abbildung 1). Zusätzlich zu AF kann die Vorhofstimulation auch Vorhofflattern mit regelmäßiger oder unregelmäßiger ventrikulärer Reaktion induzieren.
4. Verwenden Sie die optimierten modellspezifischen Parameter und die Definition der AF-Suszeptibilität für nachfolgende Studien an weiteren Mäusen.

2. Tierische Zubereitung

1. Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer mit 3% Isofluran (siehe Materialtabelle) in 1 l/min 100% Sauerstoff.
   HINWEIS: Isofluran ist schädlich. Es kann die Haut oder das Auge reizen und Schwindel, Müdigkeit und Kopfschmerzen verursachen, neben anderen Toxizitäten des zentralen Nervensystems. Verwendung in einem gut belüfteten Bereich mit einem geeigneten Spülverfahren (z. B. Aktivkohlekanister).
2. Nach dem Verlust des Pedalreflexes legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Heizkissen, das die Körpertemperatur auf etwa 37 °C hält, wobei die Hinterbeine an die Pad-Oberfläche geklebt sind.
3. Tragen Sie eine schmierende Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
4. Legen Sie eine Anästhesiemaske sicher über die Nase der Maus. Beginnen Sie mit der Aufrechterhaltung der Anästhesie mit 1% Isofluran in 1 l / min 100% Sauerstoff. Stellen Sie sicher, dass die Nasenlöcher frei von Obstruktion sind, da Mäuse obligatorische Nasenatmer sind.
5. Sie erhalten ein Oberflächenelektrokardiogramm (EKG, Ableitung I) durch subkutane Platzierung von 27 G EKG-Nadelelektroden (siehe Materialtabelle), die mit einem biologischen Verstärker und einer Datenerfassungshardware verbunden sind, in die Vordergliedmaßen. Erdung des Signals, indem Sie eine Nadelelektrode in die linke Hinterbein stecken.

3. Katheterplatzierung

1. Entfernen Sie kurz die Isofluranmaske von der Maus.
2. Führen Sie einen 2-F-Oktoktopolelektrodenkatheter (Elektrodenbreite und -abstand = 0,5 mm), der mit einem Stimulator und Stimulusisolator (siehe Materialtabelle) verbunden ist, in die Speiseröhre ein (Abbildung 2).
   1. Führen Sie sie in eine Tiefe ein, die ungefähr dem Abstand vom Mund (mit gestrecktem Hals) bis knapp über dem Xiphoidknorpel entspricht.
3. Positionieren Sie die Isofluranmaske über den Nasenlöchern der Maus.
4. Beginnen Sie die Datenerfassung mit der kontinuierlichen Aufzeichnung der EKG-Ableitung I mittels Analysesoftware (siehe Materialtabelle).
5. Stellen Sie den Stimulusisolatormodus auf bipolar ein. Verwenden Sie während der Stimulation das distalste Elektrodenpaar.
6. Positionieren Sie den Katheter richtig in der Speiseröhre, um die Erfassung zu ermöglichen. Wenden Sie dazu einen 1,5 mA-Stimulus mit einer Pulsbreite von 2 ms bei einer CL an, die etwas kürzer als die Sinus-CL ist (z. B. verwenden Sie eine CL von 100 ms, wenn die Sinus-CL 120 ms beträgt). Positionieren Sie den Katheter vorsichtig, bis eine konsistente Vorhoferfassung erreicht ist.

4. Festlegung des Schwellenwerts

1. Um die atriale diastolische Erfassungsschwelle (TH) zu bestimmen, initiieren Sie das Pacing bei 1,5 mA mit einer Pulsbreite von 2 ms an der CL, die für die Vorhoferfassung verwendet wird. Verringern Sie die Reizamplitude um 0,05 mA-Schritte bis zum Verlust der atrialen Erfassung, mit anschließender Erhöhung bis zur Erfassung.
   HINWEIS: Die niedrigste Amplitude, bei der eine konsistente Vorhoferfassung erreicht wird, ist die atriale TH. Aufgrund der Besorgnis über die parasympathische Stimulation bei hohen Reizamplituden, die sich in einer übermäßigen AV-Blockierung während der Stimulation mit künstlicher AF-Induktion⁹ widerspiegelt, beträgt der maximal akzeptable TH 0,75 mA. Falls erforderlich, positionieren Sie den Katheter neu, um TH ≤0,75 mA zu erreichen.
2. Stellen Sie die Reizamplitude auf das Doppelte TH ein.

5. Bestimmung elektrophysiologischer Eigenschaften

1. Messung elektrophysiologischer Parameter, einschließlich der Sinusknoten-Erholungszeit (SNRT), der Wenckebach-Zykluslänge (WCL) und der atrioventrikulären effektiven Refraktärperiode (AVERP) vor der schnellen Vorhofstimulation für die AF-Induktion¹⁵.

6. Anfälligkeit für atriale Arrhythmie

1. Führen Sie das Pacing bei zweifachem TH mit einer Pulsbreite von 2 ms durch, wobei entweder Burst-Pacing an verschiedenen CLs oder abnehmendes Pacing verwendet wird, wie aus ersten Studien bestimmt (Schritte 1.1.-1.4.).
2. Für die Burst-Geschwindigkeit bei einer anfänglichen CL von 50 ms für 15 s, wobei nachfolgende Züge bei CLs von 40 ms, 30 ms, 25 ms, 20 ms und 15 ms ^8,10 auftreten. Pausieren Sie das Tempo nach jedem Zug für 30 s, um die Erholung zu ermöglichen, bevor Sie fortfahren. Wenn AF nach einem Schrittmacherzug auftritt, warten Sie 30 s nach der Beendigung, bevor Sie mit der nachfolgenden Taktung fortfahren.
3. Um das Tempo zu verringern, beschleunigen Sie bei einer CL von 40 ms und verringern Sie die CL alle 2 s um 2 ms bis zum Abschluss bei 20 ms⁷. Führen Sie Tempozüge in dreifacher^{Ausfertigung 16} oder fünffach¹⁷ durch, mit einer Pause von 30 s zur Erholung nach jedem Zug. Wie oben, wenn sich AF entwickelt, warten Sie 30 s nach der Kündigung, bevor Sie fortfahren.
   HINWEIS: Wenn Sie Protokollparameter während vorläufiger Experimente (d. h. Schritte 1.1.-1.5.) optimieren, führen Sie ein abnehmendes Tempo mit fünf Zügen durch. Führen Sie eine Post-hoc-Analyse durch, um festzustellen, ob drei oder fünf Züge die größte Empfindlichkeit aufweisen.
4. Beenden Sie den Vorgang nach 30 s Sinusrhythmus nach dem letzten Schrittzug oder nach einer 10-minütigen Episode von AF, je nachdem, was zuerst eintritt.

7. Nach dem Verfahren

1. Stoppen Sie die Datenerfassung.
2. Entfernen Sie vorsichtig Katheter- und EKG-Elektroden.
3. Stoppen Sie die Anästhesie.
4. Setzen Sie die betäubte Maus in einen Käfig und beobachten Sie sie 10 Minuten lang, um die Genesung sicherzustellen.
5. Speichern Sie die Datendatei. Warten Sie bei seriellen Tests mindestens 24 Stunden, bevor Sie den Schrittmachervorgang wiederholen.

Ergebnisse

Transösophageale Vorhof-Pacing-Studien bewerten die elektrophysiologischen Eigenschaften der SA- und AV-Knoten durch Bestimmung der SNRT und AVERP sowie der AF-Suszeptibilität⁶ (Abbildung 1). Die EKG-Aufzeichnung ermöglicht Messungen der P-Wellendauer, des PR-Intervalls, der QRS-Dauer und der QT/QTc-Intervalle. Die kontinuierliche Aufzeichnung des EKGs während der schnellen Vorhofflimmer-Stimulation kann die folgenden Messungen der AF-Anfälligkeit liefern: die An...

Diskussion

Die transösophageale Vorhofstimulation ermöglicht nicht nur serielle Studien am selben Tier, sondern ihre Dauer ist typischerweise kürzer als intrakardiale Studien (~ 20 min), wodurch der Einsatz von Anästhetika und ihre Auswirkungen auf elektrophysiologische Parameter minimiert werden.

Entscheidend ist, die Methoden zunächst für jedes einzelne Mausmodell zu optimieren. Das Altern erhöht die AF-Induzierbarkeit bei normalen Mäusen^18,19,

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G ECG electrodes	ADInstruments	MLA1204
2-F octapolar electrode catheter	NuMED	CIBercath
Activated carbon canister	VetEquip	931401
Analysis software	ADInstruments	LabChart v8.1.13
Biological amplifier	ADInstruments	FE231
Data acquisition hardware	ADInstruments	PowerLab 26T
Eye ointment	MWI Veterinary	NC1886507
Heating pad	Braintree Scientific	DPIP
Isoflurane	Piramal	66794-017-25
Stimulator	Bloom Associates	DTU-210
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	Model A365