Оптимизация чреспищеводной стимуляции предсердий для оценки восприимчивости к фибрилляции предсердий у мышей

Резюме

Настоящий протокол описывает оптимизацию экспериментальных параметров при использовании чреспищеводной стимуляции предсердий для оценки восприимчивости к фибрилляции предсердий у мышей.

Аннотация

Мышиные модели генетических и приобретенных факторов риска фибрилляции предсердий (ФП) оказались ценными при исследовании молекулярных детерминант ФП. Запрограммированная электрическая стимуляция может быть выполнена с использованием чреспищеводной стимуляции предсердий в качестве процедуры выживания, что позволяет проводить серийные испытания на одном и том же животном. Тем не менее, существуют многочисленные протоколы темпа, что усложняет воспроизводимость. Настоящий протокол направлен на обеспечение стандартизированной стратегии разработки экспериментальных параметров для конкретных моделей для улучшения воспроизводимости между исследованиями. Предварительные исследования проводятся для оптимизации экспериментальных методов для конкретной исследуемой модели, включая возраст на момент исследования, пол и параметры протокола кардиостимуляции (например, режим кардиостимуляции и определение восприимчивости к ФП). Важно отметить, что следует избегать высоких энергий стимулов, так как это может вызвать стимуляцию ганглионного плексиуса с непреднамеренной парасимпатической активацией, проявляющейся преувеличенной атриовентрикулярной (AV) блокадой во время кардиостимуляции и часто связанной с артефактной индукцией ФП. Животные, демонстрирующие это осложнение, должны быть исключены из анализа.

Введение

Фибрилляция предсердий (ФП) представляет собой окончательный общий путь для множественных приобретенных и генетических факторов риска. Для исследований, изучающих патофизиологические механизмы субстрата ФП, мышиные модели являются предпочтительными, учитывая простоту генетических манипуляций и тот факт, что в целом они воспроизводят восприимчивость к ФП, наблюдаемую у людей для различных клинических фенотипов ^1,2,3. Тем не менее, у мышей редко развивается спонтанная AF⁴, что требует использования провокационных исследований темпа предсердий.

Программируемая электрическая стимуляция (PES) может быть выполнена для оценки электрофизиологии предсердий мышей и восприимчивости к ФП с использованием либо внутрисердечного⁵, либо чреспищеводного^6-го темпа. Хотя чреспищеводный подход особенно выгоден в качестве процедуры выживания, его использование осложняется многочисленными опубликованными экспериментальными протоколами ^7,8 и источниками изменчивости, которые могут препятствовать воспроизводимости⁹. Кроме того, ограниченное количество сообщаемых сравнений протоколов затрудняет выбор соответствующего протокола темпа.

Текущий протокол направлен на использование систематической стратегии для разработки специфических для модели методов ЧРЕС для оценки восприимчивости к ФП мышей с целью повышения воспроизводимости. Важно отметить, что первоначальные пилотные исследования проводятся для оптимизации протокола кардиостимуляции путем учета вариабельности возраста, пола и режима темпа, причем темп предназначен для минимизации непреднамеренной парасимпатической стимуляции, которая может спутать результаты⁹.

протокол

Эта процедура была одобрена Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию и согласуется с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию. Протокол был разработан с использованием как генетических⁹ , так и приобретенных¹⁰ (например, гипертония) мышиных моделей восприимчивости к ФП. Оператор был ослеплен фенотипом исследуемой мыши.

1. Селекция животных

1. Для генетических моделей подвергайте мышей двухнедельному (т.е. раз в две недели) кардиостимуляции предсердий, как описано ниже (см. шаг 6.), чтобы определить оптимальный период восприимчивости к ФП.
   1. Начните раз в две недели в возрасте 8 недель. Используйте пометов дикого типа в качестве элементов управления, чтобы уменьшить изменчивость. Изучите оба пола, так как у одного не может развиться фенотип^{ФП 9}.
2. Для приобретенных моделей проводите кардиостимуляцию после того, как мыши достигнут физической зрелости (~ 12 недель)¹⁰. Как уже говорилось выше, изучайте оба пола.
3. Во время этих предварительных исследований выполните как пакетный темп⁸ (используя фиксированную длину цикла темпа [CL]), так и декрементальный темп⁷ (с постепенно более коротким темпом CL), чтобы определить оптимальный режим темпа. Отделите каждую процедуру минимум на 24 часа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По мере изучения все большего числа мышей просмотрите накопленные данные, чтобы определить оптимальный возраст, пол и режим темпа, который способствует ФП у мышей, восприимчивых к ФП, но не у контрольной группы.
   1. Проанализируйте данные, используя несколько определений восприимчивости к ФП (например, количество эпизодов ФП⁸, общая продолжительность ФП⁹, частота ФП⁴ и устойчивая частота ФП, обычно определяемая как 10 с¹¹ или 15 с¹² и даже до 5 мин^13,14), поскольку некоторые модели могут отображать фенотип ФП для одного, но не для всех определений⁹.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определение эпизода ФП и восприимчивости ФП различаются между опубликованными исследованиями ^4,7. Эпизоды⁸ ФП обычно определяются как быстрая предсердная активность с нерегулярным желудочковым ответом, происходящим в течение по меньшей мере 1 с (рисунок 1). В дополнение к ФП, стимуляция предсердий может также вызывать трепетание предсердий с регулярным или нерегулярным желудочковым ответом.
4. Используйте оптимизированные параметры модели и определение чувствительности к ФП для последующих исследований на дополнительных мышах.

2. Подготовка животных

1. Обезболивают мышь в индукционной камере, используя 3% изофлуран (см. Таблицу материалов) в 1 л/мин 100% кислорода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран вреден. Это может раздражать кожу или глаза и может вызвать головокружение, усталость и головную боль, среди других токсичностей центральной нервной системы. Использование в хорошо проветриваемом помещении с соответствующим методом очистки (например, канистра с активированным углем).
2. После потери педального рефлекса поместите мышь в лежачее положение на грелке, предназначенной для поддержания температуры тела примерно на уровне 37 °C, приклеив задние конечности к поверхности колодки.
3. Нанесите смазывающую глазную мазь на глаза, чтобы предотвратить пересыхание.
4. Надежно наденьте анестезирующую маску на нос мыши. Начинают поддержание анестезии с использованием 1% изофлурана в 1 л/мин 100% кислорода. Убедитесь, что ноздри свободны от обструкции, так как мыши являются облигатными носовыми дышащими.
5. Получение поверхностной электрокардиограммы (ЭКГ, свинец I) путем подкожного размещения игольчатых электродов ЭКГ 27 Г (см. Таблицу материалов), подключенных к биологическому усилителю и аппаратуре сбора данных в передние конечности. Заземлите сигнал, поместив игольчатый электрод в левую заднюю конечность.

3. Установка катетера

1. Ненадолго снимите изофлурановую маску с мыши.
2. Вставьте в пищевод октаполярный электродный катетер 2-F (ширина электрода и расстояние = 0,5 мм), подключенный к стимулятору и изолятору стимулов (см. Таблицу материалов).
   1. Вставьте на глубину, которая приближается к расстоянию от рта (с вытянутой горловиной) чуть выше мечевидного хряща.
3. Переместите изофлурановую маску на ноздри мыши.
4. Начать сбор данных с непрерывной регистрации ЭКГ-свинца I с помощью аналитического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
5. Отрегулируйте режим изолятора стимула до биполярного. Используйте дистальную пару электродов во время стимуляции.
6. Правильно расположите катетер в пищеводе, чтобы обеспечить захват. Для этого примените стимул 1,5 мА с шириной импульса 2 мс при CL немного короче, чем синус CL (например, используйте CL 100 мс, если sinus CL составляет 120 мс). Осторожно позиционируйте катетер до тех пор, пока не будет получен последовательный захват предсердий.

4. Определение порога

1. Чтобы определить порог захвата диастолического захвата предсердий (TH), инициируйте кардиостимуляцию при 1,5 мА с шириной импульса 2 мс при CL, используемом для захвата предсердий. Уменьшают амплитуду стимула на 0,05 мА с шагом до потери захвата предсердий, с последующим увеличением до захвата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наименьшей амплитудой, при которой достигается последовательный захват предсердий, является TH предсердия. Из-за беспокойства по поводу парасимпатической стимуляции при высоких амплитудах стимула, что отражается на чрезмерном AV-блоке во время кардиостимуляции с артефактной индукцией AF⁹, максимально допустимая TH составляет 0,75 мА. При необходимости переставьте катетер для достижения TH ≤0,75 мА.
2. Отрегулируйте амплитуду стимула до удвоения TH.

5. Определение электрофизиологических свойств

1. Измерение электрофизиологических параметров, включая время восстановления синусового узла (SNRT), длину цикла Венкебаха (WCL) и атриовентрикулярный эффективный рефрактерный период (AVERP) до быстрой стимуляции предсердий для индукции ФП¹⁵.

6. Восприимчивость к предсердной аритмии

1. Выполняйте темп при двойном TH с шириной импульса 2 мс, используя либо пакетный темп при разных КЛ, либо декрементальный темп, как определено из первоначальных исследований (шаги 1.1.-1.4.).
2. Для темпа всплеска, темп при начальном CL 50 мс в течение 15 с с последующими поездами, происходящими при CL 40 мс, 30 мс, 25 мс, 20 мс и 15 мс ^8,10. Приостановите темп на 30 секунд после каждого шага, чтобы обеспечить восстановление перед продолжением. Если AF возникает после темповой тренировки, подождите 30 секунд после окончания, прежде чем приступать к последующему темпу.
3. Для декрементного темпа темпа при CL 40 мс и уменьшайте CL на 2 мс каждые 2 с до окончания через 20 мс⁷. Выполняйте темп поездов в трех экземплярах¹⁶ или квинтупликации¹⁷, с паузой 30 с для восстановления после каждого поезда. Как указано выше, если развивается AF, подождите 30 секунд после прекращения, прежде чем продолжить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При оптимизации параметров протокола во время предварительных экспериментов (т.е. шагов 1.1.-1.5.) выполняйте декрементальный темп с пятью поездами. Проведите пост-специальный анализ, чтобы определить, обеспечивают ли три или пять поездов наибольшую чувствительность.
4. Прекратите процедуру на 30 с синусового ритма после последнего шага или после 10-минутного эпизода ФП, в зависимости от того, что наступит раньше.

7. Постпроцедура

1. Остановите сбор данных.
2. Аккуратно снимите катетер и электроды ЭКГ.
3. Прекратить анестезию.
4. Поместите обезболенную мышь в клетку и наблюдайте в течение 10 минут, чтобы обеспечить выздоровление.
5. Сохраните файл данных. В случае последовательного тестирования подождите не менее 24 часов, прежде чем повторять процедуру определения темпа.

Результаты

Исследования чреспищеводной стимуляции предсердий оценивают электрофизиологические свойства SA и AV узлов путем определения SNRT и AVERP, а также восприимчивости фП⁶ (рисунок 1). Запись ЭКГ позволяет измерять длительность волны P, интервал PR, длительность QRS и инт?...

Обсуждение

Чреспищеводная стимуляция предсердий не только позволяет проводить серийные исследования на одном и том же животном, но и ее продолжительность, как правило, короче, чем внутрисердечные исследования (~ 20 мин), что сводит к минимуму использование анестетика и его влияние на электрофизиол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G ECG electrodes	ADInstruments	MLA1204
2-F octapolar electrode catheter	NuMED	CIBercath
Activated carbon canister	VetEquip	931401
Analysis software	ADInstruments	LabChart v8.1.13
Biological amplifier	ADInstruments	FE231
Data acquisition hardware	ADInstruments	PowerLab 26T
Eye ointment	MWI Veterinary	NC1886507
Heating pad	Braintree Scientific	DPIP
Isoflurane	Piramal	66794-017-25
Stimulator	Bloom Associates	DTU-210
Stimulus Isolator	World Precision Instruments	Model A365