JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الفرخ هو كائن نموذجي فعال من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليه ومتاح على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من الدراسات. هنا ، يتم تفصيل سلسلة من البروتوكولات لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الأذن الداخلية للطيور وتجديدها.

Abstract

تدرك الأذن الداخلية الصوت وتحافظ على التوازن باستخدام القوقعة والدهليز. يقوم بذلك باستخدام نوع خلية حسية ميكانيكية مخصصة تعرف باسم خلية الشعر. أدت الأبحاث الأساسية في الأذن الداخلية إلى فهم عميق لكيفية عمل خلايا الشعر ، وكيف يمكن أن يؤدي عدم التنظيم إلى فقدان السمع والدوار. بالنسبة لهذا البحث ، كان الماوس هو النظام النموذجي البارز. ومع ذلك ، فقدت الفئران ، مثل جميع الثدييات ، القدرة على استبدال خلايا الشعر. وبالتالي ، عند محاولة فهم العلاجات الخلوية لاستعادة وظيفة الأذن الداخلية ، يمكن أن توفر الدراسات التكميلية في أنواع الفقاريات الأخرى مزيدا من الأفكار. الظهارة السمعية للطيور ، الحليمة القاعدية (BP) ، هي ورقة من الظهارة تتكون من خلايا شعرية حسية ميكانيكية (HCs) مقحمة بخلايا داعمة (SCs). على الرغم من اختلاف البنية التشريحية للحليمة القاعدية وقوقعة الثدييات ، إلا أن الآليات الجزيئية لتطور الأذن الداخلية والسمع متشابهة. هذا يجعل الحليمة القاعدية نظاما مفيدا ليس فقط للدراسات المقارنة ولكن أيضا لفهم التجديد. هنا ، نصف تقنيات التشريح والتلاعب للأذن الداخلية للدجاج. تظهر هذه التقنية طرق تثبيط الجزيئات الجينية والصغيرة ، والتي توفر أداة قوية لدراسة الآليات الجزيئية لتطور الأذن الداخلية. في هذه الورقة ، نناقش في تقنيات التثقيب الكهربائي للبيض لاضطراب الحليمة القاعدية وراثيا باستخدام حذف CRIPSR-Cas9 ، يليه تشريح الحليمة القاعدية. نوضح أيضا ثقافة أعضاء BP والاستخدام الأمثل لمصفوفات الثقافة ، لمراقبة تطور الظهارة وخلايا الشعر.

Introduction

الأذن الداخلية لجميع الفقاريات مشتقة من ظهارة بسيطة تعرف باسم placode 1,2. سيؤدي ذلك إلى ظهور جميع العناصر الهيكلية وأنواع الخلايا اللازمة لتحويل المعلومات الحسية الميكانيكية المرتبطة بإدراك السمع والتوازن. خلايا الشعر (HCs) ، المستشعر المهدبي للأذن الداخلية ، محاطة بخلايا داعمة (SCs). تنقل HCs المعلومات إلى الدماغ الخلفي السمعي من خلال الخلايا العصبية للعصب القحفي الثامن. يتم إنشاؤها أيضا من placode3 الأذنية. يتم تحقيق النقل الأولي للصوت على السطح القمي ل HC السمعي ، من خلال حزمة شعر حساسة ميكانيكيا4. يتم التوسط في ذلك من خلال نتوءات معدلة قائمة على الأكتين تسمى stereocilia، والتي يتم ترتيبها في نمط درجمتدرج 5. بالإضافة إلى ذلك ، ينظم الكيليوم الأولي المعدل ، المسمى kinocilium ، تكوين حزمة الشعر وهو مجاور لأطول صف من الأهداب المجسمة6،7،8. تعد بنية الأهداب الفراغية أمرا بالغ الأهمية لهذا الدور في تحويل المحفزات الميكانيكية المشتقة من الطاقة الصوتية إلى إشارات عصبية كهربائية9. يمكن أن يؤدي تلف HC السمعي من خلال الشيخوخة أو العدوى أو صدمة الأذن الصوتية أو الصدمة السامة للأذن إلى فقدان السمع الجزئي أو الكامل الذي لا رجعة فيه في الثدييات10.

تم اقتراح علاجات الاستبدال الخلوي التي قد تصلح مثل هذا الضرر11,12. كان نهج هذا البحث هو فهم التطور الطبيعي لخلية شعر الثدييات والسؤال عما إذا كان يمكن إعادة بدء برامج التطوير في الخلايا الشبيهة بالسلف التي قد تكون موجودة داخل الأذن الداخلية13. كان النهج الثاني هو النظر خارج الثدييات ، إلى الفقاريات غير الثديية التي يحدث فيها تجديد قوي لخلايا الشعر السمعية ، مثل الطيور14,15. في الطيور ، يحدث تجديد خلايا الشعر في الغالب من خلال إزالة تمايز الخلية الداعمة إلى حالة تشبه السلف ، يليها الانقسام الانقسامي غير المتماثل لتوليد خلية شعرية وخلية داعمة16. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ أيضا التمايز المباشر للخلية الداعمة لتوليد خلية شعرية17.

في حين أن آليات التطور السمعي للطيور تظهر أوجه تشابه كبيرة مع تلك الخاصة بالثدييات ، إلا أن هناك اختلافات18. يظهر تمايز HC و SC في الفرخ BP من اليوم الجنيني (E) 7 ، ويصبح أكثر وضوحا بمرور الوقت. بواسطة E12 ، يمكن تصور الحليمة القاعدية ذات النمط الجيد والاستقطاب الجيد (BP) ، وبواسطة E17 يمكن رؤية خلايا الشعر المتطورةجيدا 19. توفر هذه النقاط الزمنية نوافذ على آليات التمايز والزخرفة والقطبية ، بالإضافة إلى نضوج خلايا الشعر. من المهم فهم ما إذا كانت هذه الآليات محفوظة أو متباينة ، لأنها توفر نظرة ثاقبة للتماثل العميق لأصول خلايا الشعر الحسية الميكانيكية.

هنا ، نعرض مجموعة من التقنيات التي يتم إجراؤها في المراحل الجنينية المبكرة والمتأخرة لدراسة العمليات الخلوية مثل الانتشار ، وتحديد مصير ، والتمايز ، والأنماط ، والصيانة طوال تطور عضو الأذن الداخلية. هذا يكمل البروتوكولات الأخرى لفهم تطور الأذن الداخلية في زراعة النباتات20،21،22. نناقش أولا إدخال الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الخارجي في سلائف BP داخل كيس الأذن E3.5 باستخدام التثقيب الكهربائي للبيض. على الرغم من أن التلاعب الجيني يمكن أن يوفر رؤى قيمة ، إلا أن الأنماط الظاهرية المتولدة على هذا النحو يمكن أن تكون متعددة الاتجاهات وبالتالي مربكة. هذا صحيح بشكل خاص أثناء تطور الأذن الداخلية في وقت لاحق ، حيث تلعب العمليات الأساسية مثل إعادة تشكيل الهيكل الخلوي أدوارا متعددة في انقسام الخلايا ، وتشكل الأنسجة ، والتخصص الخلوي. نقدم بروتوكولات للتثبيط الدوائي في النباتات المستزرعة ، والتي توفر مزايا في التحكم في الجرعة وتوقيت العلاج ومدته ، مما يوفر معالجة زمانية مكانية دقيقة لآليات النمو.

يمكن استخدام طرق زراعة الأعضاء المختلفة اعتمادا على مدة علاج المثبطات الصغيرة. نوضح هنا طريقتين لزراعة الأعضاء تسمح بإلقاء نظرة ثاقبة على التشكل الظهاري والتخصص الخلوي. طريقة لثقافة 3D باستخدام الكولاجين كمصفوفة لثقافة قناة القوقعة تمكن من زراعة قوية والتصور الحي ل BP النامية. لفهم تكوين الأهداب المجسمة ، نقدم طريقة زراعة الغشاء بحيث يتم استزراع الأنسجة الظهارية على مصفوفة صلبة تمكن نتوءات الأكتين من النمو بحرية. تسمح كلتا الطريقتين بالمعالجة النهائية مثل تصوير الخلايا الحية ، والكيمياء المناعية ، والمسح المجهري الإلكتروني (SEM) ، وتسجيل الخلايا ، وما إلى ذلك. توفر هذه التقنيات خارطة طريق للاستخدام الفعال للفرخ كنظام نموذجي لفهم ومعالجة تطور ونضج وتجديد ظهارة الطيور السمعية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكولات التي تنطوي على شراء وزراعة واستخدام بيض الدجاج المخصب والأجنة غير المفرغة من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية التابعة للمركز الوطني للعلوم البيولوجية ، بنغالورو ، كارناتاكا.

1. في التثقيب الكهربائي للبيض من السلائف السمعية الفرخ

  1. تصميم sgRNA واستنساخه للضربة القاضية الجينية CRISPR / Cas9
    1. لإنشاء ضربات قاضية للجينات ، صمم الحمض النووي الريبي التوجيهي لتعطيل مناطق إكسون من الجين ، ويفضل أن يكون أقرب إلى نهاية 5 'من منطقة الترميز.
    2. حدد دليل الحمض النووي الريبي المحتمل باستخدام أداة الويب CRISPOR23. اضبط بيانات المتصفح على Gallus gallus وتسلسل الشكل المجاور للمسافة الأولية (PAM) على 5'- NGG -3'. يحدد البرنامج توجيه الحمض النووي الريبي من تسلسل الإدخال ويعين درجات مختلفة بناء على النشاط المستهدف وغير المستهدف. حدد أفضل أربعة أدلة لمزيد من الدراسات.
    3. لتصميم oligos الخاصة بالقالب لإنتاج الدليل (g) RNA ، قم بإزالة تسلسل PAM (5′- NGG -3′) من إخراج أداة تصميم gRNA. هذا ليس ضروريا للاستهداف ، ولكنه يحتوي على تسلسل التعرف على الانقسام Cas9. توليف اثنين من oligos التكميلية المنقاة HPLC مع موقع تقييد BsmBI في كلا الطرفين ، لكل gRNA محتمل.
    4. استنساخ تسلسل الدليل في الإطار باستخدام سقالة tracrRNA لمتجه من الاختيار (هنا ، تم استخدام متجه pcU6_1sgRNA24).
    5. قم بإذابة قليل النيوكليوتيدات sgRNA بتركيز 100 ميكرومتر في الماء الخالي من DNase / RNase. قم بإجراء التلدين لدليلي oligo الحساسين والمضاد للحساسية باستخدام دراجة حرارية مع المعلمات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، ثم 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم تنخفض إلى 4 درجات مئوية.
    6. باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية كما هو موضح في25 ، قم بإعداد هضم تقييد oligos الملدن وناقل الاستنساخ pcU6_1sgRNA مع إنزيم BsmBI بين عشية وضحاها. ربط الإعداد باستخدام متجه pcU6_1sgRNA الخطي المهضوم BsmBI المنقى بالهلام و sgRNA oligos. تحول إلى خلية مختصة DH5-alpha وتسلسل يؤكد الاستنساخ الذي تم الحصول عليه.
  2. التعامل مع البيض والنوافذ
    1. قم بشراء البيض الطازج ونظفه عن طريق مسحه بنسبة 70٪ من الإيثانول لمنع التلوث. احتضان في 37-38 درجة مئوية ، مع رطوبة 45 ٪ لمدة 3.5-4 أيام.
    2. بعد الحضانة ، ضع البيضة على جانبها لمدة 5 دقائق على الأقل قبل الفتح. هذا يسمح للجنين بإعادة وضعه إلى أعلى صفار البيض. استخدم ملقط لعمل ثقوب صغيرة في الجزء العلوي ونهاية غير حادة للبيضة بحيث يمكن أن تمر إبرة 21G.
    3. لمنع التلف أثناء النوافذ ، قم بإزالة الألبومين لخفض الجنين بعيدا عن القشرة. للقيام بذلك ، استخدم حقنة سعة 5 مل وإبرة 21 جيجا لسحب 2 مل من الألبومين بعناية من ثقب في الطرف الحاد للبيضة. استخدم شريطا شفافا لتغطية الفتحة في النهاية الحادة.
    4. لجعل نافذة البيض ، قم بلصق شريط شفاف على الجزء العلوي من قشر البيض. قطع فتح نافذة ، طولها حوالي 2 سم وعرضها 1.5 سم ، باستخدام مقص القوس الربيع وفضح الجنين. استخدم ملقط لفتح الأغشية المشيمية التي تغطي الجنين ، مما يسمح بالوصول إلى الجنين.
  3. بلازميدات الحقن الدقيق
    1. بالنسبة لتجربة خروج المغلوب الجيني ، قم بإعداد حلين: مزيج الضربة القاضية الذي يحتوي على بروتين SpCas9 والبلازميد التوجيهي - pcU6_1sgRNA ، ومزيج البلازميد التتبع من T2K-eGFP (هذا هو مروج الفرخ ß-actin يقود كاسيت GFP محاطا بمواقع transposon الخاصة ب Tol2) جنبا إلى جنب مع T2TP (Tol2 transposase المستنسخ في Tol2 بناء26,27). يتم استخدام المقتفي لتتبع كفاءة التثقيب الكهربائي.
    2. عند تعبئة عدة بلازميدات بالكهرباء ، تأكد من أن التركيز النهائي للحمض النووي لا يقل عن 4 ميكروغرام / ميكرولتر. امزج التركيبات الثلاثة ، وقم بتوجيه البلازميد - pcU6_1sgRNA و T2K-eGFP و T2TP ، بنسبة 1: 1: 1 مع 1 ميكروغرام من بروتين SpCas9 ، و 30٪ سكروز ، و 0.1٪ صبغة خضراء سريعة في حجم نهائي يبلغ 10 ميكرولتر.
    3. سحب الإبر للحقن المجهري من الشعيرات الدموية الزجاجية القياسية (طول 3 بوصة ، OD 1.0 مم) باستخدام مجتذب ماصة عمودي. استخدم ملقط دقيق لكسر الطرف الشعري بعد السحب للحصول على قطر طرف يبلغ حوالي 50 ميكرومتر بنهاية مدببة.
    4. ضع الأجنة عند E3.5 على جانبها الأيسر بحيث يكون الرأس متجها لليمين. بهذه الطريقة فقط الحويصلة الأذنية الصحيحة يمكن الوصول إليها للحقن الدقيق. حقن دقيق مزيج ضربة قاضية في الحويصلة الأذنية. حقن حوالي 200 nL حجم من مزيج محلول الحمض النووي لملء الحويصلة الأذنية.
    5. تحديد كفاءة الدليل باستخدام مقايسة T7 endonuclease28.
  4. التثقيب الكهربائي
    1. أضف بضع قطرات من محلول ملحي بنسبة 0.719٪ فوق الجنين قبل التثقيب الكهربائي لخفض المقاومة الكهربائية ومنع ارتفاع درجة حرارة الجنين.
    2. ضع القطب الموجب من خلال الفتحة المصنوعة في الجانب الحاد من البيضة عند إزالة الألبومين. مناورة القطب بحيث يكون تحت صفار البيض. ضع القطب السالب فوق كيس الأذن المملوء.
    3. استخدم التثقيب الكهربائي لنقل البلازميدات إلى خلايا الجنين. استخدم مولد نبضات مربعة وقم بتطبيق خمس نبضات مدة كل منها 25 فولت و 100 مللي ثانية ، بمسافة 50 مللي ثانية. تحديد الظروف تجريبيا على أساس إعداد التثقيب الكهربائي الفردي.
    4. رطب الجنين بعد التثقيب الكهربائي بإضافة بضع قطرات من محلول ملحي 0.719٪. لتنظيف الألبومين المشوه من سطح الأقطاب الكهربائية ، اشطفه جيدا بالماء المقطر. أعد ختم البيضة بشريط شفاف وأعدها إلى الحاضنة المرطبة عند 37-38 درجة مئوية لمزيد من الحضانة.
      ملاحظة: يمكن زراعة الأجنة حتى الفقس بعد التثقيب الكهربائي ، ولكن هناك انخفاض حاد في الصلاحية.

2. تشريح الحليمة القاعدية

  1. استخدم 70٪ من الإيثانول لتطهير الطاولة الجراحية ومرحلة المجهر والمنطقة المحيطة. تعمل الحرارة أو الكحول على تعقيم معدات التشريح المجهري التي تشمل مقص القوس الزنبركي البسيط ، والكوريت الصغير ، وزوجين من الملقط الناعم.
  2. قم بإعداد لوحات التشريح التالية: طبق بتري زجاجي بقاعدة سيليكون سوداء ، وطبق بتري بلاستيكي 90 مم ، وطبق بتري 60 مم. قم بتبريد إما محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو محلول هانكس الملحي المتوازن (HBSS) للتشريح.
  3. اكسر البيضة برفق في طبق بتري 90 مم. تحديد الأذن الخارجية للكتكوت. قطع رأس الجنين عن طريق قطع الرقبة أسفل مستوى الفك السفلي باستخدام المقص. انقل الرأس إلى طبق بتري 60 مم مملوء ببرنامج تلفزيوني بارد.
  4. قم بتوجيه الجنين مع مواجهة الجزء العلوي من المنقار نحو المجرب وأمسك المنقار باستخدام أحد ملقط # 5. استخرج العينين باستخدام ملقط # 5 الثاني. الانتقال من المنبر إلى الذيلية ، وقطع الجمجمة على طول خط الوسط. استخرج الدماغ.
  5. أضف المزيد من PBS أو HBSS المثلج وحدد موقع الهيكلين اللامعين ، بالقرب من مستوى صيوان الأذن. هذه هي otoliths من lagena في نهاية القناة القوقعة وتوجد بالقرب من خط الوسط.
  6. اقطع تقريبا بين اللاجينا ، وأعلى وأسفل هذه المنطقة لعزل أذنين داخليتين. تحت الإضاءة المائلة ، تصور الخطوط العريضة للأذن الداخلية. إزالة الأنسجة الدخيلة والدهليز.
  7. انقل القوقعة المعزولة إلى صفيحة قاعدة سيليكون سوداء مع PBS بارد مثلج. باستخدام ملقط #5 ، قشر كبسولة القوقعة الغضروفية للحصول على قناة القوقعة. حدد موقع الطبقة المتموجة (tegmentum) لقناة القوقعة الصناعية وقم بإزالتها باستخدام ملقط # 55 لفضح ضغط الدم. باستخدام ملقط # 55 ، قم بإزالة الغشاء التكتوري لفضح HCs و SCs.

3. ثقافة نباتات الحليمة القاعدية

  1. ثقافة الغشاء من BP
    1. خذ صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من ستة آبار وقم بترتيب إدراج غشاء زراعة واحد لكل بئر.
    2. اجمع الحليمة القاعدية المشرحة (explant) في ماصة 200 ميكرولتر مع 1x HBSS عازلة ونقلها إلى غشاء. لمنع الأنسجة من الالتصاق بجدار الماصة ، ارسم بعض الوسائط قبل استنشاق المنديل.
    3. قم بتوجيه الزرع بحيث تكون الحليمة القاعدية متجهة لأعلى ، بحيث يكون الشعر وخلايا الدعم مرئية من أعلى29. بمجرد وضع النبات ، قم بشفط المخزن المؤقت HBSS ببطء من سطح غشاء الثقافة. في هذه العملية ، سوف يعلق النبات على غشاء الثقافة.
    4. أضف 1.2 مل من وسائط استزراع النسر المتوسطة المعدلة (DMEM) من Dulbecco بين ملحق الغشاء وجدار البئر لملء آبار لوحة الآبار الستة. يمكن استزراع ما يصل إلى ستة نباتات خارجية على غشاء استزراع واحد 30 مم.
  2. زراعة الكولاجين في قناة القوقعة الصناعية
    1. تحضير خليط الكولاجين عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من 3 ملغ / مل من كولاجين ذيل الجرذ ، و 50 ميكرولتر من 10x DMEM ، و 30 ميكرولتر من 7.5٪ NaHCO3 ، و 5 ميكرولتر من HEPES في غطاء زراعة الأنسجة.
    2. خذ طبقا من أربعة آبار وأضف ثلاث قطرات من خليط الكولاجين في كل بئر. انقل قناة القوقعة الإلكترونية المشرحة إلى كل قطرة كولاجين. احتضان الطبق لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لعلاج مصفوفة الكولاجين.
  3. معالجة جزيء صغير من الثقافات
    1. تحضير وسائط الاستزراع (DMEM ، مكمل N-2 ، البنسلين) إما باستخدام المغير الدوائي أو مذيبته وحدها (لاستخدامها كعنصر تحكم). استبدل وسائط الثقافة ب 700 ميكرولتر من الوسائط المكملة بالمانع. استزراع النباتات في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
    2. استبدال 50٪ من وسائل الإعلام الثقافية كل يوم. بعد وقت الحضانة المناسب ، قم بإزالة وسائط الاستزراع واستخدم النباتات الخارجية لفحوصات المصب.

4. التصوير والتحليل

  1. تحليل الفلورسنت المناعي
    1. قم بإزالة وسائط الاستزراع من الآبار واغسل النباتات مرتين باستخدام 1x HBSS. باستخدام ماصة ، أضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى البئر واحتضانه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بإزالة PFA واغسل النباتات ثلاث مرات باستخدام 1x PBS في درجة حرارة الغرفة. لجمع النباتات الخارجية من غشاء المزرعة ، قم بعمل قطع صغير حول الغشاء الذي يحتوي على قطعة من الأنسجة باستخدام مقص قوس زنبركي صغير وانقل الأنسجة مع الغشاء إلى صفيحة استزراع مكونة من 48 بئرا باستخدام الملقط.
      ملاحظة: إذا كانت الأنسجة تطفو بعد التثبيت ، فقم بشفطها باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ونقلها إلى ألواح 48 بئرا لمزيد من المعالجة. تجنب الانفصال القوي للأنسجة عن الغشاء.
    3. لزراعة قطرات الكولاجين ، استخدم الملقط لنقل قطرة الكولاجين بأكملها إلى صفيحة السيليكون. أضف 200 ميكرولتر من 1x PBS وقم بإزالة الكولاجين بمساعدة ملقط ، ثم انقل الأنسجة إلى لوحة ثقافة 48 بئرا.
    4. قم باختراق النباتات الخارجية باستخدام 1 مل من 1x PBS المكمل ب 0.3٪ Tween-20 (PBST) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. احتضان النباتات مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب (10٪ مصل الماعز + 1٪ ألبومين مصل الأبقار في PBST) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    5. احتضان النباتات الخارجية ب 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولي (1: 300 ، في مانع العازلة) طوال الليل عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل النباتات جيدا لمدة 5 × 20 دقيقة باستخدام PBST.
    6. احتضان explants مع 200 ميكرولتر من phalloidin ومحلول الأجسام المضادة الثانوي (في مانع عازلة) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. قم بإزالة القضيب ومحلول الأجسام المضادة الثانوي واغسل النباتات جيدا لمدة 5 × 20 دقيقة باستخدام PBST.
      ملاحظة: يجب تحديد تركيز الأجسام المضادة الثانوي وطول الغسيل لكل تطبيق تصوير فردي. بالنسبة للتصوير باستخدام الفحص المجهري فائق الدقة ، نزيد عادة تركيز الجسم المضاد الثانوي من 1: 500 إلى 1: 200 ونزيد تركيز القضيب من 1: 400 إلى 1: 200.
    7. احتضان النباتات بمحلول DAPI (1: 1000 في PBST) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول DAPI واغسل النباتات 3 × 5 دقائق باستخدام PBST.
    8. استخدم وسائط التركيب لتركيب explants على شريحة مع مواجهة BP في اتجاه تصاعدي (مقابل غطاء الغطاء). للتصوير متحد البؤر ، استخدم وسائط تركيب مضادة للتلاشي. اترك وسائط التركيب تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في الظلام. إما الصورة مباشرة أو تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية حتى التصوير.
  2. تثبيت OTOTO لتحليل SEM
    1. قم بإعداد جميع الحلول طازجة والتعامل معها وفقا لإرشادات السلامة المحلية. ثبت النباتات المستزرعة بالغشاء (من الخطوة 4.1.4) في 2.5٪ جلوتارالدهيد في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M (درجة الحموضة 7.3) مع 3 mM CaCl2. قم بإجراء التثبيت عند 4 درجات مئوية لمدة 24 إلى 72 ساعة مع تغيير المثبت كل 24 ساعة.
    2. قم بإزالة المثبت واغسل المنديل ب 0.1 متر كاكوديلات الصوديوم 3 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إصلاح ثانوي مع 1٪ OsO 4 (مخفف من مخزون 4٪ OsO4 باستخدام 0.1 M محلول كاكوديلات الصوديوم) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. نفذ هذا والخطوات اللاحقة حتى الجفاف في غطاء الدخان.
    3. شطف باستخدام 0.1 M كاكوديلات الصوديوم عازلة 3 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم شطف في الماء المقطر المزدوج أو فائق النقاء 3 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. تحضير محلول 0.5 ٪ من ثيوكاربوهيدرازيد (TCH) في الماء عالي النقاء. يقلب على حرارة 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ويصفى المحلول عندما يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: TCH خطير للغاية. يجب الموافقة على الاستخدام من قبل لجنة السلامة المحلية ، ويجب توخي الحذر عند المناولة.
    5. قم بإزالة الماء عالي النقاء من العينة وأضف 0.5٪ TCH قطرة قطرة. إذا تحول المحلول إلى اللون البني ، فتوقف عن العينة واشطفها بماء عالي النقاء ، قبل إضافة محلول TCH 0.5٪ بعناية. بمجرد أن يصبح الحل واضحا ، استبدله ب 0.5٪ TCH. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة30،31.
    6. شطف العينة بالماء عالي النقاء 3 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوات 4.2.2 و 4.2.3 و 4.2.5 مرتين أخريين تنتهي بحضانة OsO4 متبوعة بالشطف.
    7. قم بتجفيف العينات في سلسلة الإيثانول إلى الإيثانول اللامائي بنسبة 100٪ (EtOH). احتضان أولا في 25٪ ETOH لمدة 10 دقائق ، ثم 50٪ ETOH لمدة 10 دقائق ، 75٪ EtOH لمدة 10 دقائق ، 95٪ ETOH لمدة 10 دقائق ، قبل الحضانة لما مجموعه 3x لمدة 10 دقائق لكل منها في 100٪ ETOH.
    8. قم بإجراء تجفيف النقطة الحرجة باستخدام سائل CO2. قم بتركيب العينات على الفور على كعب SEM بشريط لاصق من الكربون على الوجهين. انتقل إلى معطف الرش لتوفير 5-10 نانومتر من الطلاء. إذا لم يتم التصوير على الفور ، فقم بتخزين العينات في مجفف تحت الفراغ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في إعداد التثقيب الكهربائي ، يمكن أن يلعب تحديد موضع القطب دورا في مجال النقل. يتم وضع القطب الموجب تحت صفار البيض ، والسالب فوق الجنين (الشكل 1 أ). ينتج عن هذا تعبير GFP أعلى في جزء كبير من الأذن الداخلية وكلا الجهازين الدهليزيين (الشكل 1B) ، والحليمة القاعدية ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الفرخ هو إضافة فعالة من حيث التكلفة ومريحة للكائنات النموذجية التي قد يستخدمها المختبر للبحث في الأذن الداخلية. تستخدم الطرق الموضحة هنا بشكل روتيني في مختبرنا وتكمل الأبحاث الجارية في الأذن الداخلية للثدييات. في التثقيب الكهربائي للبيض يستخدم لإدخال التلاعب الجيني في جينوم الفرخ. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للكشف عنها.

Acknowledgements

نحن نعترف بامتنان بالدعم المقدم من NCBS و TIFR و Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant و DST-SERB والمعهد الوطني الملكي للصم. نود أن نشكر المنظمة المركزية لتنمية الدواجن ومعهد التدريب ، هيساراغاتا ، بنغالورو. نحن ممتنون لمرافق CIFF و EM ودعم المختبرات في NCBS. نشكر يوشيكو تاكاهاشي وكويتشي كاواكامي على بنيات Tol2-eGFP و T2TP ، وجاي ريتشاردسون على الجسم المضاد HCA و G19 Pcdh15. نحن ممتنون لأعضاء Earlab لدعمهم المستمر وملاحظاتهم القيمة على البروتوكول.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3Integrated DNA Technologies1081061High fidelity Cas9 protein
Anti-GFP antibodyAbcamab290Rabbit polyclonal to GFP
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647
Calcium Chloride DihydrateThermo Fisher ScientificQ12135
Collagen I, rat tailThermo Fisher ScientificA1048301
Critical Point Dryer Leica EM CPD300Leica
CUY-21 ElectroporatorNepagene
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
DM5000B Widefield MicroscopeLeica
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvateThermo Fisher Scientific10569010
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-20
Dumont #55 ForcepsFine Science Tools11255-20
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252
FluoroshieldSigma-AldrichF6182
FLUOVIEW 3000 Laser Scanning MicroscopeOlympus
Glutaraldehyde (25 %)Sigma-Aldrich340855
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11001
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11032
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11008
Goat Serum Sterile filteredHiMediaRM10701Heat inactivated
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific14025092
LSM980 Airyscan MicroscopeZeiss
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µmSigma-AldrichPICM03050
MVX10 Stereo MicroscopeOlympus
MYO7A antibodyDSHB138-1Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa
MZ16 Dissecting microscopeLeica
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502048
Noyes Scissors, 14cm (5.5'')World Precision Instruments501237
Osmium tetroxide (4%)Sigma-Aldrich75632
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PC-10 PullerNarishige
pcU6_1sgRNAAddgene92395Mini vector with modified chicken U6 promoter
Penicillin G sodium saltSigma-AldrichP3032
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36934
SMZ1500 Dissecting microscopeNikon
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2MElectron Microscopy Sciences11652
Sodium chlorideHiMediaGRM853
Sputtre Coater K550XEmitech
Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No FilamentWorld Precision Instruments1B100-3
SucroseSigma-Aldrich84097
The MERLIN Compact VPZeiss
ThiocarbohydrazideAlfa AesarL01205
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379

References

  1. Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19(2015).
  2. Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
  3. Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
  4. Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142(2019).
  5. Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
  6. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
  7. Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
  8. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1(2012).
  9. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833(2016).
  10. Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
  11. Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
  12. Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
  13. Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
  14. Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
  15. Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
  16. Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
  17. Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
  18. Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
  19. Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
  20. Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
  21. Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
  22. Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994(2020).
  23. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  24. Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
  26. Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
  27. Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
  28. Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
  29. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).
  30. Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
  31. Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
  32. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  33. Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
  34. Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
  35. Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
  36. Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
  37. Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
  38. Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
  39. Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved