In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs

Zusammenfassung

Das Küken ist ein kostengünstiger, zugänglicher und weit verbreiteter Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien. Hier wird eine Reihe von Protokollen detailliert beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Regeneration des Vogelinnenohrs zugrunde liegen.

Zusammenfassung

Das Innenohr nimmt Geräusche wahr und hält das Gleichgewicht über die Cochlea und den Vorraum aufrecht. Dies geschieht durch die Verwendung eines dedizierten mechanosensorischen Zelltyps, der als Haarzelle bekannt ist. Die Grundlagenforschung im Innenohr hat zu einem tiefen Verständnis geführt, wie die Haarzellen funktionieren und wie Dysregulation zu Hörverlust und Schwindel führen kann. Für diese Forschung war die Maus das herausragende Modellsystem. Mäuse haben jedoch, wie alle Säugetiere, die Fähigkeit verloren, Haarzellen zu ersetzen. Wenn man also versucht, zelluläre Therapien zur Wiederherstellung der Innenohrfunktion zu verstehen, könnten ergänzende Studien an anderen Wirbeltierarten weitere Erkenntnisse liefern. Das auditorische Epithel von Vögeln, die Basilarpapille (BP), ist eine Epithelschicht, die aus mechanosensorischen Haarzellen (HCs) besteht, die von Stützzellen (SCs) interkaliert werden. Obwohl sich die anatomische Architektur der Basilarpapille und der Säugetier-Cochlea unterscheidet, sind die molekularen Mechanismen der Innenohrentwicklung und des Hörens ähnlich. Dies macht die Basilarpapille zu einem nützlichen System nicht nur für vergleichende Studien, sondern auch für das Verständnis der Regeneration. Hier beschreiben wir Sezier- und Manipulationstechniken für das Hühnerinnenohr. Die Technik zeigt genetische und niedermolekulare Hemmungsmethoden, die ein potentes Werkzeug zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der Innenohrentwicklung bieten. In diesem Artikel diskutieren wir in Ovo-Elektroporationstechniken, um die Basilarpapille unter Verwendung von CRIPSR-Cas9-Deletionen genetisch zu stören, gefolgt von der Dissektion der Basilarpapille. Wir demonstrieren auch die BP-Organkultur und die optimale Verwendung von Kulturmatrices, um die Entwicklung des Epithels und der Haarzellen zu beobachten.

Einleitung

Das Innenohr aller Wirbeltiere leitet sich von einem einfachen Epithel ab, das als otische Placode ^1,2 bekannt ist. Dadurch entstehen alle strukturellen Elemente und Zelltypen, die notwendig sind, um die mechanosensorischen Informationen zu übertragen, die mit dem Hören und der Gleichgewichtswahrnehmung verbunden sind. Haarzellen (HCs), der Flimmersensor des Innenohrs, sind von Stützzellen (SCs) umgeben. HCs leiten Informationen über die Neuronen des achten Hirnnervs an das auditorische Hinterhirn weiter. Diese werden ebenfalls aus dem otischen Placode³ generiert. Die primäre Schalltransduktion wird an der apikalen Oberfläche des auditorischen HC durch ein mechanisch empfindliches Haarbündel⁴ erreicht. Dies wird durch modifizierte Aktin-basierte Vorsprünge, sogenannte Stereozilien, vermittelt, die in einem abgestuften Treppenmuster^{angeordnet sind 5}. Darüber hinaus organisiert ein modifiziertes primäres Zilium, das sogenannte Kinocilium, die Haarbündelbildung und grenzt an die höchste Reihe von Stereozilien ^6,7,8. Die Architektur der Stereozilien ist entscheidend für diese Rolle bei der Umwandlung mechanischer Reize, die von akustischer Energie in elektrische neuronale Signale abgeleitet werden⁹. Eine Schädigung des auditiven HC durch Alterung, Infektion, otoakustisches Trauma oder ototoxischer Schock kann zu einem teilweisen oder vollständigen Hörverlust führen, der bei Säugetieren irreversibel ist¹⁰.

Es wurden zelluläre Ersatztherapien vorgeschlagen, die solche Schäden reparieren könnten^11,12. Der Ansatz dieser Forschung bestand darin, die normale Entwicklung der Haarzelle von Säugetieren zu verstehen und zu fragen, ob Entwicklungsprogramme in vorläuferähnlichen Zellen, die im Innenohr existieren können, wieder aufgenommen werden können¹³. Ein zweiter Ansatz bestand darin, außerhalb von Säugetieren auf Nicht-Säugetier-Wirbeltiere zu schauen, bei denen eine robuste Regeneration von Gehörhaarzellen stattfindet, wie z.B. Vögel^14,15. Bei Vögeln erfolgt die Haarzellregeneration überwiegend durch die Dedifferenzierung einer Stützzelle in einen vorläuferähnlichen Zustand, gefolgt von einer asymmetrischen mitotischen Teilung zur Erzeugung einer Haarzelle und einer Stützzelle¹⁶. Darüber hinaus wurde auch eine direkte Differenzierung einer Stützzelle zur Erzeugung einer Haarzelle beobachtet¹⁷.

Während die Mechanismen der auditiven Entwicklung von Vögeln signifikante Ähnlichkeiten mit denen von Säugetieren aufweisen, gibt es Unterschiede¹⁸. Die HC- und SC-Differenzierung beim Küken-BP ist ab dem embryonalen Tag (E) 7 erkennbar und wird im Laufe der Zeit deutlicher. Durch E12 kann eine gut strukturierte und gut polarisierte Basilarpapille (BP) sichtbar gemacht werden, und durch E17 können gut entwickelte Haarzellen gesehen werden¹⁹. Diese Zeitpunkte bieten Fenster in die Mechanismen der Differenzierung, Strukturierung und Polarität sowie in die Reifung der Haarzellen. Es ist wichtig zu verstehen, ob solche Mechanismen konserviert oder divergent sind, da sie Einblicke in die tiefe Homologie der Ursprünge mechanosensorischer Haarzellen geben.

Hier demonstrieren wir eine Reihe von Techniken, die in frühen und späten embryonalen Stadien durchgeführt werden, um zelluläre Prozesse wie Proliferation, Schicksalsspezifikation, Differenzierung, Musterung und Aufrechterhaltung während der gesamten Entwicklung des Innenohrorgans zu untersuchen. Dies ergänzt andere Protokolle zum Verständnis der Innenohrentwicklung in der Explantatkultur^20,21,22. Wir diskutieren zunächst die Einführung von exogener DNA oder RNA in BP-Vorläufer innerhalb der E3.5-Otozyste unter Verwendung der In-Ovo-Elektroporation. Obwohl genetische Manipulationen wertvolle Erkenntnisse liefern können, können die so erzeugten Phänotypen pleiotrop und folglich verwirrend sein. Dies gilt insbesondere für die spätere Innenohrentwicklung, wo grundlegende Prozesse wie der Umbau des Zytoskeletts vielfältige Rollen bei der Zellteilung, der Gewebemorphogenese und der zellulären Spezialisierung spielen. Wir präsentieren Protokolle zur pharmakologischen Hemmung in kultivierten Explantaten, die Vorteile bei der Kontrolle von Dosierung und Behandlungszeitpunkt und -dauer bieten und eine präzise raumzeitliche Manipulation von Entwicklungsmechanismen ermöglichen.

Je nach Behandlungsdauer kleiner Inhibitoren können unterschiedliche Organkulturmethoden eingesetzt werden. Hier zeigen wir zwei Methoden der Organkultur, die Einblicke in die epitheliale Morphogenese und zelluläre Spezialisierung ermöglichen. Eine Methode zur 3D-Kultur mit Kollagen als Matrix zur Kultur des Cochlea-Gangs ermöglicht eine robuste Kultivierung und Live-Visualisierung des sich entwickelnden BP. Um die Bildung von Stereozilien zu verstehen, stellen wir eine Membrankulturmethode vor, bei der Epithelgewebe auf einer steifen Matrix kultiviert wird, so dass Aktinvorsprünge frei wachsen können. Beide Methoden ermöglichen die Weiterverarbeitung wie Lebendzellbildgebung, Immunhistochemie, Rasterelektronenmikroskopie (REM), Zellaufzeichnung usw. Diese Techniken bieten eine Roadmap für die effektive Nutzung des Kükens als Modellsystem, um die Entwicklung, Reifung und Regeneration des aviären Gehörepithels zu verstehen und zu manipulieren.

Protokoll

Protokolle, die die Beschaffung, Kultur und Verwendung von befruchteten Hühnereiern und nicht geschlüpften Embryonen beinhalten, wurden von der Institutional Animal Ethics Committee des National Centre for Biological Sciences, Bengaluru, Karnataka, genehmigt.

1. Bei der Elektroporation von Gehörvorläufern von Küken

1. sgRNA-Design und Klonierung für CRISPR/Cas9-Gen-Knockout
   1. Um Gen-Knockouts zu erzeugen, entwerfen Sie RNAs, um die Exon-Regionen des Gens zu stören, vorzugsweise näher am 5'-Ende der kodierenden Region.
   2. Wählen Sie die potentiellen Guide-RNAs mit einem Web-Tool CRISPOR²³ aus. Stellen Sie die Browserdaten auf Gallus gallus und die Protospacer-Nachbarmotivsequenz (PAM) auf 5'- NGG -3' ein. Das Programm bestimmt Guide-RNAs aus der Eingangssequenz und weist unterschiedliche Scores basierend auf On-Target- und Off-Target-Aktivität zu. Wählen Sie die vier besten Leitfäden für weitere Studien aus.
   3. Für das Design von vorlagenspezifischen Oligos für die Guide-(g)RNA-Produktion entfernen Sie die PAM-Sequenz (5′- NGG -3′) aus der Ausgabe des gRNA-Design-Tools. Diese wird für das Targeting nicht benötigt, enthält aber die Cas9-Spaltungserkennungssequenz. Synthese von zwei HPLC-gereinigten komplementären Oligos mit BsmBI-Restriktionsstelle an beiden Enden für jede potentielle gRNA.
   4. Klonen Sie die Führungssequenz im Rahmen mit einem tracrRNA-Gerüst eines Vektors Ihrer Wahl (hier wurde pcU6_1sgRNA Vektor verwendet²⁴).
   5. Die sgRNA-Oligonukleotide werden in einer Konzentration von 100 μM in DNase/RNase-freiem Wasser gelöst. Führen Sie das Glühen der beiden Sensor- und Antisense-Oligoführungen mit einem Thermocycler mit folgenden Parametern durch: 95 °C für 3 min, dann 37 °C für 15 min und dann auf 4 °C abnehmen.
   6. Unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken, wie in²⁵ beschrieben, Restriktionsverdauung der geglühten Oligos und pcU6_1sgRNA Klonierungsvektor mit BsmBI-Enzym über Nacht. Setup-Ligation mit dem gelgereinigten linearen BsmBI-verdauten pcU6_1sgRNA-Vektor und den aufgeschlossenen sgRNA-Oligos. Verwandeln Sie sich in eine DH5-alpha-kompetente Zelle und bestätigen Sie die Sequenz des erhaltenen Klons.
2. Handhabung und Fensterung von Eiern
   1. Beschaffen Sie frisch gelegte Eier und reinigen Sie sie, indem Sie sie mit 70% Ethanol abwischen, um eine Kontamination zu vermeiden. Bei 37-38 °C bei 45% Luftfeuchtigkeit 3,5-4 Tage inkubieren.
   2. Nach der Inkubation legen Sie das Ei für mindestens 5 Minuten auf die Seite, bevor Sie es öffnen. Dies ermöglicht es dem Embryo, sich an die Spitze des Eigelbs zu positionieren. Verwenden Sie eine Pinzette, um kleine Löcher am oberen und stumpfen Ende des Eies zu machen, so dass eine 21G-Nadel hindurchgehen kann.
   3. Um Schäden während des Fensters zu vermeiden, entfernen Sie Albumin, um den Embryo von der Schale wegzusenken. Verwenden Sie dazu eine 5-ml-Spritze und eine 21G-Nadel, um vorsichtig 2 ml Albumin aus einem Loch am stumpfen Ende des Eies zu ziehen. Verwenden Sie durchsichtiges Klebeband, um das Loch am stumpfen Ende abzudecken.
   4. Um das Eierfenster zu machen, befestigen Sie durchsichtiges Klebeband an der Oberseite der Eierschale. Schneiden Sie ein etwa 2 cm langes und 1,5 cm breites Fenster mit einer Federbogenschere auf und legen Sie den Embryo frei. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Chorionmembranen über dem Embryo zu öffnen, um den Zugang zum Embryo zu ermöglichen.
3. Mikroinjizierende Plasmide
   1. Für das Gen-Knockout-Experiment bereiten Sie zwei Lösungen vor: die Knock-Down-Mischung mit SpCas9-Protein und Guide-Plasmid-pcU6_1sgRNA und die Tracerplasmidmischung aus T2K-eGFP (dies ist ein Chick-ß-Aktin-Promotor, der die GFP-Kassette antreibt, umgeben von den Transposonstellen von Tol2) zusammen mit der T2TP (die Tol2-Transposase, die in Tol2-Konstrukt^26,27 kloniert wurde). Der Tracer wird verwendet, um die Effizienz der Elektroporation zu verfolgen.
   2. Stellen Sie bei der Elektropolierung mehrerer Plasmide sicher, dass die Endkonzentration der DNA mindestens 4 μg/μL beträgt. Mischen Sie die drei Konstrukte Leitplasmid - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP und T2TP im Verhältnis 1:1:1 mit 1 μg SpCas9-Protein, 30% Saccharose und 0,1% Fast Green-Farbstoff in einem Endvolumen von 10 μL.
   3. Ziehen Sie Nadeln für die Mikroinjektion aus Standardglaskapillaren (Länge 3 Zoll, OD 1,0 mm) mit einem vertikalen Pipettenzieher. Verwenden Sie feine Pinzetten, um die Kapillarspitze nach dem Ziehen abzubrechen, um einen Spitzendurchmesser von ca. 50 μm mit einem konischen Ende zu erhalten.
   4. Legen Sie die Embryonen bei E3.5 auf ihre linke Seite mit dem Kopf nach rechts. Auf diese Weise ist nur das richtige otische Vesikel für die Mikroinjektion zugänglich. Mikroinjizieren Sie die Knock-Down-Mischung in das otische Vesikel. Injizieren Sie etwa 200 nL Volumen DNA-Lösungsmischung, um das otische Vesikel zu füllen.
   5. Bestimmung der Leiteffizienz unter Verwendung eines T7-Endonuklease-Assays²⁸.
4. Elektroporation
   1. Fügen Sie vor der Elektroporation einige Tropfen 0,719% Kochsalzlösung auf den Embryo hinzu, um den elektrischen Widerstand zu senken und eine Überhitzung des Embryos zu verhindern.
   2. Führen Sie die positive Elektrode durch das Loch, das an der stumpfen Seite des Eies gemacht wurde, als das Albumin entfernt wurde. Manövrieren Sie die Elektrode so, dass sie sich unter dem Eigelb befindet. Legen Sie die negative Elektrode über die gefüllte Otozyste.
   3. Verwenden Sie die Elektroporation, um Plasmide in die Zellen des Embryos zu transfizieren. Verwenden Sie einen quadratischen Impulsgenerator und wenden Sie fünf Impulse von jeweils 25 V und 100 ms Dauer im Abstand von 50 ms an. Bestimmen Sie die Bedingungen empirisch basierend auf einem individuellen Elektroporationsaufbau.
   4. Hydratisieren Sie den Embryo nach der Elektroporation, indem Sie einige Tropfen 0,719% Kochsalzlösung hinzufügen. Um denaturiertes Albumin von der Oberfläche der Elektroden zu reinigen, spülen Sie es gründlich mit destilliertem Wasser ab. Verschließen Sie das Ei mit durchsichtigem Klebeband wieder und kehren Sie zur weiteren Inkubation bei 37-38 °C in den befeuchteten Inkubator zurück.
      HINWEIS: Embryonen können bis zum Schlüpfen nach der Elektroporation kultiviert werden, es gibt jedoch eine starke Verringerung der Lebensfähigkeit.

2. Basilarpapille Dissektion

1. Verwenden Sie 70% Ethanol, um den OP-Tisch, den Mikroskoptisch und die Umgebung zu desinfizieren. Hitze oder Alkohol sterilisieren Mikrodissektionsgeräte, die eine minimale Federbogenschere, eine Mikrokürette und zwei Paar feine Pinzetten enthalten.
2. Bereiten Sie die folgenden Präparierplatten vor: eine Glas-Petrischale mit schwarzer Silikonbasis, eine 90-mm-Kunststoff-Petrischale und eine 60-mm-Petrischale. Kühlen Sie entweder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) für Dissektionen.
3. Knacken Sie das Ei vorsichtig in die 90 mm Petrischale. Identifizieren Sie das äußere Ohr des Kükens. Enthaupten Sie den Embryo, indem Sie den Hals mit einer Schere knapp unter die Höhe des Unterkiefers schneiden. Den Kopf in eine 60 mm große Petrischale geben, die mit eiskaltem PBS gefüllt ist.
4. Richten Sie den Embryo mit der Spitze des Schnabels zum Experimentator aus und halten Sie den Schnabel mit einer der #5-Pinzetten. Schöpfen Sie die Augen mit der zweiten #5 Pinzette aus. Gehen Sie von rostral zu kaudal, schneiden Sie den Schädel entlang seiner Mittellinie. Schöpfen Sie das Gehirn aus.
5. Fügen Sie mehr eiskaltes PBS oder HBSS hinzu und lokalisieren Sie die beiden glänzenden Strukturen in der Nähe der Höhe der Ohrmuschel. Dies sind die Otolithen der Lagena am Ende des Cochlea-Gangs und befinden sich nahe der Mittellinie.
6. Schneiden Sie grob zwischen den beiden Lagenas und weit über und unter dieser Region, um zwei Innenohren zu isolieren. Visualisieren Sie unter schräger Beleuchtung die Umrisse des Innenohrs. Entfernen Sie Fremdgewebe und den Vorraum.
7. Übertragen Sie die isolierte Cochlea auf eine schwarze Silikongrundplatte mit eiskaltem PBS. Ziehen Sie mit einer Pinzette #5 die knorpelige Cochlea-Kapsel ab, um den Cochlea-Gang zu erhalten. Suchen Sie die wellenförmige Schicht (Tegmentum) des Cochlea-Gangs und entfernen Sie sie mit einer #55-Pinzette, um den BP freizulegen. Entfernen Sie mit einer Zange #55 die tektoriale Membran, um HCs und SCs freizulegen.

3. Kultur von Basilarpapille-Explantaten

1. Membrankultur des BP
   1. Nehmen Sie eine Gewebekulturplatte mit sechs Vertiefungen und ordnen Sie einen Kulturmembraneinsatz pro Vertiefung an.
   2. Die sezierte Basilarpapille (Explantat) in einer 200 μL Pipette mit 1x HBSS-Puffer auffangen und auf eine Membran übertragen. Um zu verhindern, dass das Gewebe an der Wand der Pipette klebt, ziehen Sie einige Medien auf, bevor Sie das Gewebe absaugen.
   3. Richten Sie die Explantat so aus, dass die Basilarpapille nach oben zeigt, so dass die Haare und Stützzellen von oben²⁹ sichtbar sind. Sobald die Explantat positioniert ist, saugen Sie den HBSS-Puffer langsam von der Oberfläche der Kulturmembran ab. In diesem Prozess wird sich die Explantat an die Kulturmembran anheften.
   4. Fügen Sie 1,2 ml des modifizierten Eagle-Medium-Kulturmediums (DMEM) von Dulbecco zwischen dem Membraneinsatz und der Bohrlochwand hinzu, um die Vertiefungen der Sechs-Well-Platte zu füllen. Bis zu sechs Explantate können auf einer einzigen 30 mm Kulturmembran kultiviert werden.
2. Kollagenkultur des Cochlea-Gangs
   1. Bereiten Sie die Kollagenmischung durch Zugabe von 400 μL 3 mg/ml Rattenschwanzkollagen, 50 μL 10x DMEM, 30 μL 7,5% NaHCO₃ und 5 μL HEPES in einer Gewebekulturhaube vor.
   2. Nehmen Sie eine Vier-Well-Platte und fügen Sie drei Tropfen Kollagenmischung in jede Vertiefung hinzu. Übertragen Sie den präparierten Cochlea-Gang auf jeden Kollagentropfen. Inkubieren Sie die Platte für 10 min bei 37 °C, 5%_CO2 , um die Kollagenmatrix auszuhärten.
3. Kleinmolekulare Behandlung von Kulturen
   1. Bereiten Sie Kulturmedien (DMEM, N-2-Ergänzung, Penicillin) entweder mit dem pharmakologischen Modulator oder seinem Lösungsmittel allein (zur Verwendung als Kontrolle) vor. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch 700 μL Medien, die mit dem Inhibitor ergänzt sind. Kultur der Explantate in einem Inkubator bei 37 °C, 5% CO₂.
   2. Ersetzen Sie jeden Tag 50% der Kulturmedien. Nach angemessener Inkubationszeit werden die Nährmedien entfernt und die Explantate für nachgeschaltete Assays verwendet.

4. Bildgebung und Analyse

1. Immunfluoreszenzanalyse
   1. Nährmedien aus Vertiefungen entfernen und die Explantate zweimal mit 1x HBSS waschen. Mit einer Pipette 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in die Vertiefung geben und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   2. Entfernen Sie PFA und waschen Sie die Explantate dreimal mit 1x PBS bei Raumtemperatur. Um die Explantate von der Kulturmembran zu sammeln, machen Sie einen kleinen Schnitt um die Membran, die das Stück des Gewebes enthält, mit einer kleinen Federbogenschere und übertragen Sie das Gewebe zusammen mit der Membran mit einer Pinzette auf eine 48-Well-Kulturplatte.
      HINWEIS: Wenn das Gewebe nach der Fixierung schwimmt, aspirieren Sie mit einer 200 μL Pipette und übertragen Sie sie zur weiteren Verarbeitung auf 48-Well-Platten. Vermeiden Sie eine gewaltsame Ablösung des Gewebes von der Membran.
   3. Verwenden Sie für die Kollagentröpfchenkultur eine Pinzette, um den gesamten Kollagentropfen auf eine Silikonplatte zu übertragen. Fügen Sie 200 μL 1x PBS hinzu und entfernen Sie Kollagen mit Hilfe einer Pinzette und übertragen Sie dann das Gewebe auf eine 48-Well-Kulturplatte.
   4. Permeabilisieren Sie die Explantate mit 1 mL 1x PBS ergänzt mit 0,3% Tween-20 (PBST) für 30 min bei Raumtemperatur. Die Explantate mit 200 μL Blockierpuffer (10% Ziegenserum + 1% Rinderserumalbumin in PBST) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
   5. Die Explantate mit 200 μL primärer Antikörperlösung (1:300, im Blockierpuffer) über Nacht bei 4 °C inkubieren. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Explantate gründlich 5 x 20 min mit PBST.
   6. Die Explantate mit 200 μL Phalloidin und sekundärer Antikörperlösung (im Blockierpuffer) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Entfernen Sie das Phalloidin und die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie die Explantate gründlich 5 x 20 min mit PBST.
      HINWEIS: Die sekundäre Antikörperkonzentration und die Waschlänge müssen für jede einzelne bildgebende Anwendung bestimmt werden. Für die Bildgebung mit hochauflösender Mikroskopie erhöhen wir typischerweise die Konzentration des sekundären Antikörpers von 1:500 auf 1:200 und erhöhen die Konzentration von Phalloidin von 1:400 auf 1:200.
   7. Inkubieren Sie die Explantate mit einer Lösung von DAPI (1:1000 in PBST) für 15 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Explantate 3 x 5 min mit PBST.
   8. Verwenden Sie die Montagemedien, um Explantate auf einem Objektträger mit BP nach oben (gegen das Deckglas) zu montieren. Für konfokale Bildgebung verwenden Sie Antifade-Montagemedien. Lassen Sie die Montagemedien über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen. Bilder Sie entweder direkt oder lagern Sie die Dias bis zur Bildgebung bei 4 °C.
2. OTOTO-Fixierung für die REM-Analyse
   1. Bereiten Sie alle Lösungen frisch vor und handhaben Sie sie gemäß den lokalen Sicherheitsrichtlinien. Membrankultivierte Explantate (aus Schritt 4.1.4) in 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,3) mit 3 mM CaCl₂ fixieren. Die Fixierung bei 4 °C für 24 bis 72 h mit einem Wechsel des Fixiermittels alle 24 h durchführen.
   2. Entfernen Sie das Fixiermittel und waschen Sie das Gewebe mit 0,1 M Natriumcacodylat 3 x 5 min bei Raumtemperatur. Sekundäre Lösung mit 1% OsO4 (verdünnt aus einem 4%_OsO4-Bestand unter Verwendung von 0,1 M Natriumcacodylatpuffer) für 1 h bei Raumtemperatur. Führen Sie diese und die nachfolgenden Schritte bis zur Dehydrierung in einem Abzug durch.
   3. Mit 0,1 M Natriumcacodylatpuffer 3 x 5 min bei Raumtemperatur abspülen. Anschließend in doppelt destilliertem oder Reinstwasser 3 x 5 min bei Raumtemperatur abspülen.
   4. Bereiten Sie eine 0,5% ige Lösung von Thiocarbohydrazid (TCH) in Reinstwasser vor. Bei 75 °C 10 min umrühren und die Lösung filtrieren, wenn sie auf Raumtemperatur abgekühlt ist.
      HINWEIS: TCH ist extrem gefährlich. Die Verwendung muss vom örtlichen Sicherheitsausschuss genehmigt werden, und bei der Handhabung ist Vorsicht geboten.
   5. Entfernen Sie Reinstwasser aus der Probe und fügen Sie 0,5% TCH Tropfen für Tropfen hinzu. Wenn die Lösung braun wird, stoppen und spülen Sie die Probe mit Reinstwasser, bevor Sie vorsichtig die 0,5% ige TCH-Lösung hinzufügen. Sobald die Lösung klar ist, ersetzen Sie sie durch 0,5% TCH. Bei Raumtemperatur 20 min^30,31 inkubieren.
   6. Spülen Sie die Probe mit Reinstwasser 3 x 5 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.2, 4.2.3 und 4.2.5 noch zwei weitere Male und enden Sie mit einer OsO 4-Inkubation und anschließendem Spülen.
   7. Dehydrieren Sie die Proben in einer Ethanolserie zu 100% wasserfreiem Ethanol (EtOH). Inkubieren Sie zuerst in 25% ETOH für 10 min, dann 50% ETOH für 10 min, 75% EtOH für 10 min, 95% ETOH für 10 min, bevor sie insgesamt 3x für jeweils 10 min in 100% ETOH inkubieren.
   8. Führen Sie eine kritische Punkttrocknung mit flüssigem_CO2 durch. Montieren Sie die Proben sofort auf einem REM-Stummel mit doppelseitigem Kohleklebeband. Fahren Sie mit der Sputterschicht fort, um 5-10 nm Beschichtung bereitzustellen. Wenn Sie nicht sofort bildgeben, lagern Sie die Proben in einem Exsikkator unter Vakuum.

Ergebnisse

Im Elektroporationsaufbau kann die Elektrodenpositionierung eine Rolle im Bereich der Transfektion spielen. Die positive Elektrode wird unter das Eigelb und die negative über dem Embryo platziert (Abbildung 1A). Dies führt zu einer höheren GFP-Expression in einem Großteil des Innenohrs und beider vestibulären Organe (Abbildung 1B) und der auditorischen Basilarpapille (Abbildung 1C,D), was die Transfektion best?...

Diskussion

Das Küken ist eine kostengünstige und bequeme Ergänzung zu den Modellorganismen, mit denen ein Labor das Innenohr erforschen kann. Die hier beschriebenen Methoden werden routinemäßig in unserem Labor eingesetzt und ergänzen die laufende Forschung im Innenohr von Säugetieren. In der Ovo wird Elektroporation verwendet, um genetische Manipulationen in das Kükengenom einzuführen. Die Elektroporation kann auch verwendet werden, um Konstrukte einzuführen, die fluoreszierende Proteine kodieren, die auf bestim...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3	Integrated DNA Technologies	1081061	High fidelity Cas9 protein
Anti-GFP antibody	Abcam	ab290	Rabbit polyclonal to GFP
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Calcium Chloride Dihydrate	Thermo Fisher Scientific	Q12135
Collagen I, rat tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301
Critical Point Dryer Leica EM CPD300	Leica
CUY-21 Electroporator	Nepagene
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DM5000B Widefield Microscope	Leica
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10569010
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252
Fluoroshield	Sigma-Aldrich	F6182
FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope	Olympus
Glutaraldehyde (25 %)	Sigma-Aldrich	340855
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11001
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008
Goat Serum Sterile filtered	HiMedia	RM10701	Heat inactivated
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14025092
LSM980 Airyscan Microscope	Zeiss
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Sigma-Aldrich	PICM03050
MVX10 Stereo Microscope	Olympus
MYO7A antibody	DSHB	138-1	Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa
MZ16 Dissecting microscope	Leica
N-2 Supplement (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502048
Noyes Scissors, 14cm (5.5'')	World Precision Instruments	501237
Osmium tetroxide (4%)	Sigma-Aldrich	75632
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PC-10 Puller	Narishige
pcU6_1sgRNA	Addgene	92395	Mini vector with modified chicken U6 promoter
Penicillin G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36934
SMZ1500 Dissecting microscope	Nikon
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M	Electron Microscopy Sciences	11652
Sodium chloride	HiMedia	GRM853
Sputtre Coater K550X	Emitech
Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament	World Precision Instruments	1B100-3
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097
The MERLIN Compact VP	Zeiss
Thiocarbohydrazide	Alfa Aesar	L01205
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379