在蛋 和 卵外 研究中研究鸟类内耳发育的方法

摘要

雏鸡是一种具有成本效益、可及且广泛可用的模式生物，可用于各种研究。在这里，详细介绍了一系列协议，以了解鸟类内耳发育和再生的分子机制。

摘要

内耳感知声音并使用耳蜗和前庭保持平衡。它通过使用称为毛细胞的专用机械感觉细胞类型来做到这一点。内耳的基础研究使人们深入了解了毛细胞的功能，以及失调如何导致听力损失和眩晕。在这项研究中，鼠标一直是杰出的模型系统。然而，像所有哺乳动物一样，小鼠已经失去了替代毛细胞的能力。因此，当试图了解恢复内耳功能的细胞疗法时，对其他脊椎动物物种的补充研究可以提供进一步的见解。鸟类的听觉上皮，基底（BP），是由机械感觉毛细胞（HC）组成的上皮片，由支持细胞（SC）插入。虽然基底和哺乳动物耳蜗的解剖结构不同，但内耳发育和听力的分子机制相似。这使得基底不仅成为比较研究的有用系统，而且有助于了解再生。在这里，我们描述了鸡内耳的解剖和操作技术。该技术显示了遗传和小分子抑制方法，为研究内耳发育的分子机制提供了有效的工具。在本文中， 我们讨论了使用 CRIPSR-Cas9缺失对基底进行遗传扰动的卵电穿孔技术，然后解剖基底。我们还展示了BP器官培养和培养基质的最佳使用，以观察上皮和毛细胞的发育。

引言

所有脊椎动物的内耳都来源于一个简单的上皮，称为耳基板^1，2。这将产生所有必要的结构元素和细胞类型，以转导与听觉和平衡感知相关的机械感觉信息。毛细胞（HCs）是内耳的纤毛传感器，被支持细胞（SCs）包围。HC通过第八颅神经的神经元将信息传递给听觉后脑。这些也是从耳基板³产生的。声音的主要转导是在听觉HC的顶端表面通过机械敏感的毛束⁴实现的。这是通过修饰的基于肌动蛋白的突起（称为立体纤毛）介导的，这些突起以分级的阶^{梯模式排列}5。此外，一种改良的初级纤毛，称为 kinocilium，组织毛束形成，并与最高的立体纤毛⁶，^7，8 行相邻。立体纤毛的结构对于将源自声能的机械刺激转换为电^{神经信号的作用}至关重要9。衰老、感染、耳声创伤或耳毒性休克对听觉HC的损害可导致部分或完全听力损失，在哺乳动物中，这是不可逆转的¹⁰。

已经提出了可能修复这种损伤的细胞替代疗法^11，12。这项研究的方法是了解哺乳动物毛细胞的正常发育，并询问是否可以在内耳内可能存在的祖细胞样细胞中重新启动发育程序¹³。第二种方法是将目光投向哺乳动物之外，寻找非哺乳动物脊椎动物，其中听觉毛细胞发生强劲再生，例如鸟类^14，15。在鸟类中，毛细胞再生主要通过支持细胞去分化为祖细胞样状态发生，然后进行不对称有丝分裂以产生毛细胞和支持细胞¹⁶。此外，还观察到支持细胞的直接分化以产生毛细胞¹⁷。

虽然鸟类听觉发育的机制确实与哺乳动物有显着相似之处，但存在差异¹⁸。雏鸡血压的HC和SC分化从胚胎第7天（E）开始就很明显，随着时间的推移变得更加明显。通过E12，可以看到图案良好且极化良好的基底（BP），通过E17可以看到发育良好的毛细胞¹⁹。这些时间点为分化、图案化和极性以及毛细胞成熟的机制提供了窗口。了解这些机制是保守的还是发散的很重要，因为它们提供了对机械感觉毛细胞起源的深层同源性的见解。

在这里，我们展示了在胚胎早期和晚期进行的一系列技术，以研究细胞过程，例如内耳器官发育过程中的增殖，命运规范，分化，模式化和维持。这补充了了解外植体培养中内耳发育的其他协议²⁰，^21，22。我们首先讨论使用卵电穿孔将外源性DNA或RNA引入E3.5耳囊内的BP前体中。尽管遗传操作可以提供有价值的见解，但由此产生的表型可能是多效性的，因此是混淆的。在后期的内耳发育中尤其如此，其中细胞骨架重塑等基本过程在细胞分裂、组织形态发生和细胞特化中起着多种作用。我们提出了培养外植体的药理学抑制方案，其在控制剂量和治疗时间和持续时间方面具有优势，提供了发育机制的精确时空操作。

根据小抑制剂的治疗持续时间，可以使用不同的器官培养方法。在这里，我们展示了两种器官培养方法，可以深入了解上皮形态发生和细胞特化。一种使用胶原蛋白作为基质来培养耳蜗导管的 3D 培养方法可实现发育中的血压的稳健培养和实时可视化。为了了解立体纤毛的形成，我们提出了一种膜培养方法，使得上皮组织在刚性基质上培养，使肌动蛋白突起能够自由生长。这两种方法都允许下游处理，例如活细胞成像，免疫组织化学，扫描电子显微镜（SEM），细胞记录等。这些技术为有效使用雏鸡作为模型系统来理解和操纵鸟类听觉上皮的发育、成熟和再生提供了路线图。

研究方案

涉及受精鸡蛋和未孵化胚胎的采购，培养和使用的方案由卡纳塔克邦班加罗尔国家生物科学中心的机构动物伦理委员会批准。

1. 在 卵电穿孔中雏 鸡听觉前体

1. 用于CRISPR/Cas9基因敲除的sgRNA设计和克隆
   1. 为了创建基因敲除，设计引导RNA破坏基因的外显子区域，最好靠近编码区域的5'端。
   2. 使用网络工具CRISPOR²³选择潜在的向导RNA。将浏览器数据设置为 Gallus gallus ，将原间隔相邻基序 （PAM） 序列设置为 5'- NGG -3'。该程序从输入序列中确定向导RNA，并根据靶标和非靶向活性分配不同的分数。选择前四个指南进行进一步研究。
   3. 对于用于引导 （g）RNA 生产的模板特异性寡核苷酸的设计，从 gRNA 设计工具输出中删除 PAM 序列 （5′- NGG -3′）。这不是靶向所必需的，但包含Cas9切割识别序列。为每个潜在的 gRNA 合成两个两端具有 BsmBI 限制性位点的 HPLC 纯化互补寡核苷酸。
   4. 使用所选载体的tracrRNA支架在框架中克隆引导序列（此处使用pcU6_1sgRNA载体²⁴）。
   5. 将 sgRNA 寡核苷酸以 100 μM 的浓度溶解在无 DNase/RNase 的水中。使用具有以下参数的热循环仪对两个义和反义寡核苷酸导轨进行退火:95°C3分钟，然后37°C15分钟，然后降至4°C。
   6. 使用²⁵中所述的标准分子生物学技术，设置退火寡核苷酸的限制性酶切，并用BsmBI酶pcU6_1sgRNA克隆载体过夜。使用凝胶纯化的线性BsmBI酶解pcU6_1sgRNA载体和酶解的sgRNA寡核苷酸建立连接。转化为DH5-α感受态细胞并序列确认获得的克隆。
2. 鸡蛋处理和窗口化
   1. 采购新鲜产下的鸡蛋，并用70%乙醇擦拭以防止污染。在37-38°C，湿度为45%的条件下孵育3.5-4天。
   2. 孵化后，在打开前将鸡蛋侧放至少 5 分钟。这允许胚胎重新定位到蛋黄的顶部。用镊子在鸡蛋的顶部和钝端打小孔，以便 21G 针头可以穿过。
   3. 为防止在开窗过程中损坏，请去除白蛋白以使胚胎远离外壳。为此，请使用 5 mL 注射器和 21G 针头小心地从鸡蛋钝端的孔中抽出 2 mL 白蛋白。使用透明胶带覆盖钝端的孔。
   4. 要制作鸡蛋窗口，请在蛋壳顶部贴上透明胶带。用弹簧弓剪刀切开一个长约2厘米，宽约1.5厘米的窗户，露出胚胎。用镊子打开覆盖在胚胎上的绒毛膜，允许进入胚胎。
3. 微量注射质粒
   1. 对于基因敲除实验，准备两种溶液:含有SpCas9蛋白和引导质粒-pcU6_1sgRNA的敲低混合物，以及T2K-eGFP（这是驱动被Tol2转座子位点包围的GFP盒的小鸡β-肌动蛋白启动子启动子）的示踪质粒混合物以及T2TP（在Tol2构建体^26，27中克隆的Tol2转座酶）。示踪剂用于跟踪电穿孔效率。
   2. 电化多个质粒时，确保DNA的最终浓度至少为4μg/μL。 将三种构建体，引导质粒 - pcU6_1sgRNA，T2K-eGFP和T2TP，以1:1:1的比例与1μgSpCas9蛋白，30%蔗糖和0.1%快绿染料混合，最终体积为10μL。
   3. 使用垂直移液器拉拔器从标准玻璃毛细管（长度 3 英寸，外径 1.0 毫米）拉出用于显微注射的针头。拉动后使用细镊子折断毛细管尖端，以获得约50μm的尖端直径和锥形末端。
   4. 将胚胎放在左侧的E3.5处，头部朝右。这样，只有正确的耳囊泡才能进行显微注射。将敲低混合物微注射到耳囊中。注射约 200 nL 体积的 DNA 溶液混合物以填充耳囊泡。
   5. 使用 T7 核酸内切酶测定法确定引导效率²⁸.
4. 电穿孔
   1. 在电穿孔之前，在胚胎顶部添加几滴0.719%盐水，以降低电阻并防止胚胎过热。
   2. 取出白蛋白时，将正极穿过鸡蛋钝侧的孔。操纵电极，使其位于蛋黄下方。将负极放在填充的耳囊上。
   3. 使用电穿孔将质粒转染到胚胎细胞中。使用方波发生器，施加五个脉冲，每个脉冲持续时间为25 V和100 ms，间隔50 ms。根据单个电穿孔设置凭经验确定条件。
   4. 电穿孔后通过添加几滴0.719%盐水来水合胚胎。要清除电极表面的变性白蛋白，请用蒸馏水彻底冲洗。用透明胶带重新密封种蛋，并在37-38°C下返回加湿的培养箱中进一步孵化。
      注意:胚胎可以在电穿孔后培养直到孵化，但是活力急剧降低。

2.基底夹层

1. 使用70%乙醇对手术台、显微镜载物台和周围区域进行消毒。加热或酒精消毒显微切割设备，包括最小弹簧弓剪刀、微刮匙和两对细镊子。
2. 准备以下解剖板:带有黑色硅基的玻璃培养皿，90毫米塑料培养皿和60毫米培养皿。冷却磷酸盐缓冲盐水（PBS）或汉克斯平衡盐溶液（HBSS）进行解剖。
3. 轻轻地将鸡蛋打入 90 毫米培养皿中。识别雏鸡的外耳。用剪刀将颈部切到下颌水平下方，将胚胎斩首。将头部转移到装有冰冷PBS的60毫米培养皿中。
4. 将胚胎定向，喙的顶部朝向实验者，并使用#5镊子之一握住喙。用第二个#5镊子挖出眼睛。从喙部到尾部，沿中线切割头骨。挖出大脑。
5. 添加更多冰冷的PBS或HBSS，并找到两个闪亮的结构，靠近耳廓的水平。这些是耳蜗管末端的耳石，靠近中线。
6. 大致切在两个拉根之间，并远高于和低于该区域，以隔离两个内耳。在倾斜的照明下，可视化内耳的轮廓。去除外来组织和前庭。
7. 将分离的耳蜗转移到带有冰冷PBS的黑色硅胶底板上。使用#5镊子，剥去软骨耳蜗囊以获得耳蜗管。找到耳蜗管的起伏层（被盖），并使用#55镊子取出以暴露血压。 使用#55镊子，去除盖膜以暴露HC和SC。

3. 基底外植体的培养

1. BP的膜培养
   1. 取一个六孔组织培养板，每孔布置一个培养膜插入物。
   2. 将解剖的基底（外植体）收集在带有 1x HBSS 缓冲液的 200 μL 移液管中，并将其转移到膜上。为防止组织粘附在移液器壁上，请在吸出组织之前抽取一些培养基。
   3. 定向外植体，使基底朝上，以便从顶部²⁹可以看到毛发和支持细胞。一旦外植体定位，从培养膜表面缓慢吸出HBSS缓冲液。在此过程中，外植体将附着在培养膜上。
   4. 在膜插入物和孔壁之间加入 1.2 mL Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 培养基，以填充六孔板的孔。在单个 30 mm 培养膜上最多可培养六个外植体。
2. 耳蜗管的胶原培养
   1. 通过在组织培养罩中加入 400 μL 3 mg/mL 大鼠尾部胶原蛋白、50 μL 10x DMEM、30 μL 7.5% NaHCO₃ 和 5 μL HEPES 来制备胶原蛋白混合物。
   2. 取一个四孔板，向每个孔中加入三滴胶原蛋白混合物。将解剖的耳蜗管转移到每个胶原蛋白滴上。将板在37°C，5%CO₂ 下孵育10分钟以固化胶原蛋白基质。
3. 培养物的小分子处理
   1. 单独使用药理调节剂或其溶剂（用作对照）制备培养基（DMEM，N-2补充剂，青霉素）。用补充有抑制剂的 700 μL 培养基替换培养基。在37°C，5%CO₂的培养箱中培养外植体。
   2. 每天更换50%的培养基。在适当的孵育时间后，取出培养基并使用外植体进行下游测定。

4. 成像和分析

1. 免疫荧光分析
   1. 从孔中取出培养基，并用1x HBSS洗涤外植体两次。使用移液管向孔中加入 1 mL 4% 多聚甲醛 （PFA），并在室温下孵育 20 分钟。
   2. 去除PFA，并在室温下用1x PBS洗涤外植体三次。为了从培养膜中收集外植体，使用小弹簧弓剪刀在包含组织片的膜周围做一个小切口，并使用镊子将组织与膜一起转移到 48 孔培养板上。
      注意:如果组织在固定后漂浮，则用200μL移液器吸出并将其转移到48孔板中进行进一步处理。避免用力将组织从膜上分离。
   3. 对于胶原液滴培养，使用镊子将整个胶原液滴转移到硅板上。加入 200 μL 的 1x PBS 并在镊子的帮助下去除胶原蛋白，然后将组织转移到 48 孔培养板中。
   4. 在室温下用 1 mL 补充有 0.3% 吐温-20 （PBST） 的 1x PBS 透化外植体 30 分钟。将外植体与 200 μL 封闭缓冲液（10% 山羊血清 + 1% 牛血清白蛋白在 PBST 中）在室温下孵育 1 小时。
   5. 将外植体与 200 μL 一抗溶液（1:300，封闭缓冲液）在 4 °C 下孵育过夜。 取出一抗溶液，用PBST彻底洗涤外植体5 x 20分钟。
   6. 将外植体与 200 μL 鬼笔环肽和二抗溶液（在封闭缓冲液中）在室温下在黑暗中孵育 1 小时。除去鬼笔环肽和二抗溶液，并用PBST彻底洗涤外植体5 x 20分钟。
      注意:必须为每个单独的成像应用确定二抗浓度和洗涤长度。对于使用超分辨率显微镜的成像，我们通常将二抗浓度从1:500增加到1:200，并将鬼笔环肽的浓度从1:400增加到1:200。
   7. 将外植体与DAPI溶液（PBST中的1:1000）在室温下孵育15分钟。取出DAPI溶液并用PBST洗涤外植体3 x 5分钟。
   8. 使用封片剂将外植体安装在载玻片上，血压朝上（靠在盖玻片上）。对于共聚焦成像，请使用抗淬灭封片剂。让封片剂在室温下在黑暗中干燥过夜。直接成像或将载玻片储存在4°C直至成像。
2. 用于 SEM 分析的耳托固定
   1. 新鲜准备所有溶液并根据当地安全指南进行处理。将膜培养的外植体（来自步骤4.1.4）固定在0.1M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.3）中的2.5%戊二醛中，并用3mM CaCl₂固定。在4°C下固定24至72小时，每24小时更换一次固定剂。
   2. 取出固定剂，并在室温下用0.1M二甲胂酸钠3 x 5分钟洗涤组织。在室温下用1%OsO 4（使用0.1M二甲胂酸钠缓冲液从4%_{OsO 4}储备液稀释）进行二次固定1小时。执行此步骤和后续步骤，直到在通风橱中脱水。
   3. 在室温下用0.1M二甲胂酸钠缓冲液冲洗3 x 5分钟。然后在室温下用双蒸或超纯水冲洗3 x 5分钟。
   4. 在超纯水中制备0.5%的硫代碳酰肼（TCH）溶液。在75°C搅拌10分钟，并在冷却至室温时过滤溶液。
      注意:TCH非常危险。使用必须得到当地安全委员会的批准，并且在处理时必须小心。
   5. 从样品中除去超纯水，逐滴添加0.5%TCH。如果溶液变成棕色，请停止并用超纯水冲洗样品，然后小心地加入0.5%TCH溶液。溶液澄清后，用0.5%TCH代替。在室温下孵育20分钟^30，31。
   6. 在室温下用超纯水冲洗样品3 x 5分钟。再重复步骤4.2.2、4.2.3和4.2.5两次，最后以OsO₄ 孵育结束，然后冲洗。
   7. 将乙醇系列样品脱水至100%无水乙醇（EtOH）。首先在 25% ETOH 中孵育 10 分钟，然后用 50% ETOH 孵育 10 分钟，在 75% 乙醚中孵育 10 分钟，在 95% 乙二醇中孵育 10 分钟，然后在 100% ETOH 中孵育总共 3 倍，每次 10 分钟。
   8. 使用液体CO₂进行临界点干燥。立即用双面碳胶带将样品安装在SEM短管上。继续溅射涂层以提供 5-10 nm 的涂层。如果不立即成像，请将样品储存在真空下的干燥器中。

结果

在电穿孔设置中，电极定位可以在转染领域发挥作用。正极放置在蛋黄下方，负极放置在胚胎上方（图1A）。这导致大部分内耳和两个前庭器官（图1B）和听基底（图1C，D）的GFP表达较高，证实了转染。

在评估CRISPR敲低的表型时，我们设计了引导RNA到毛细胞转录因子Atonal homolog1（Atoh1）。Atoh1的小?...

讨论

雏鸡是实验室可以用来研究内耳的模式生物的一种经济高效且方便的补充。这里描述的方法在我们的实验室中经常使用，并补充了正在进行的哺乳动物内耳研究。 在卵子中 ，电穿孔用于将遗传操作引入鸡基因组。电穿孔还可用于引入编码靶向特定细胞器或亚细胞结构的荧光蛋白的构建体^35，36。虽然这是一个简单的程序，但在 卵子中 操纵...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3	Integrated DNA Technologies	1081061	High fidelity Cas9 protein
Anti-GFP antibody	Abcam	ab290	Rabbit polyclonal to GFP
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647
Calcium Chloride Dihydrate	Thermo Fisher Scientific	Q12135
Collagen I, rat tail	Thermo Fisher Scientific	A1048301
Critical Point Dryer Leica EM CPD300	Leica
CUY-21 Electroporator	Nepagene
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DM5000B Widefield Microscope	Leica
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10569010
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252
Fluoroshield	Sigma-Aldrich	F6182
FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope	Olympus
Glutaraldehyde (25 %)	Sigma-Aldrich	340855
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11001
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008
Goat Serum Sterile filtered	HiMedia	RM10701	Heat inactivated
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14025092
LSM980 Airyscan Microscope	Zeiss
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm	Sigma-Aldrich	PICM03050
MVX10 Stereo Microscope	Olympus
MYO7A antibody	DSHB	138-1	Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa
MZ16 Dissecting microscope	Leica
N-2 Supplement (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502048
Noyes Scissors, 14cm (5.5'')	World Precision Instruments	501237
Osmium tetroxide (4%)	Sigma-Aldrich	75632
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PC-10 Puller	Narishige
pcU6_1sgRNA	Addgene	92395	Mini vector with modified chicken U6 promoter
Penicillin G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36934
SMZ1500 Dissecting microscope	Nikon
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M	Electron Microscopy Sciences	11652
Sodium chloride	HiMedia	GRM853
Sputtre Coater K550X	Emitech
Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament	World Precision Instruments	1B100-3
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097
The MERLIN Compact VP	Zeiss
Thiocarbohydrazide	Alfa Aesar	L01205
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379