JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

Abstract

האוזן הפנימית קולטת צלילים ושומרת על איזון באמצעות השבלול והפרוזדור. הוא עושה זאת על ידי שימוש בסוג תא מכניו-חושי ייעודי המכונה תא השערה. מחקר בסיסי באוזן הפנימית הוביל להבנה עמוקה של האופן שבו תאי השערה מתפקדים, וכיצד חוסר ויסות יכול להוביל לליקוי שמיעה ולסחרחורת. לצורך מחקר זה, העכבר היה מערכת המודל הבולטת ביותר. עם זאת, עכברים, כמו כל היונקים, איבדו את היכולת להחליף תאי שערה. לכן, כאשר מנסים להבין טיפולים תאיים לשיקום תפקוד האוזן הפנימית, מחקרים משלימים במינים אחרים של בעלי חוליות יכולים לספק תובנות נוספות. האפיתל השמיעתי של ציפורים, הפפילה הבזילרית (BP), הוא יריעה של אפיתל המורכבת מתאי שערה מכנו-חושיים (HCs) המשולבים על ידי תאים תומכים (SCs). למרות שהארכיטקטורה האנטומית של הפפילה הבזילרית והשבלול של היונקים שונה, המנגנונים המולקולריים של התפתחות האוזן הפנימית והשמיעה דומים. זה הופך את הפפילה הבזילרית למערכת שימושית לא רק למחקרים השוואתיים אלא גם להבנת התחדשות. כאן נתאר טכניקות דיסקציה ומניפולציה לאוזן הפנימית של התרנגולת. הטכניקה מציגה שיטות עיכוב גנטיות ומולקולות קטנות, המציעות כלי רב עוצמה לחקר המנגנונים המולקולריים של התפתחות האוזן הפנימית. במאמר זה, אנו דנים בטכניקות אלקטרופורציה של ovo כדי להפריע גנטית לפפילה הבזילרית באמצעות מחיקות CRIPSR-Cas9, ולאחר מכן דיסקציה של הפפילה הבזילית. אנו גם מדגימים את תרבית איברי BP ושימוש אופטימלי במטריצות תרבית, כדי לבחון את התפתחות האפיתל ותאי השערה.

Introduction

האוזן הפנימית של כל בעלי החוליות נגזרת מאפיתל פשוט המכונה placodeotic 1,2. זה יוליד את כל האלמנטים המבניים ואת סוגי התאים הדרושים כדי להמיר את המידע mechanosensory הקשורים שמיעה ותפיסת שיווי משקל. תאי השערה (HCs), החיישן הציליאטי של האוזן הפנימית, מוקפים בתאים תומכים (SCs). HCs מעבירים מידע למוח האחורי השמיעתי דרך הנוירונים של עצב הגולגולת השמיני. אלה נוצרים גם מן placode otic3. ההתמרה הראשונית של הצליל מושגת על פני השטח האפיקליים של HC השמיעתי, באמצעות צרור שיער רגיש מכנית4. זה מתווך באמצעות בליטות מבוססות אקטין מותאמות הנקראות סטריאוציליה, המסודרות בתבנית מדרגות מדורגת5. בנוסף, cilium ראשוני שונה, הנקרא kinocilium, מארגן היווצרות צרור שיער והוא צמוד לשורה הגבוהה ביותר של סטריאוציליה 6,7,8. הארכיטקטורה של סטריאוציליה היא קריטית לתפקיד זה בהמרת גירויים מכניים הנגזרים מאנרגיה אקוסטית לאותות עצביים חשמליים9. נזק ל-HC השמיעתי כתוצאה מהזדקנות, זיהום, טראומה אוטואקוסטית או הלם אוטוטוקסי עלול לגרום לליקוי שמיעה חלקי או מלא, שביונקים הוא בלתי הפיך10.

הוצעו טיפולים תחליפיים תאיים שעשויים לתקן נזק כזה11,12. הגישה של מחקר זה הייתה להבין את ההתפתחות התקינה של תאי השערה של יונקים ולשאול אם ניתן להתחיל מחדש תוכניות התפתחות בתאים דמויי אב שעשויים להתקיים בתוך האוזן הפנימית13. גישה שנייה הייתה להסתכל מחוץ ליונקים, אל בעלי חוליות שאינם יונקים שבהם מתרחשת התחדשות חזקה של תאי שערה שמיעתיים, כגון ציפורים14,15. אצל ציפורים, התחדשות תאי השערה מתרחשת בעיקר באמצעות דה-דיפרנציאציה של תא תומך למצב דמוי אב, ולאחר מכן חלוקה מיטוטית אסימטרית ליצירת תא שערה ותאתומך 16. בנוסף, הבחנה ישירה של תא תומך ליצירת תא שערה נצפתה גם17.

בעוד שהמנגנונים של התפתחות שמיעת העופות מראים דמיון משמעותי לזה של יונקים, ישנם הבדלים18. התמיינות HC ו-SC באפרוח BP ניכרת מיום עוברי (E) 7, והופכת מובחנת יותר עם הזמן. על ידי E12, ניתן לדמיין פפילה בזילרית (BP) מעוצבת ומקוטבת היטב, ועל ידי E17 ניתן לראות תאי שיער מפותחים היטב19. נקודות זמן אלה מספקות חלונות למנגנונים של התמיינות, דפוס וקוטביות, כמו גם התבגרות תאי שערה. ההבנה אם מנגנונים כאלה נשמרים או מסתעפים היא חשובה, שכן הם מספקים תובנות על ההומולוגיה העמוקה של מקורות תאי השערה המכנו-חושיים.

כאן אנו מדגימים מגוון טכניקות המבוצעות בשלבים עובריים מוקדמים ומאוחרים כדי לחקור תהליכים תאיים כגון התפשטות, אפיון גורל, התמיינות בתבניות ותחזוקה לאורך התפתחות איבר האוזן הפנימית. זה משלים פרוטוקולים אחרים על הבנת התפתחות האוזן הפנימית בתרבית explant20,21,22. תחילה נדון בהחדרת דנ"א אקסוגני או רנ"א למבשרי BP בתוך האוטוציסט E3.5 באמצעות אלקטרופורציה של ovo. למרות שמניפולציות גנטיות יכולות לספק תובנות חשובות, הפנוטיפים שנוצרו כך יכולים להיות פליאוטרופיים וכתוצאה מכך מבלבלים. זה נכון במיוחד במהלך התפתחות מאוחרת יותר של האוזן הפנימית, שבה תהליכים בסיסיים כגון שיפוץ ציטוסקטלי ממלאים תפקידים רבים בחלוקת תאים, מורפוגנזה של רקמות והתמחות תאית. אנו מציגים פרוטוקולים לעיכוב פרמקולוגי במרגלים מתורבתים, המציעים יתרונות בשליטה על תזמון ומשך הטיפול והטיפול, ומציעים מניפולציה מרחבית-טמפורלית מדויקת של מנגנוני התפתחות.

ניתן להשתמש בשיטות שונות של תרבית איברים בהתאם למשך הטיפול במעכבים קטנים. כאן אנו מדגימים שתי שיטות של תרבית איברים המאפשרות תובנות על מורפוגנזה אפיתליאלית והתמחות תאית. שיטה לתרבית תלת-ממדית המשתמשת בקולגן כמטריצה לתרבית צינור השבלול מאפשרת התרבות החזקה והדמיה חיה של ה-BP המתפתח. להבנת היווצרות הסטריאוציליה, אנו מציגים שיטת תרבית ממברנה כך שרקמת האפיתל עוברת בתרבית על מטריצה נוקשה המאפשרת לבליטות אקטין לגדול בחופשיות. שתי השיטות מאפשרות עיבוד במורד הזרם כגון הדמיית תאים חיים, אימונוהיסטוכימיה, מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת (SEM), הקלטת תאים וכו '. טכניקות אלה מספקות מפת דרכים לשימוש יעיל בגוזל כמערכת מודל להבנה ולמניפולציה של ההתפתחות, ההבשלה וההתחדשות של אפיתל השמיעה של העופות.

Protocol

פרוטוקולים הכוללים רכישה, תרבית ושימוש בביצי תרנגולות מופרות ובעוברים שלא נקטפו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים של המרכז הלאומי למדעי הביולוגיה, בנגלור, קרנטקה.

1. ב ovo electroporation של מבשרי השמיעה אפרוח

  1. תכנון ושיבוט sgRNA עבור נוקאאוט הגן CRISPR/Cas9
    1. ליצירת נוקאאוטים של גנים, התכנון מנחה רנ"א לשבש את אזורי האקסון של הגן, רצוי קרוב יותר לקצה 5' של אזור הקידוד.
    2. בחר את ה-RNA המנחה הפוטנציאלי באמצעות כלי אינטרנט CRISPOR23. הגדר את נתוני הדפדפן לגאלוס גאלוס ולרצף המוטיב הסמוך של הפרוטוספייסר (PAM) ל- 5'- NGG -3'. התוכנית קובעת רנ"א מנחה מרצף הקלט ומקצה ציונים שונים על סמך פעילות על המטרה ומחוצה לה. בחר את ארבעת המדריכים המובילים למחקרים נוספים.
    3. לתכנון אוליגוס ספציפיים לתבנית לייצור (g)RNA, הסר את רצף PAM (5′- NGG -3′) מפלט כלי התכנון gRNA. זה לא נחוץ למיקוד, אבל מכיל את רצף זיהוי המחשוף Cas9. סנתז שני אוליגואים משלימים מטוהרים של HPLC עם אתר הגבלת BsmBI בשני הקצוות, עבור כל gRNA פוטנציאלי.
    4. שכפל את רצף המדריך במסגרת עם פיגום tracrRNA של וקטור בחירה (כאן, וקטור pcU6_1sgRNA שימש24).
    5. ממיסים את האוליגונוקלאוטידים של sgRNA בריכוז של 100 μM במים נטולי DNase/RNase. בצע חישול של שני מדריכי אוליגו חושים ואנטיסנס באמצעות תרמוציקלר עם הפרמטרים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואז 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן ירידה ל -4 מעלות צלזיוס.
    6. תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות כמתוארב-25, הגדרת עיכול הגבלת של אוליגוס מחושלים ושיבוט וקטור שיבוט pcU6_1sgRNA עם אנזים BsmBI בן לילה. קשירת התקנה עם וקטור pcU6_1sgRNA מעוכל BsmBI ליניארי מטוהר בג'ל ואוליגו sgRNA מעוכל. הפוך לתא מוכשר DH5-אלפא ורצף לאשר את השיבוט המתקבל.
  2. טיפול בביצים וחלונות
    1. רכשו ביצים טריות וניקו אותן על ידי ניגוב שלהן ב-70% אתנול כדי למנוע זיהום. דגירה ב 37-38 מעלות צלזיוס, עם 45% לחות במשך 3.5-4 ימים.
    2. לאחר הדגירה, מניחים את הביצה על צדה לפחות 5 דקות לפני הפתיחה. זה מאפשר לעובר למקם מחדש את החלק העליון של החלמון. השתמשו במלקחיים כדי ליצור חורים קטנים בחלק העליון והקהה של הביצה, כך שמחט 21G יכולה לעבור דרכה.
    3. כדי למנוע נזק במהלך החלון, הסר אלבומין כדי להוריד את העובר הרחק מהקליפה. כדי לעשות זאת, להשתמש מזרק 5 מ"ל מחט 21G כדי לצייר בזהירות 2 מ"ל של אלבומין מחור בקצה קהה של הביצה. השתמש בסרט שקוף כדי לכסות את החור בקצה הקהה.
    4. כדי להפוך את חלון הביצה, להדביק סרט שקוף על החלק העליון של קליפת הביצה. חותכים פתח חלון, באורך של כ-2 ס"מ וברוחב 1.5 ס"מ, באמצעות מספריים של קשת קפיצית וחושפים את העובר. השתמש במלקחיים כדי לפתוח את הקרומים הכוריוניים מעל העובר, ולאפשר גישה לעובר.
  3. פלסמידים למיקרו-הזרקה
    1. לניסוי נוקאאוט הגנים, הכינו שני פתרונות: תערובת הנוק-דאון המכילה חלבון SpCas9 ופלסמיד מנחה - pcU6_1sgRNA, ותערובת הפלסמיד העוקבת של T2K-eGFP (זהו מקדם צ'יק ß-אקטין המניע קלטת GFP המוקפת באתרי הטרנספוזון של Tol2) יחד עם T2TP (הטרנספוזאז Tol2 משובט ב- Tol2 בונה26,27). העקיבה משמשת למעקב אחר יעילות האלקטרופורציה.
    2. בעת אלקטרופולציה של פלסמידים מרובים, ודא שהריכוז הסופי של הדנ"א הוא לפחות 4 מיקרוגרם / μL. ערבבו את שלושת המבנים, הנחו פלסמיד - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP ו- T2TP, ביחס של 1:1:1 עם 1 מיקרוגרם של חלבון SpCas9, 30% סוכרוז וצבע ירוק מהיר של 0.1% בנפח סופי של 10 μL.
    3. משוך מחטים למיקרו הזרקה מנימי זכוכית סטנדרטיים (אורך 3 אינץ ', OD 1.0 מ"מ) באמצעות מושך פיפטה אנכי. השתמשו במלקחיים עדינים כדי לנתק את הקצה הנימי לאחר המשיכה כדי לקבל קוטר קצה של כ-50 מיקרומטר עם קצה מחודד.
    4. הניחו את העוברים ב-E3.5 בצד שמאל כשהראש פונה ימינה. בדרך זו רק שלפוחית השחלות הימנית נגישה להזרקת מיקרו. מיקרו-להזריק את תערובת הנוק-דאון לתוך שלפוחית otic. להזריק סביב נפח של 200 nL של תערובת תמיסת DNA כדי למלא את שלפוחית otic.
    5. קבע את יעילות המדריך באמצעות מבחן אנדונוקלאז T728.
  4. אלקטרופורציה
    1. יש להוסיף כמה טיפות של 0.719% מלוחים על גבי העובר לפני האלקטרופורציה כדי להוריד את ההתנגדות החשמלית ולמנוע התחממות יתר של העובר.
    2. מניחים את האלקטרודה החיובית דרך החור שנוצר בצד הבוטה של הביצה כאשר האלבומין הוסר. תמרן את האלקטרודה כך שתהיה מתחת לחלמון. מניחים את האלקטרודה השלילית מעל האוטוציסטה המלאה.
    3. השתמש באלקטרופורציה כדי להעביר פלסמידים לתאי העובר. השתמש במחולל פולסים מרובע והחל חמש פולסים של 25 וולט ומשך זמן של 100 אלפיות השנייה כל אחת, בהפרש של 50 אלפיות השנייה זו מזו. קבע את התנאים באופן אמפירי בהתבסס על מערך אלקטרופורציה בודד.
    4. לחות את העובר לאחר אלקטרופורציה על ידי הוספת כמה טיפות של 0.719% מלוחים. כדי לנקות אלבומין שעבר דנטורציה מפני השטח של האלקטרודות, שטפו אותו היטב במים מזוקקים. אטמו מחדש את הביצה עם סרט שקוף וחזרו לחממה הלחה בטמפרטורה של 37-38 מעלות צלזיוס להמשך הדגירה.
      הערה: ניתן לתרבת את העוברים עד לבקיעה לאחר האלקטרופורציה, אולם יש ירידה תלולה בכדאיות.

2. דיסקציה של פפילה בזילאר

  1. השתמש ב-70% אתנול כדי לחטא את שולחן הניתוחים, שלב המיקרוסקופ והסביבה. מחממים או אלכוהוליים מעקרים ציוד מיקרו-דיסקציה הכולל מספריים עם קפיץ מינימלי, מיקרו-קורט ושני זוגות מלקחיים עדינים.
  2. הכינו את לוחות הדיסקציה הבאים: צלחת פטרי זכוכית עם בסיס סיליקון שחור, צלחת פטרי מפלסטיק 90 מ"מ וצלחת פטרי 60 מ"מ. יש לצנן את תמיסת המלח החצובה בפוספט (PBS) או את תמיסת המלח המאוזנת (HBSS) של הנקס לנתיחות.
  3. מפצחים בעדינות את הביצה לתוך צלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ. זהה את האוזן החיצונית של הגוזל. ערפו את העובר על ידי חיתוך הצוואר ממש מתחת לגובה הלסת התחתונה באמצעות מספריים. מעבירים את הראש לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ מלאה ב-PBS קר כקרח.
  4. כוון את העובר כאשר החלק העליון של המקור פונה לכיוון הנסיין והחזק את המקור באמצעות אחד המלקחיים #5. הוציאו את העיניים בעזרת המלקחיים השניים #5. עוברים מרוסטרל לקאודל, חותכים את הגולגולת לאורך קו האמצע שלה. הוציאו את המוח.
  5. הוסיפו עוד PBS או HBSS קרים כקרח ואתרו את שני המבנים המבריקים, קרוב לרמת הפינה. אלה הם האוטוליטים של הלגנה בקצה צינור השבלול ונמצאים קרוב לקו האמצע.
  6. חותכים בערך בין שתי הלגנות, והרבה מעל ומתחת לאזור זה כדי לבודד שתי אוזניים פנימיות. תחת תאורה אלכסונית, דמיינו את קווי המתאר של האוזן הפנימית. הסר רקמות חיצוניות ואת הפרוזדור.
  7. העבירו את השבלול המבודד לצלחת בסיס מסיליקון שחור עם PBS קר כקרח. באמצעות מלקחיים #5, יש לקלף את כמוסת השבלול הסחוסית כדי לקבל את צינור השבלול. אתר את השכבה הגלית (tegmentum) של צינור השבלול והסר באמצעות #55 מלקחיים כדי לחשוף את BP. באמצעות #55 מלקחיים, להסיר את הממברנה הטקטוריאלית כדי לחשוף HCs ו- SCs.

3. תרבות של צמחי פפילה בזילריים

  1. תרבית הממברנה של BP
    1. קח צלחת תרבית רקמה בת שש בארות וסדר ממברנת תרבית אחת לכל באר.
    2. אספו את הפפילה הבזילרית המנותקת (explant) בפיפטה של 200 μL עם חיץ HBSS 1x והעבירו אותה על ממברנה. כדי למנוע מהרקמה להידבק לדופן הפיפטה, ציירו מעט מדיה לפני שאתם שואפים את הרקמה.
    3. כוון את הצמח כך שהפפילה הבזילרית פונה כלפי מעלה, כך שהשיער ותאי התמיכה נראיםמ-29 הראשונים. לאחר מיקום היציאה, שאפו את חיץ ה-HBSS באיטיות מפני השטח של קרום התרבית. בתהליך זה, האקסצ'יל יתחבר לקרום התרבית.
    4. הוסף 1.2 מ"ל של מדיית תרבית הנשר המתוקנת של דולבקו (DMEM) בין תוסף הממברנה לדופן הבאר כדי למלא את הבארות של צלחת שש הבארות. ניתן לתרבת עד שישה צמחים על קרום תרבית יחיד בקוטר 30 מ"מ.
  2. תרבית הקולגן של צינור השבלול
    1. הכינו את תערובת הקולגן על ידי הוספת 400 מיקרו-ליטר של קולגן 3 מ"ג/מ"ל זנב חולדה, 50 מיקרו-ליטר של 10x DMEM, 30 מיקרו-ליטר של 7.5% NaHCO3 ו-5 מיקרו-ליטר של HEPES במכסה של תרבית רקמה.
    2. קחו צלחת של ארבע בארות והוסיפו שלוש טיפות של תערובת קולגן לכל באר. העבירו את צינור השבלול המנותק לכל טיפת קולגן. לדגום את הצלחת במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 כדי לרפא את מטריצת הקולגן.
  3. טיפול במולקולות קטנות בתרביות
    1. הכן מדיה תרבותית (DMEM, תוסף N-2, פניצילין) עם אפנן פרמקולוגי או ממס שלה לבד (לשימוש כבקרה). החלף את מדיה תרבותית עם 700 μL של מדיה בתוספת המעכב. תרבית את הצמחים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    2. החלף 50% מהתקשורת התרבותית מדי יום. לאחר זמן הדגירה המתאים, הסר את מדיית התרבית והשתמש בצמחים לבדיקות במורד הזרם.

4. הדמיה וניתוח

  1. אנליזה אימונופלואורסצנטית
    1. יש להסיר את מדיית התרבית מהבארות ולשטוף את הצמחים פעמיים עם HBSS אחד. באמצעות פיפטה, להוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) לבאר דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הסר PFA ושטוף את הצמחים שלוש פעמים עם 1x PBS בטמפרטורת החדר. כדי לאסוף את הצמחים מממברנת התרבית, בצע חתך קטן סביב הממברנה המכילה את פיסת הרקמה באמצעות מספריים קטנים של קשת קפיצית והעבר את הרקמה יחד עם הממברנה לצלחת תרבית בת 48 בארות באמצעות מלקחיים.
      הערה: אם הרקמות צפות לאחר הקיבוע, שאפו עם פיפטה של 200 μL והעבירו אותה לצלחות של 48 בארות לעיבוד נוסף. הימנע ניתוק כוחני של הרקמה מן הממברנה.
    3. עבור תרבית טיפות קולגן, השתמשו במלקחיים כדי להעביר את כל טיפת הקולגן לצלחת סיליקון. הוסף 200 μL של 1x PBS ולהסיר קולגן בעזרת מלקחיים, ולאחר מכן להעביר את הרקמה לצלחת תרבית 48 באר.
    4. חלחלו לצמחים עם 1 מ"ל של PBS 1x בתוספת 0.3% Tween-20 (PBST) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. דגרו את הצמחים עם 200 μL של מאגר חוסם (10% סרום עיזים + 1% אלבומין בסרום בקר ב- PBST) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    5. דגרו את האקספלורציה עם 200 μL של תמיסת נוגדנים ראשונית (1:300, בחיץ חוסם) במשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית ושטוף היטב את הצמחים 5 x 20 דקות עם PBST.
    6. דגרו את האקספלורציה עם 200 מיקרו-ליטר של פלואידין ותמיסת נוגדנים משנית (בחיץ חוסם) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך. הסר את תמיסת הפלואידין והנוגדן המשני ושטוף היטב את הצמחים 5 x 20 דקות עם PBST.
      הערה: יש לקבוע את ריכוז הנוגדנים המשני ואת אורך הכביסה עבור כל יישום הדמיה בנפרד. עבור הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, אנו בדרך כלל מגדילים את ריכוז הנוגדן המשני מ-1:500 ל-1:200 ומעלים את ריכוז הפלואידין מ-1:400 ל-1:200.
    7. דגרו את הצמחים עם תמיסה של DAPI (1:1000 ב-PBST) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את תמיסת DAPI ושטוף את היציאות 3 x 5 דקות עם PBST.
    8. השתמש במדיית ההרכבה כדי להרכיב את הקצוות על מגלשה כאשר BP פונה כלפי מעלה (כנגד הכיסוי). עבור הדמיה confocal להשתמש במדיה הרכבה antifade. הניחו למדיית ההרכבה להתייבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך. צלם ישירות או אחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4 °C עד להדמיה.
  2. קיבוע OTOTO לניתוח SEM
    1. הכינו את כל הפתרונות טריים וטפלו בהתאם להנחיות הבטיחות המקומיות. תיקון צמחים בתרבית קרום (משלב 4.1.4) ב-2.5% גלוטראלדהיד ב-0.1 M נתרן קקודילאט בופר (pH 7.3) עם 3 mM CaCl2. בצע קיבוע ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 72 שעות עם שינוי של קיבוע כל 24 שעות.
    2. הסר את המקבע ולשטוף את הרקמה עם 0.1 M נתרן cacodylate 3 x 5 דקות בטמפרטורת החדר. תיקון משני עם 1% OsO 4 (מדולל ממלאי 4% OsO4 באמצעות חיץ נתרן קקודילאט 0.1 M) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. בצע את זה ואת השלבים הבאים עד התייבשות במכסה אדים.
    3. יש לשטוף באמצעות חיץ נתרן קקודילאט 0.1 M 3 x 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לשטוף במים מזוקקים כפולים או אולטרה-טהורים בגודל 3X5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. הכן פתרון של 0.5% של תיאוקרבוהידראזיד (TCH) במים טהורים במיוחד. מערבבים בטמפרטורה של 75°C למשך 10 דקות ומסננים את התמיסה לאחר שהתקררה לטמפרטורת החדר.
      הערה: TCH מסוכן ביותר. השימוש חייב להיות מאושר על ידי ועדת הבטיחות המקומית, ויש לנקוט משנה זהירות בעת הטיפול.
    5. הסר מים אולטרה-פוריים מהדגימה והוסף 0.5% TCH טיפה אחר טיפה. אם התמיסה הופכת חומה, עצרו ושטפו את הדגימה במים אולטרה-טהורים, לפני שתוסיפו בזהירות את תמיסת ה-TCH של 0.5%. ברגע שהפתרון ברור, החלף אותו ב-0.5% TCH. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות30,31.
    6. יש לשטוף את הדגימה במים אולטרה-טהורים בגודל 3X5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלבים 4.2.2, 4.2.3 ו- 4.2.5 פעמיים נוספות המסתיימות בדגירת OsO4 ואחריה שטיפה.
    7. לייבש את הדגימות בסדרת אתנול ל-100% אתנול נטול מים (EtOH). דגירה תחילה ב-25% ETOH למשך 10 דקות, לאחר מכן 50% ETOH למשך 10 דקות, 75% EtOH למשך 10 דקות, 95% ETOH למשך 10 דקות, לפני דגירה עבור סך של 3x במשך 10 דקות כל אחד ב-100% ETOH.
    8. בצע ייבוש נקודה קריטית באמצעות CO2 נוזלי. מיד להרכיב את הדגימות על stub SEM עם סרט דבק פחמן דו צדדי. המשך לציפוי sputter כדי לספק 5-10 ננומטר של ציפוי. אם לא הדמיה מיידית, לאחסן את הדגימות במייבש תחת ואקום.

תוצאות

במערך האלקטרופורציה, מיקום אלקטרודות יכול למלא תפקיד בתחום הטרנספקציה. האלקטרודה החיובית ממוקמת מתחת לחלמון, והשלילית מעל העובר (איור 1A). התוצאה היא ביטוי GFP גבוה יותר בחלק גדול מהאוזן הפנימית ובשני איברי שיווי המשקל (איור 1B), ופפילה בזילרית שמיעתית (

Discussion

הגוזל הוא תוספת חסכונית ונוחה לאורגניזמי המודל שמעבדה עשויה להשתמש בהם כדי לחקור את האוזן הפנימית. השיטות המתוארות כאן משמשות באופן שגרתי במעבדה שלנו ומשלימות מחקר מתמשך באוזן הפנימית של היונקים. ב ovo אלקטרופורציה משמש כדי להציג מניפולציות גנטיות לתוך הגנום אפרוח. אלקטרופורציה יכול...

Disclosures

למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים על תמיכה מ-NCBS, TIFR, מענק מחקר מוביל של Infosys-TIFR, DST-SERB והמכון הלאומי המלכותי לחירשים. ברצוננו להודות לארגון פיתוח עופות מרכזי ומכון הכשרה, Hesaraghatta, בנגלור. אנו אסירי תודה לתמיכת המתקן והמעבדה של CIFF ו- EM ב- NCBS. אנו מודים ליושיקו טקהאשי וקויצ'י קוואקאמי על בניית Tol2-eGFP ו- T2TP, ולגיא ריצ'רדסון על נוגדן HCA ו- G19 Pcdh15. אנו מודים לחברי ארלאב על תמיכתם המתמדת והמשוב החשוב שלהם על הפרוטוקול.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3Integrated DNA Technologies1081061High fidelity Cas9 protein
Anti-GFP antibodyAbcamab290Rabbit polyclonal to GFP
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647
Calcium Chloride DihydrateThermo Fisher ScientificQ12135
Collagen I, rat tailThermo Fisher ScientificA1048301
Critical Point Dryer Leica EM CPD300Leica
CUY-21 ElectroporatorNepagene
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
DM5000B Widefield MicroscopeLeica
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvateThermo Fisher Scientific10569010
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-20
Dumont #55 ForcepsFine Science Tools11255-20
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252
FluoroshieldSigma-AldrichF6182
FLUOVIEW 3000 Laser Scanning MicroscopeOlympus
Glutaraldehyde (25 %)Sigma-Aldrich340855
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11001
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11032
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11008
Goat Serum Sterile filteredHiMediaRM10701Heat inactivated
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific14025092
LSM980 Airyscan MicroscopeZeiss
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µmSigma-AldrichPICM03050
MVX10 Stereo MicroscopeOlympus
MYO7A antibodyDSHB138-1Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa
MZ16 Dissecting microscopeLeica
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502048
Noyes Scissors, 14cm (5.5'')World Precision Instruments501237
Osmium tetroxide (4%)Sigma-Aldrich75632
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PC-10 PullerNarishige
pcU6_1sgRNAAddgene92395Mini vector with modified chicken U6 promoter
Penicillin G sodium saltSigma-AldrichP3032
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36934
SMZ1500 Dissecting microscopeNikon
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2MElectron Microscopy Sciences11652
Sodium chlorideHiMediaGRM853
Sputtre Coater K550XEmitech
Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No FilamentWorld Precision Instruments1B100-3
SucroseSigma-Aldrich84097
The MERLIN Compact VPZeiss
ThiocarbohydrazideAlfa AesarL01205
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379

References

  1. Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19 (2015).
  2. Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
  3. Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
  4. Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142 (2019).
  5. Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
  6. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
  7. Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
  8. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1 (2012).
  9. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833 (2016).
  10. Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
  11. Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
  12. Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
  13. Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
  14. Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
  15. Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
  16. Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
  17. Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
  18. Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
  19. Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
  20. Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
  21. Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
  22. Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994 (2020).
  23. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  24. Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
  26. Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
  27. Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
  28. Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
  29. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170 (2019).
  30. Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
  31. Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
  32. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  33. Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
  34. Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
  35. Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
  36. Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
  37. Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
  38. Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
  39. Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved