JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell'orecchio interno aviario.

Abstract

L'orecchio interno percepisce il suono e mantiene l'equilibrio usando la coclea e il vestibolo. Lo fa utilizzando un tipo di cellula meccanosensoriale dedicata nota come cellula ciliata. La ricerca di base nell'orecchio interno ha portato a una profonda comprensione di come funziona la cellula ciliata e di come la disregolazione può portare a perdita dell'udito e vertigini. Per questa ricerca, il topo è stato il sistema modello preminente. Tuttavia, i topi, come tutti i mammiferi, hanno perso la capacità di sostituire le cellule ciliate. Pertanto, quando si cerca di comprendere le terapie cellulari per ripristinare la funzione dell'orecchio interno, studi complementari in altre specie di vertebrati potrebbero fornire ulteriori approfondimenti. L'epitelio uditivo degli uccelli, la papilla basilare (BP), è un foglio di epitelio composto da cellule ciliate meccanosensoriali (HC) intercalate da cellule di supporto (SC). Sebbene l'architettura anatomica della papilla basilare e della coclea dei mammiferi differisca, i meccanismi molecolari dello sviluppo dell'orecchio interno e dell'udito sono simili. Questo rende la papilla basilare un sistema utile non solo per studi comparativi, ma anche per comprendere la rigenerazione. Qui, descriviamo le tecniche di dissezione e manipolazione per l'orecchio interno del pollo. La tecnica mostra metodi di inibizione genetica e di piccole molecole, che offrono un potente strumento per studiare i meccanismi molecolari dello sviluppo dell'orecchio interno. In questo articolo, discutiamo in ovo tecniche di elettroporazione per perturbare geneticamente la papilla basilare usando delezioni CRIPSR-Cas9, seguite dalla dissezione della papilla basilare. Dimostriamo anche la coltura dell'organo BP e l'uso ottimale delle matrici di coltura, per osservare lo sviluppo dell'epitelio e delle cellule ciliate.

Introduzione

L'orecchio interno di tutti i vertebrati deriva da un semplice epitelio noto come placode otico 1,2. Ciò darà origine a tutti gli elementi strutturali e ai tipi cellulari necessari per trasdurre le informazioni meccanosensoriali associate all'udito e all'equilibrio della percezione. Le cellule ciliate (HC), il sensore ciliato dell'orecchio interno, sono circondate da cellule di supporto (SC). Gli HC trasmettono informazioni al cervello posteriore uditivo attraverso i neuroni dell'ottavo nervo cranico. Questi sono anche generati dal placode otico3. La trasduzione primaria del suono si ottiene sulla superficie apicale dell'HC uditivo, attraverso un fascio di capelli meccanicamente sensibile4. Questo è mediato attraverso protrusioni modificate a base di actina chiamate stereociglia, che sono disposte in un modello graduato di scala5. Inoltre, un ciglio primario modificato, chiamato kinocilium, organizza la formazione di fasci di capelli ed è adiacente alla fila più alta di stereociglia 6,7,8. L'architettura delle stereociglia è fondamentale per questo ruolo nella conversione di stimoli meccanici derivati dall'energia acustica in segnali neurali elettrici9. Danni all'HC uditivo dovuti all'invecchiamento, all'infezione, al trauma otoacustico o allo shock ototossico possono provocare una perdita parziale o completa dell'udito che, nei mammiferi, è irreversibile10.

Sono state proposte terapie cellulari sostitutive che potrebbero riparare tali danni11,12. L'approccio di questa ricerca è stato quello di comprendere il normale sviluppo della cellula ciliata dei mammiferi e chiedere se i programmi di sviluppo possono essere riavviati in cellule simili a progenitori che possono esistere all'interno dell'orecchio interno13. Un secondo approccio è stato quello di guardare al di fuori dei mammiferi, ai vertebrati non mammiferi in cui avviene una robusta rigenerazione delle cellule ciliate uditive, come gli uccelli14,15. Negli uccelli, la rigenerazione delle cellule ciliate avviene prevalentemente attraverso la de-differenziazione di una cellula di supporto in uno stato simile a un progenitore, seguita da una divisione mitotica asimmetrica per generare una cellula ciliata e una cellula di supporto16. Inoltre, è stata osservata anche la differenziazione diretta di una cellula di supporto per generare una cellula ciliata17.

Mentre i meccanismi dello sviluppo uditivo aviario mostrano somiglianze significative con quello dei mammiferi, ci sono differenze18. La differenziazione di HC e SC nel pulcino BP è evidente dal giorno embrionale (E) 7, diventando più distinta nel tempo. Con E12, è possibile visualizzare una papilla basilare (BP) ben modellata e ben polarizzata, e da E17 si possono vedere cellule ciliate ben sviluppate19. Questi punti temporali forniscono finestre sui meccanismi di differenziazione, pattern e polarità, nonché sulla maturazione delle cellule ciliate. Capire se tali meccanismi sono conservati o divergenti è importante, in quanto forniscono informazioni sulla profonda omologia delle origini delle cellule ciliate meccanosensoriali.

Qui, dimostriamo una serie di tecniche eseguite nelle fasi embrionali iniziali e tardive per studiare i processi cellulari come la proliferazione, la specifica del destino, la differenziazione, il pattern e il mantenimento durante lo sviluppo dell'organo dell'orecchio interno. Questo integra altri protocolli sulla comprensione dello sviluppo dell'orecchio interno nella coltura di espianti20,21,22. Per prima cosa discutiamo l'introduzione di DNA esogeno o RNA nei precursori della BP all'interno dell'otocisti E3.5 utilizzando l'elettroporazione ovo. Sebbene le manipolazioni genetiche possano fornire preziose informazioni, i fenotipi così generati possono essere pleiotropici e di conseguenza confondenti. Ciò è particolarmente vero durante il successivo sviluppo dell'orecchio interno, dove processi fondamentali come il rimodellamento citoscheletrico svolgono molteplici ruoli nella divisione cellulare, nella morfogenesi dei tessuti e nella specializzazione cellulare. Presentiamo protocolli per l'inibizione farmacologica negli espianti in coltura, che offrono vantaggi nel controllo del dosaggio e dei tempi e della durata del trattamento, offrendo una precisa manipolazione spaziotemporale dei meccanismi di sviluppo.

Diversi metodi di coltura degli organi possono essere utilizzati a seconda della durata del trattamento di piccoli inibitori. Qui dimostriamo due metodi di coltura degli organi che consentono approfondimenti sulla morfogenesi epiteliale e sulla specializzazione cellulare. Un metodo per la coltura 3D che utilizza il collagene come matrice per coltivare il dotto cocleare consente una coltura robusta e una visualizzazione dal vivo della BP in via di sviluppo. Per comprendere la formazione di stereociglia, presentiamo un metodo di coltura a membrana tale che il tessuto epiteliale viene coltivato su una matrice rigida che consente alle protrusioni di actina di crescere liberamente. Entrambi i metodi consentono l'elaborazione a valle come l'imaging di cellule vive, l'immunoistochimica, la microscopia elettronica a scansione (SEM), la registrazione cellulare, ecc. Queste tecniche forniscono una tabella di marcia per l'uso efficace del pulcino come sistema modello per comprendere e manipolare lo sviluppo, la maturazione e la rigenerazione dell'epitelio uditivo aviario.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

I protocolli che coinvolgono l'approvvigionamento, la coltura e l'uso di uova di gallina fecondate ed embrioni non nati sono stati approvati dal Comitato etico animale istituzionale del Centro nazionale per le scienze biologiche, Bangalore, Karnataka.

1. Elettroporazione in ovo di precursori uditivi pulcini

  1. Progettazione e clonazione di sgRNA per il knockout del gene CRISPR/Cas9
    1. Per la creazione di knockout genici, gli RNA guida alla progettazione per interrompere le regioni dell'esone del gene, preferibilmente più vicino all'estremità 5' della regione codificante.
    2. Selezionare i potenziali RNA guida utilizzando uno strumento web CRISPOR23. Impostare i dati del browser su Gallus gallus e la sequenza del motivo adiacente del protospacer (PAM) su 5'- NGG -3'. Il programma determina gli RNA guida dalla sequenza di input e assegna punteggi diversi in base all'attività on-target e off-target. Seleziona le prime quattro guide per ulteriori studi.
    3. Per la progettazione di oligo specifici del modello per la produzione di RNA guida (g), rimuovere la sequenza PAM (5′- NGG -3′) dall'output dello strumento di progettazione del gRNA. Questo non è necessario per il targeting, ma contiene la sequenza di riconoscimento della scissione Cas9. Sintetizzare due oligo complementari purificati HPLC con sito di restrizione BsmBI ad entrambe le estremità, per ogni potenziale gRNA.
    4. Clonare la sequenza guida nel frame con un'impalcatura di tracrRNA di un vettore di scelta (qui, pcU6_1sgRNA vettore è stato utilizzato24).
    5. Sciogliere gli oligonucleotidi sgRNA ad una concentrazione di 100 μM in acqua priva di DNasi/RNasi. Eseguire la ricottura delle due oligoguide senso e antisenso utilizzando un termociclatore con i seguenti parametri: 95 °C per 3 minuti, poi 37 °C per 15 minuti, quindi diminuire a 4 °C.
    6. Utilizzando tecniche standard di biologia molecolare come descritto in25, impostare la digestione di restrizione degli oligo ricotti e pcU6_1sgRNA vettore di clonazione con enzima BsmBI durante la notte. Impostare la legatura con il vettore pcU6_1sgRNA lineare BsmBI-digerito con gel e gli oligo sgRNA digeriti. Trasformarsi in una cellula competente DH5-alfa e confermare la sequenza del clone ottenuto.
  2. Gestione delle uova e windowing
    1. Procurati le uova appena deposte e puliscile pulendole con etanolo al 70% per evitare la contaminazione. Incubare a 37-38 °C, con 45% di umidità per 3,5-4 giorni.
    2. Dopo l'incubazione, posizionare l'uovo su un lato per almeno 5 minuti prima di aprire. Ciò consente all'embrione di riposizionarsi nella parte superiore del tuorlo. Utilizzare una pinza per praticare piccoli fori nella parte superiore e un'estremità smussata dell'uovo in modo che un ago da 21 G possa passare attraverso.
    3. Per evitare danni durante il windowing, rimuovere l'albumina per abbassare l'embrione lontano dal guscio. Per fare ciò, utilizzare una siringa da 5 ml e un ago da 21 G per prelevare con cura 2 ml di albumina da un foro all'estremità smussata dell'uovo. Utilizzare del nastro trasparente per coprire il foro all'estremità smussata.
    4. Per creare la finestra dell'uovo, applicare del nastro trasparente sulla parte superiore del guscio d'uovo. Tagliare una finestra, lunga circa 2 cm e larga 1,5 cm, usando le forbici a molla ed esporre l'embrione. Utilizzare una pinza per aprire le membrane coriali sovrastanti l'embrione, consentendo l'accesso all'embrione.
  3. Plasmidi a microiniezione
    1. Per l'esperimento di knockout genico, preparare due soluzioni: la miscela knock-down contenente la proteina SpCas9 e il plasmide guida - pcU6_1sgRNA, e la miscela plasmidica tracciante di T2K-eGFP (questo è un promotore di ß-actina di pulcino che guida la cassetta GFP circondata dai siti di trasposone di Tol2) insieme al T2TP (la trasposasi Tol2 clonata nel costrutto Tol226,27). Il tracciante viene utilizzato per monitorare l'efficienza dell'elettroporazione.
    2. Quando si elettroporano più plasmidi, assicurarsi che la concentrazione finale di DNA sia di almeno 4 μg/μL. Mescolare i tre costrutti, plasmide guida - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP e T2TP, in un rapporto 1:1:1 con 1 μg di proteina SpCas9, 30% di saccarosio e 0,1% di colorante Fast Green in un volume finale di 10 μL.
    3. Tirare gli aghi per microiniezione da capillari di vetro standard (lunghezza 3 pollici, OD 1,0 mm) utilizzando un estrattore di pipette verticale. Utilizzare una pinza fine per rompere la punta capillare dopo aver tirato per ottenere un diametro della punta di circa 50 μm con un'estremità affusolata.
    4. Posare gli embrioni a E3.5 sul lato sinistro con la testa rivolta a destra. In questo modo solo la vescicola otica destra è accessibile per la microiniezione. Micro-iniettare la miscela knock-down nella vescicola otica. Iniettare circa un volume di 200 nL di miscela di soluzione di DNA per riempire la vescicola otica.
    5. Determinare l'efficienza della guida utilizzando un saggio di endonucleasi T728.
  4. Elettroporazione
    1. Aggiungere alcune gocce di soluzione salina allo 0,719% sulla parte superiore dell'embrione prima dell'elettroporazione per abbassare la resistenza elettrica e prevenire il surriscaldamento dell'embrione.
    2. Posizionare l'elettrodo positivo attraverso il foro praticato sul lato smussato dell'uovo quando l'albumina è stata rimossa. Manovra l'elettrodo in modo che sia sotto il tuorlo. Posizionare l'elettrodo negativo sopra l'otocisti riempita.
    3. Utilizzare l'elettroporazione per trasfettare i plasmidi nelle cellule dell'embrione. Utilizzare un generatore di impulsi quadrato e applicare cinque impulsi di 25 V e 100 ms di durata ciascuno, a 50 ms di distanza. Determinare le condizioni empiricamente in base a una configurazione di elettroporazione individuale.
    4. Idratare l'embrione dopo l'elettroporazione aggiungendo qualche goccia di soluzione salina allo 0,719%. Per pulire l'albumina denaturata dalla superficie degli elettrodi, sciacquarla accuratamente con acqua distillata. Richiudere l'uovo con nastro trasparente e tornare nell'incubatrice umidificata a 37-38 °C per un'ulteriore incubazione.
      NOTA: Gli embrioni possono essere coltivati fino alla schiusa dopo l'elettroporazione, tuttavia vi è una forte riduzione della vitalità.

2. Dissezione della papilla basilare

  1. Utilizzare etanolo al 70% per disinfettare il tavolo chirurgico, lo stadio del microscopio e l'area circostante. Il calore o l'alcol sterilizzano le apparecchiature di microdissezione che includono forbici minimamente a molla, micro-curette e due paia di pinze sottili.
  2. Preparare le seguenti piastre di dissezione: una capsula di Petri di vetro con una base di silicio nero, una capsula di Petri di plastica da 90 mm e una capsula di Petri da 60 mm. Raffreddare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) per le dissezioni.
  3. Rompere delicatamente l'uovo nella capsula di Petri da 90 mm. Identifica l'orecchio esterno del pulcino. Decapitare l'embrione tagliando il collo appena sotto il livello della mascella inferiore usando le forbici. Trasferire la testina in una capsula di Petri da 60 mm riempita con PBS ghiacciato.
  4. Orientare l'embrione con la parte superiore del becco rivolta verso lo sperimentatore e tenere il becco usando una delle pinze #5. Raccogli gli occhi usando la seconda pinza #5. Passando da rostrale a caudale, taglia il cranio lungo la sua linea mediana. Estrai il cervello.
  5. Aggiungi più PBS o HBSS ghiacciato e individua le due strutture lucide, vicino al livello del padiglione auricolare. Questi sono gli otoliti della lagena alla fine del dotto cocleare e si trovano vicino alla linea mediana.
  6. Tagliare approssimativamente tra le due lagene, e ben sopra e sotto questa regione per isolare due orecchie interne. Sotto l'illuminazione obliqua, visualizza il contorno dell'orecchio interno. Rimuovere il tessuto estraneo e il vestibolo.
  7. Trasferire la coclea isolata su una piastra di base in silicone nero con PBS ghiacciato. Utilizzando una pinza #5, rimuovere la capsula cocleare cartilaginea per ottenere il dotto cocleare. Individuare lo strato ondulato (tegmentum) del dotto cocleare e rimuovere usando una pinza #55 per esporre la BP. Utilizzando una pinza #55, rimuovere la membrana tettorica per esporre HC e SC.

3. Coltura di espianti di papilla basilare

  1. Coltura a membrana della BP
    1. Prendi una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti e disponi un inserto di membrana di coltura per pozzetto.
    2. Raccogliere la papilla basilare sezionata (espianto) in una pipetta da 200 μL con 1x tampone HBSS e trasferirla su una membrana. Per evitare che il tessuto si attacchi alla parete della pipetta, aspirare alcuni supporti prima di aspirare il tessuto.
    3. Orientare l'espianto in modo tale che la papilla basilare sia rivolta verso l'alto, in modo che i capelli e le cellule di supporto siano visibili dall'alto29. Una volta posizionato l'espianto, aspirare lentamente il tampone HBSS dalla superficie della membrana di coltura. In questo processo, l'espianto si attaccherà alla membrana di coltura.
    4. Aggiungere 1,2 ml di terreno di coltura Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco tra l'inserto della membrana e la parete del pozzo per riempire i pozzetti della piastra a sei pozzetti. Fino a sei espianti possono essere coltivati su una singola membrana di coltura da 30 mm.
  2. Coltura di collagene del dotto cocleare
    1. Preparare la miscela di collagene aggiungendo 400 μL di 3 mg/ml di collagene a coda di ratto, 50 μL di 10x DMEM, 30 μL di NaHCO3 al 7,5% e 5 μL di HEPES in una cappa di coltura tissutale.
    2. Prendi una piastra a quattro pozzetti e aggiungi tre gocce di miscela di collagene in ciascun pozzetto. Trasferire il dotto cocleare sezionato ad ogni goccia di collagene. Incubare la piastra per 10 minuti a 37 °C, 5% CO2 per polimerizzare la matrice di collagene.
  3. Trattamento di piccole molecole di colture
    1. Preparare terreni di coltura (DMEM, integratore N-2, penicillina) con il modulatore farmacologico o il suo solvente da solo (per l'uso come controllo). Sostituire i terreni di coltura con 700 μL di terreno integrato con l'inibitore. Coltura degli espianti in incubatrice a 37 °C, 5% CO2.
    2. Sostituire il 50% dei terreni di coltura ogni giorno. Dopo un adeguato tempo di incubazione, rimuovere i terreni di coltura e utilizzare gli espianti per i saggi a valle.

4. Imaging e analisi

  1. Analisi immunofluorescente
    1. Rimuovere i terreni di coltura dai pozzetti e lavare gli espianti due volte con 1x HBSS. Utilizzando una pipetta, aggiungere 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% nel pozzetto e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
    2. Rimuovere il PFA e lavare gli espianti tre volte con 1x PBS a temperatura ambiente. Per raccogliere gli espianti dalla membrana di coltura, fare un piccolo taglio attorno alla membrana contenente il pezzo di tessuto usando piccole forbici a molla e trasferire il tessuto insieme alla membrana su una piastra di coltura a 48 pozzetti usando una pinza.
      NOTA: Se i tessuti galleggiano dopo la fissazione, aspirare con una pipetta da 200 μL e trasferirla su piastre da 48 pozzetti per ulteriori elaborazioni. Evitare il distacco forzato del tessuto dalla membrana.
    3. Per la coltura di goccioline di collagene, utilizzare una pinza per trasferire l'intera goccia di collagene su una piastra di silicio. Aggiungere 200 μL di 1x PBS e rimuovere il collagene con l'aiuto di una pinza, quindi trasferire il tessuto in una piastra di coltura a 48 pozzetti.
    4. Permeabilizzare gli espianti con 1 mL di 1x PBS integrato con 0,3% Tween-20 (PBST) per 30 minuti a temperatura ambiente. Incubare gli espianti con 200 μL di tampone bloccante (10% siero di capra + 1% albumina sierica bovina in PBST) per 1 h a temperatura ambiente.
    5. Incubare gli espianti con 200 μL di soluzione anticorpale primaria (1:300, in tampone bloccante) per una notte a 4 °C. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare accuratamente gli espianti 5 x 20 minuti con PBST.
    6. Incubare gli espianti con 200 μL di falloidina e soluzione anticorpale secondaria (in tampone bloccante) per 1 ora a temperatura ambiente al buio. Rimuovere la falloidina e la soluzione anticorpale secondaria e lavare accuratamente gli espianti 5 x 20 minuti con PBST.
      NOTA: la concentrazione di anticorpi secondari e la lunghezza del lavaggio devono essere determinate per ogni singola applicazione di imaging. Per l'imaging mediante microscopia a super risoluzione, in genere aumentiamo la concentrazione dell'anticorpo secondario da 1:500 a 1:200 e aumentiamo la concentrazione di falloidina da 1:400 a 1:200.
    7. Incubare gli espianti con una soluzione di DAPI (1:1000 in PBST) per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione DAPI e lavare gli espianti 3 x 5 minuti con PBST.
    8. Utilizzare il supporto di montaggio per montare gli espianti su una slitta con la pressione rivolta verso l'alto (contro il coprivetrino). Per l'imaging confocale utilizzare supporti di montaggio antidissolvenza. Lasciare asciugare il supporto di montaggio durante la notte a temperatura ambiente al buio. Visualizzare direttamente l'immagine o conservare i vetrini a 4 °C fino all'imaging.
  2. Fissazione OTOTO per analisi SEM
    1. Preparare tutte le soluzioni fresche e maneggiare secondo le linee guida di sicurezza locali. Fissare gli espianti coltivati a membrana (dal punto 4.1.4) in glutaraldeide al 2,5% in tampone cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,3) con 3 mM CaCl2. Eseguire la fissazione a 4 °C per 24-72 ore con un cambio di fissativo ogni 24 ore.
    2. Rimuovere il fissativo e lavare il tessuto con cacodilato di sodio 0,1 M 3 x 5 min a temperatura ambiente. Correzione secondaria con OsO4 all'1% (diluito da un brodo di OsO 4 al4 % utilizzando tampone cacodilato di sodio 0,1 M) per 1 ora a temperatura ambiente. Eseguire questo e i passaggi successivi fino alla disidratazione in una cappa aspirante.
    3. Risciacquare con tampone cacodilato di sodio 0,1 M 3 x 5 min a temperatura ambiente. Quindi risciacquare in acqua bidistillata o ultrapura 3 x 5 minuti a temperatura ambiente.
    4. Preparare una soluzione allo 0,5% di tiocarboidrazide (TCH) in acqua ultrapura. Agitare a 75 °C per 10 minuti e filtrare la soluzione quando si è raffreddata a temperatura ambiente.
      NOTA: TCH è estremamente pericoloso. L'uso deve essere approvato dal comitato di sicurezza locale e deve essere prestata attenzione durante la manipolazione.
    5. Rimuovere l'acqua ultrapura dal campione e aggiungere lo 0,5% di TCH goccia a goccia. Se la soluzione diventa marrone, fermarsi e sciacquare il campione con acqua ultrapura, prima di aggiungere con attenzione la soluzione di TCH allo 0,5%. Una volta che la soluzione è limpida, sostituirla con 0,5% TCH. Incubare a temperatura ambiente per 20 min30,31.
    6. Risciacquare il campione con acqua ultrapura 3 x 5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere i passaggi 4.2.2, 4.2.3 e 4.2.5 altre due volte terminando con l'incubazione di OsO4 seguita dal risciacquo.
    7. Disidratare i campioni in una serie di etanolo al 100% anidro (EtOH). Incubare prima in ETOH al 25% per 10 minuti, poi al 50% ETOH per 10 minuti, al 75% EtOH per 10 minuti, al 95% ETOH per 10 minuti, prima di incubare per un totale di 3x per 10 minuti ciascuno in ETOH al 100%.
    8. Eseguire l'essiccazione dei punti critici utilizzando CO2 liquido. Montare immediatamente i campioni su un tronchetto SEM con nastro biadesivo in carbonio. Procedere allo sputter coat per fornire 5-10 nm di rivestimento. Se non si esegue immediatamente l'imaging, conservare i campioni in un essiccatore sotto vuoto.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Nella configurazione dell'elettroporazione, il posizionamento degli elettrodi può svolgere un ruolo nel dominio della trasfezione. L'elettrodo positivo è posto sotto il tuorlo e il negativo sopra l'embrione (Figura 1A). Ciò si traduce in una maggiore espressione di GFP in gran parte dell'orecchio interno e di entrambi gli organi vestibolari (Figura 1B) e nella papilla basilare uditiva (Figura 1C, D), confermando ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Il pulcino è un'aggiunta economica e conveniente agli organismi modello che un laboratorio può utilizzare per la ricerca sull'orecchio interno. I metodi qui descritti sono abitualmente utilizzati nel nostro laboratorio e completano la ricerca in corso nell'orecchio interno dei mammiferi. Nell'ovo l'elettroporazione viene utilizzata per introdurre manipolazioni genetiche nel genoma del pulcino. L'elettroporazione può anche essere usata per introdurre costrutti che codificano proteine fluorescenti mirate a part...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgazioni

Gli autori non hanno interessi concorrenti da rivelare.

Riconoscimenti

Riconosciamo con gratitudine il supporto di NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB e Royal National Institute for the Deaf. Vorremmo ringraziare Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru. Siamo grati al supporto di CIFF e EM facility and lab presso NCBS. Ringraziamo Yoshiko Takahashi e Koichi Kawakami per i costrutti Tol2-eGFP e T2TP, e Guy Richardson per l'HCA e l'anticorpo G19 Pcdh15. Siamo grati ai membri di Earlab per il loro costante supporto e prezioso feedback sul protocollo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3Integrated DNA Technologies1081061High fidelity Cas9 protein
Anti-GFP antibodyAbcamab290Rabbit polyclonal to GFP
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647
Calcium Chloride DihydrateThermo Fisher ScientificQ12135
Collagen I, rat tailThermo Fisher ScientificA1048301
Critical Point Dryer Leica EM CPD300Leica
CUY-21 ElectroporatorNepagene
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
DM5000B Widefield MicroscopeLeica
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvateThermo Fisher Scientific10569010
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-20
Dumont #55 ForcepsFine Science Tools11255-20
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252
FluoroshieldSigma-AldrichF6182
FLUOVIEW 3000 Laser Scanning MicroscopeOlympus
Glutaraldehyde (25 %)Sigma-Aldrich340855
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11001
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11032
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11008
Goat Serum Sterile filteredHiMediaRM10701Heat inactivated
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific14025092
LSM980 Airyscan MicroscopeZeiss
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µmSigma-AldrichPICM03050
MVX10 Stereo MicroscopeOlympus
MYO7A antibodyDSHB138-1Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa
MZ16 Dissecting microscopeLeica
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502048
Noyes Scissors, 14cm (5.5'')World Precision Instruments501237
Osmium tetroxide (4%)Sigma-Aldrich75632
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PC-10 PullerNarishige
pcU6_1sgRNAAddgene92395Mini vector with modified chicken U6 promoter
Penicillin G sodium saltSigma-AldrichP3032
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36934
SMZ1500 Dissecting microscopeNikon
Sodium Cacodylate Buffer, 0.2MElectron Microscopy Sciences11652
Sodium chlorideHiMediaGRM853
Sputtre Coater K550XEmitech
Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No FilamentWorld Precision Instruments1B100-3
SucroseSigma-Aldrich84097
The MERLIN Compact VPZeiss
ThiocarbohydrazideAlfa AesarL01205
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379

Riferimenti

  1. Sai, X., Ladher, R. K. Early steps in inner ear development: induction and morphogenesis of the otic placode. Frontiers in Pharmacology. 6, 19(2015).
  2. Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139 (2), 245-257 (2012).
  3. Driver, E. C., Kelley, M. W. Development of the cochlea. Development. 147 (12), (2020).
  4. Richardson, G. P., Petit, C. Hair-bundle links: genetics as the gateway to function. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (12), 033142(2019).
  5. Tilney, L. G., Cotanche, D. A., Tilney, M. S. Actin filaments, stereocilia and hair cells of the bird cochlea. VI. How the number and arrangement of stereocilia are determined. Development. 116 (1), 213-226 (1992).
  6. Jones, C., et al. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. Nature Genetics. 40 (1), 69-77 (2008).
  7. Sipe, C. W., Lu, X. Kif3a regulates planar polarization of auditory hair cells through both ciliary and non-ciliary mechanisms. Development. 138 (16), 3441-3449 (2011).
  8. May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1 (1), 1(2012).
  9. Ebrahim, S., et al. Stereocilia-staircase spacing is influenced by myosin III motors and their cargos espin-1 and espin-like. Nature Communications. 7, 10833(2016).
  10. Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-1774 (1988).
  11. Collado, M. S., Burns, J. C., Hu, Z., Corwin, J. T. Recent advances in hair cell regeneration research. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 16 (5), 465-471 (2008).
  12. Edge, A. S., Chen, Z. Y. Hair cell regeneration. Current Opinion in Neurobiology. 18 (4), 377-382 (2008).
  13. Atkinson, P. J., Huarcaya Najarro, E., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Sensory hair cell development and regeneration: similarities and differences. Development. 142 (9), 1561-1571 (2015).
  14. Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and fins: non-mammalian models for hair cell regeneration. Brain Research. 1277, 12-23 (2009).
  15. Rubel, E. W., Furrer, S. A., Stone, J. S. A brief history of hair cell regeneration research and speculations on the future. Hearing Research. 297, 42-51 (2013).
  16. Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 633-647 (2007).
  17. Roberson, D. W., Alosi, J. A., Cotanche, D. A. Direct transdifferentiation gives rise to the earliest new hair cells in regenerating avian auditory epithelium. Journal of Neuroscience Research. 78 (4), 461-471 (2004).
  18. Fritzsch, B., Beisel, K. W., Pauley, S., Soukup, G. Molecular evolution of the vertebrate mechanosensory cell and ear. The International Journal of Developmental Biology. 51 (6-7), 663-678 (2007).
  19. Tilney, L. G., DeRosier, D. J. Actin filaments, stereocilia, and hair cells of the bird cochlea. IV. How the actin filaments become organized in developing stereocilia and in the cuticular plate. Developmental Biology. 116 (1), 119-129 (1986).
  20. Oesterle, E. C., Tsue, T. T., Reh, T. A., Rubel, E. W. Hair-cell regeneration in organ cultures of the postnatal chicken inner ear. Hearing Research. 70 (1), 85-108 (1993).
  21. Honda, A., Freeman, S. D., Sai, X., Ladher, R. K., O'Neill, P. From placode to labyrinth: culture of the chicken inner ear. Methods. 66 (3), 447-453 (2014).
  22. Matsunaga, M., et al. Initiation of supporting cell activation for hair cell regeneration in the avian auditory epithelium: an explant culture model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 583994(2020).
  23. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  24. Gandhi, S., Piacentino, M. L., Vieceli, F. M., Bronner, M. E. Optimization of CRISPR/Cas9 genome editing for loss-of-function in the early chick embryo. Developmental Biology. 432 (1), 86-97 (2017).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (11), (2021).
  26. Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 305 (2), 616-624 (2007).
  27. Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Transposon-mediated stable integration and tetracycline-inducible expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Methods in Cell Biology. 87, 271-280 (2008).
  28. Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9 (2), 177-183 (1995).
  29. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).
  30. Davies, S., Forge, A. Preparation of the mammalian organ of Corti for scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 147, 89-101 (1987).
  31. Parker, A., Chessum, L., Mburu, P., Sanderson, J., Bowl, M. R. Light and electron microscopy methods for examination of cochlear morphology in mouse models of deafness. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (3), 272-306 (2016).
  32. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
  33. Goodyear, R. J., Forge, A., Legan, P. K., Richardson, G. P. Asymmetric distribution of cadherin 23 and protocadherin 15 in the kinocilial links of avian sensory hair cells. The Journal of Comparative Neurology. 518 (21), 4288-4297 (2010).
  34. Bartolami, S., Goodyear, R., Richardson, G. Appearance and distribution of the 275 kD hair-cell antigen during development of the avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 777-788 (1991).
  35. Funahashi, J., Nakamura, H. Electroporation in avian embryos. Methods in Molecular Biology. 461, 377-382 (2008).
  36. Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation: past, present and future. Development, Growth & Differentiation. 55 (1), 15-19 (2013).
  37. Olaya-Sanchez, D., et al. Fgf3 and Fgf16 expression patterns define spatial and temporal domains in the developing chick inner ear. Brain Structure & Function. 222 (1), 131-149 (2017).
  38. Jones, J. M., Warchol, M. E. Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear. The Journal of Comparative Neurology. 516 (6), 507-518 (2009).
  39. Serralbo, O., et al. Transgenesis and web resources in quail. Elife. 9, 56312(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Biologia dello svilupponumero 184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati