طريقة بصرية حساسة للكشف عن البكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن البكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين مع بروتوكول معدل يستخدم لترسيب كبريتيد البزموت (BS). المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها سهلة التقييم ولا تتطلب معدات متخصصة.

Abstract

كبريتيد الهيدروجين (H₂S) هو غاز سام تنتجه البكتيريا في التحلل البروتيني للأحماض الأمينية والبروتينات المحتوية على الكبريت والتي تلعب دورا مهما في صحة الإنسان. يعد اختبار إنتاج H₂S أحد اختبارات تحديد الهوية الكيميائية الحيوية البكتيرية المهمة. الطرق التقليدية ليست فقط مملة وتستغرق وقتا طويلا ولكنها أيضا عرضة لتثبيط نمو البكتيريا بسبب التأثير السام لأملاح المعادن الثقيلة في الوسط المحتوي على الكبريت ، مما يؤدي غالبا إلى نتائج سلبية. هنا ، أنشأنا طريقة بسيطة وحساسة للكشف عن H₂S في البكتيريا. هذه الطريقة هي نسخة معدلة من ترسيب كبريتيد البزموت (BS) الذي يستخدم 96 لوحة معايرة شفافة جيدا. تم دمج الثقافة البكتيرية مع محلول البزموت الذي يحتوي على L-cysteine وزراعته لمدة 20 دقيقة ، وفي النهاية لوحظ راسب أسود. كان حد الكشف البصري ل H 2 S_0.2mM. بناء على تغير اللون المرئي ، يمكن تحقيق الكشف البسيط وعالي الإنتاجية والسريع للبكتيريا المنتجة ل H₂S. باختصار ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد إنتاج H₂S في البكتيريا.

Introduction

يمكن للبكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين استخدام الأحماض الأمينية والبروتينات المحتوية على الكبريت لإنتاج كبريتيد الهيدروجين (H₂S). يحدث إنتاج H₂S عادة في بكتيريا عائلة Enterobacteriaceae سالبة الجرام وأيضا في أعضاء Citrobacter spp. و Proteus spp. و Edwardsiella spp. و Shewanella spp.1. هذه البكتيريا لديها القدرة على تقليل الكبريتات إلى كبريتيد الهيدروجين (H₂S) من أجل الحصول على الطاقة. وقد تورط كبريتيد الهيدروجين في تطوير مقاومة البكتيريا للأدوية. يحمي H 2 S البكتيريا من سمية أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وبالتالي يعادي التأثير المضاد للبكتيريا^{للمضادات الحيوية 2,3}. H₂S له أيضا تأثير فسيولوجي مهم في الحفاظ على الاتزان الداخلي. على المستويات فوق الفسيولوجية ، ثبت أن H₂S سام للغاية للجسم. في جسم الإنسان ، يلعب H₂S دورا آخر كجزيء إشارات غاز يشارك في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية والمرضية. يمكن ل H₂S تنظيم الوظيفة الانقباضية للقلب ويلعب دورا فسيولوجيا مهما في استرخاء الأوعية الدموية ، وتثبيط إعادة تشكيل الأوعية الدموية ، وحماية عضلة القلب ^4,5. يلعب H₂S أيضا دورا مهما في تنظيم الجهاز العصبي والجهاز الهضمي ^6,7. لقد وجد أنه عند تعرضها للمضادات الحيوية المبيدة للجراثيم ، تنتج البكتيريا أنواع الأكسجين التفاعلية القاتلة (ROS) مما يؤدي إلى موت الخلايا⁸،^9،10،11.

كاختبار كيميائي حيوي شائع في دورات المختبرات الميكروبيولوجية ، يعد اختبار كبريتيد الهيدروجين تجربة مهمة في تحديد البكتيريا ، وخاصة بكتيريا عائلة Enterobacteriaceae. في الوقت الحاضر ، يتم إجراء اختبار كبريتيد الهيدروجين عادة على عدد كبير من الأحماض الأمينية المحتوية على الكبريت ووسط أسيتات الرصاص الملقح بالبكتيريا المراد اختبارها. بعد فترة من الحضانة (2-3 أيام) ، يتم الحكم على النتائج من خلال ملاحظة ما إذا كان وسط الاستزراع أو شريط ورق أسيتات الرصاص أسود بسبب إنتاج أسيتات الرصاص¹¹. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق التقليدية ليست مملة وتستغرق وقتا طويلا فحسب ، بل إنها أيضا عرضة لتثبيط نمو البكتيريا بسبب التأثير السام لأملاح المعادن الثقيلة في الوسط المحتوي على الكبريت ، مما يؤدي غالبا إلى نتائج سلبية. تم إنشاء طريقة قائمة على البزموت للكشف عن H₂S^12,13. يمكن أن يتفاعل H₂S مع البزموت ، مكونا هطول كبريتيد البزموت الأسود. من أجل إجراء إصلاح لهذا الاختبار الكيميائي الحيوي ، يجب إنشاء طريقة بسيطة وسريعة بدون آثار جانبية على نمو البكتيريا. هنا ، أنشأنا طريقة بسيطة للكشف عن البكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين التي تنمو في بيئة في المختبر باستخدام كبريتيد البزموت كركيزة في شكل لوحة عيار ميكرو 96 بئرا.

Protocol

1. السلالات البكتيرية

ملاحظة: في هذه التجربة ، تم استخدام تسع سلالات قياسية ، بما في ذلك السالمونيلا نظيرة التيفية A ، والسالمونيلا نظيرة التيفية B ، و Fusobacterium nucleatum ، والمكورات المعوية البرازية ، والمكورات العنقودية الذهبية ، و Pseudomonas aeruginosa PAO1 ، و Aeromonas hydrophila YJ-1 ، و Proteus vuigaris ، و Klebsiella pneumoniae (الجدول 1). السالمونيلا نظيرة التيفية يمكن أن تنتج A و Fusobacterium nucleatum و Pseudomonas aeruginosa و Proteus vuigaris H₂S ، كما هو موضح في الأدبيات السابقة¹.

1. تحضير الثقافة البكتيرية
   1. نقل مستعمرة بكتيرية واحدة من السالمونيلا نظيرة التيفية A ، السالمونيلا نظيرة التيفية B ، المكورات المعوية البرازية ، المكورات العنقودية الذهبية ، Pseudomonas aeruginosa PAO1 ، Aeromonas hydrophila YJ-1 ، و Klebsiella pneumoniae من صفيحة أجار لوريا بيرتاني (LB) إلى 100 مل من وسط LB وزراعتها عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة حتى يصبح تركيز البكتيريا حوالي 1 × 10⁹ خلايا / مل (كما هو موضح بواسطة OD₆₀₀ = 1).
   2. نقل مستعمرة بكتيرية واحدة من Fusobacterium nucleatum و Proteus vuigaris من ألواح أجار مرق الصويا (TSB) إلى 100 مل من وسط TSB وزراعتها عند 37 درجة مئوية لاهوائيا لمدة 24 ساعة حتى يصبح تركيز البكتيريا حوالي 1 × 10⁹ خلايا / مل (كما هو موضح في OD₆₀₀ = 1).

2. فحص الكشف H₂S

1. اختبار إنتاج كبريتيد الهيدروجين
   1. امزج 100 ميكرولتر من المستنبتة البكتيرية مع 100 ميكرولتر من محلول البزموت المحضر حديثا (الرقم الهيدروجيني 8.0 ؛ 10 مللي مول كلوريد البزموت (III) ، 0.4 M ثلاثي إيثانولامين حمض الهيدروكلوريك ، 20 mM بيريدوكسال 5-فوسفات أحادي الهيدرات ، 20 mM EDTA ، و 40 mM L-cysteine) في 96 بئرا من ألواح العيار الدقيق والمزرعة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لكل سلالة بكتيرية ، قم بإجراء التحليل في ثلاث نسخ.
   2. بعد 20 دقيقة ، تحقق من تغيير اللون. إذا تغير لون المحلول من الأصفر الفاتح إلى الأسود ، فهذا يشير إلى أن البكتيريا قادرة على إنتاج H₂S. كرر هذا القياس 3x.
2. حساسية الطريقة
   1. حدد حساسية الطريقة باستخدام تركيزات مختلفة من هيدرو كبريتيد الصوديوم (NaHS): 2 mM ، 1 mM ، 0.8 mM ، 0.6 mM ، 0.4 mM ، 0.2 mM ، 0.1 mM ، و 0 mM ، ممزوجة بمحلول BS ¹⁴.
   2. أوجد وجود ^HS−/S²⁻ من خلال ملاحظة تكوين راسب BS أسود. سجل لون الآبار باستخدام مقياس مرئي من عدم إنتاج اللون (-) إلى إنتاج اللون الأسود الداكن (++++++).

النتائج

الكشف عن البكتيريا المنتجة لكبريتيد الهيدروجين
تم التحقيق في أداء اختبار H2 S باستخدام مزارع نقية من سلالات بكتيرية مختارة ، كما هو موضح في الجدول 1. أشارت النتائج إلى أن السالمونيلا نظيرة التيفية B ، و Fusobacterium nucleatum ، والمكورات المعوية البرازية ، و Pseudomonas aerugi...

Discussion

اختبار إنتاج كبريتيد الهيدروجين هو أحد اختبارات النمط الظاهري التقليدية لتحديد وتمايز السلالات البكتيرية. يمكن للعديد من الأنواع البكتيرية إنتاج كبريتيد الهيدروجين في بيئتها الطبيعية ، مثل المياه المائية. تشمل هذه الأنواع البكتيرية السالمونيلا sp. ، Citrobacter sp. ، Proteus sp. ، Ps...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bismuth (III)chloride	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	7787-60-2
EDTA	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd	60-00-4
Enterococcus faecalis	ATCC	19433
Fusobacterium nucleatum	ATCC	25586
Klebsiella pneumoniae	ATCC	43816
L-cysteine	Amresco	52-90-4
Proteus vuigaris	CMCC	49027
Salmonella paratyphi A	CMCC	50001
Salmonella paratyphi B	CMCC	50094
Staphylococcus aureus	ATCC	25923
Triethanolamine-HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	637-39-8