Hidrojen Sülfür Üreten Bakterilerin Tespiti için Hassas Bir Görsel Yöntem

Özet

Burada, bizmut sülfür (BS) çökeltmesi için kullanılan modifiye edilmiş bir protokol ile hidrojen sülfür üreten bakterileri tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemin en önemli avantajları, değerlendirilmesinin kolay olması ve özel ekipman gerektirmemesidir.

Özet

Hidrojen sülfür (_H2S), insan sağlığında önemli rol oynayan kükürt içeren amino asit ve proteinlerin proteolizinde bakteriler tarafından üretilen toksik bir gazdır. H2S üretim testi, önemli bakteriyel biyokimyasal tanımlama testlerinden biridir. Geleneksel yöntemler sadece sıkıcı ve zaman alıcı değil, aynı zamanda kükürt içeren ortamdaki ağır metal tuzlarının toksik etkisi nedeniyle bakteriyel büyümenin inhibisyonuna eğilimlidir ve bu da genellikle olumsuz sonuçlara yol açar. Burada, bakterilerde_H2S'yi tespit etmek için basit ve hassas bir yöntem oluşturduk. Bu yöntem, 96 kuyucuklu şeffaf mikrotitre plakaları kullanan bizmut sülfür (BS) çökeltmesinin değiştirilmiş bir versiyonudur. Bakteri kültürü, L-sistein içeren bizmut çözeltisi ile birleştirildi ve sonunda siyah bir çökelti gözlenen 20 dakika boyunca ekildi. H2 S için görsel algılamasınırı 0,2 mM idi. Görsel renk değişimine bağlı olarak,_H2S üreten bakterilerin basit, yüksek verimli ve hızlı tespiti sağlanabilir. Özetle, bu yöntem bakterilerde_H2S üretimini tanımlamak için kullanılabilir.

Giriş

Hidrojen sülfür üreten bakteriler, hidrojen sülfür (_H2S) üretmek için kükürt içeren amino asitleri ve proteinleri kullanabilir. H2 S üretimigenellikle gram-negatif Enterobacteriaceae ailesi bakterilerinde ve ayrıca Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. ve Shewanella spp.1 üyelerinde görülür. Bu bakteriler, enerji elde etmek için sülfatı hidrojen sülfüre (_H2S) indirgeme yeteneğine sahiptir. Hidrojen sülfür, bakteriyel ilaç direncinin gelişiminde rol oynamıştır. _H2S, bakterileri reaktif oksijen türlerinin (ROS) toksisitesinden korur, böylece antibiyotiklerin antibakteriyel etkisini antagonize eder ^2,3. _H2S ayrıca homeostazın korunmasında önemli bir fizyolojik etkiye sahiptir. Suprafizyolojik seviyelerde,_H2S'nin vücut için derinden toksik olduğu gösterilmiştir. İnsan vücudunda,_H2S, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde yer alan bir gaz sinyal molekülü olarak başka bir role sahiptir. _H2S, kalbin sistolik fonksiyonunu düzenleyebilir ve kan damarlarının gevşetilmesinde, vasküler yeniden şekillenmenin inhibe edilmesinde ve miyokard ^4,5'in korunmasında önemli bir fizyolojik rol oynar. _H2S ayrıca sinir sistemi ve sindirim sisteminin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ^6,7. Bakterilerin bakterisidal antibiyotiklere maruz kaldıklarında hücre ölümüne yol açan ölümcül reaktif oksijen türleri (ROS) ürettikleri bulunmuştur 8,9,10,11.

Mikrobiyolojik laboratuvar derslerinde yaygın bir biyokimyasal test olan hidrojen sülfür testi, bakterilerin, özellikle de Enterobacteriaceae familyasının bakterilerinin tanımlanmasında önemli bir deneydir. Şu anda, hidrojen sülfür testi genellikle test edilecek bakterilerle aşılanmış çok sayıda kükürt içeren amino asit ve kurşun asetat ortamı üzerinde gerçekleştirilmektedir. Bir inkübasyon süresinden sonra (2-3 gün), sonuçlar, kurşun asetat üretimi nedeniyle kültür ortamının veya kurşun asetat kağıt şeridinin kararıp kararmadığı gözlemlenerek değerlendirilir¹¹. Bununla birlikte, bu geleneksel yöntemler sadece sıkıcı ve zaman alıcı değil, aynı zamanda kükürt içeren ortamdaki ağır metal tuzlarının toksik etkisi nedeniyle bakteriyel büyümenin inhibisyonuna eğilimlidir ve bu da genellikle olumsuz sonuçlara yol açar. _H2S^12,13'ün tespiti için bizmut tabanlı bir yöntem oluşturulmuştur. _H2S, bizmut ile reaksiyona girerek siyah bizmut sülfür çökeltmesi oluşturabilir. Bu biyokimyasal test için bir reform yapmak için, bakteri büyümesi üzerinde hiçbir yan etkisi olmayan basit ve hızlı bir yöntem oluşturulması gerekmektedir. Burada, 96 delikli mikrotitre plaka formatında substrat olarak bizmut sülfür kullanılarak in vitro bir ortamda yetiştirilen hidrojen sülfür üreten bakterilerin tespiti için basit bir yöntem oluşturduk.

Protokol

1. Bakteri suşları

NOT: Bu deney için Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris ve Klebsiella pneumoniae dahil olmak üzere dokuz standart suş kullanılmıştır (Tablo 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa ve Proteus vuigaris, önceki literatür^1'de belirtildiği gibi_H2S üretebilir.

1. Bakteri kültürünün hazırlanması
   1. Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 ve Klebsiella pneumoniae'nin bir bakteri kolonisini bir Luria-Bertani (LB) agar plakasından 100 mL LB ortamına ve kültürüne 12-16 saat boyunca 37 ° C'de bakteri konsantrasyonu yaklaşık 1 x 10^{9 hücre /} mL olana kadar (OD₆₀₀ = 1 ile gösterildiği gibi) aktarın.
   2. Fusobacterium nucleatum ve Proteus vuigaris'in bir bakteri kolonisini, triptikaz soya suyu (TSB) agar plakalarından, bakteri konsantrasyonu yaklaşık 1 x 10^{9 hücre /} mL olana kadar 24 saat boyunca anaerobik olarak 37 ° C'de 100 mL TSB ortamına ve kültürüne aktarın (OD₆₀₀ = 1 ile gösterildiği gibi).

2. H₂S tespit testi

1. Hidrojen sülfür üretim testi
   1. 100 μL bakteri kültürünü, 100 μL yeni hazırlanmış bizmut çözeltisi (pH 8.0; 10 mM bizmut (III) klorür, 0.4 M trietanolamin-HCl, 20 mM piridoksal 5-fosfat monohidrat, 20 mM EDTA ve 40 mM L-sistein) ile 96 kuyucuklu mikrotitre plakalarında ve kültüründe 37 °C'de 20 dakika boyunca karıştırın. Her bakteri suşu için, analizi üçlü olarak gerçekleştirin.
   2. 20 dakika sonra renk değişikliği olup olmadığını kontrol edin. Çözeltinin rengi açık sarıdan siyaha değişirse, bu bakterilerin_H2S üretebildiğini gösterir.
2. Yöntemin hassasiyeti
   1. Farklı konsantrasyonlarda sodyum hidrosülfür (NaHS) kullanarak yöntemin duyarlılığını belirleyin: BS çözeltisi ¹⁴ ile karıştırılmış 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM ve 0 mM.
   2. Siyah bir BS çökeltisinin oluşumunu gözlemleyerek HS−/^S2− varlığını belirleyin. Renk üretimi yok (-) ile en koyu siyah renk üretimine (+++++++) kadar görsel bir ölçek kullanarak kuyuların rengini puanlayın.

Sonuçlar

Hidrojen sülfür üreten bakterilerin tespiti
H2 S testininperformansı, Tablo 1'de listelendiği gibi, seçilmiş bakteri suşlarının saf kültürleri kullanılarak araştırılmıştır. Sonuçlar, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa ve Proteus vuigaris'in siyah BS çökeltisi ile_H2S üretebildiğini, Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aero...

Tartışmalar

Hidrojen sülfür üretim testi, bakteri suşlarının tanımlanması ve farklılaştırılması için geleneksel fenotipik testlerden biridir. Birçok bakteri türü, su suyu gibi doğal ortamlarında hidrojen sülfür üretebilir. Bu bakteri türleri arasında Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., bazı Klebsiella sp., Escherichia coli suşları ve bazı anaerobik Clostridia türleri^15,16<...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bismuth (III)chloride	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	7787-60-2
EDTA	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd	60-00-4
Enterococcus faecalis	ATCC	19433
Fusobacterium nucleatum	ATCC	25586
Klebsiella pneumoniae	ATCC	43816
L-cysteine	Amresco	52-90-4
Proteus vuigaris	CMCC	49027
Salmonella paratyphi A	CMCC	50001
Salmonella paratyphi B	CMCC	50094
Staphylococcus aureus	ATCC	25923
Triethanolamine-HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	637-39-8