שיטה חזותית רגישה לאיתור חיידקים מייצרי מימן גופרתי

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי חיידקים מייצרי מימן גופרתי עם פרוטוקול שונה המשמש למשקעים ביסמוט סולפיד (BS). היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי קל להעריך ואינו דורש ציוד מיוחד.

Abstract

מימן גופרתי (H₂S) הוא גז רעיל המיוצר על ידי חיידקים בפרוטאוליזה של חומצות אמינו וחלבונים המכילים גופרית הממלא תפקיד חשוב בבריאות האדם. בדיקת הייצור H₂S היא אחת מבדיקות הזיהוי הביוכימיות החשובות של חיידקים. השיטות המסורתיות הן לא רק מייגעות וגוזלות זמן, אלא גם נוטות לעכב את צמיחת החיידקים בשל ההשפעה הרעילה של מלחי מתכות כבדות בתווך המכיל גופרית, מה שמוביל לעתים קרובות לתוצאות שליליות. כאן הקמנו שיטה פשוטה ורגישה לזיהוי H₂S בחיידקים. שיטה זו היא גרסה שונה של משקעי ביסמוט סולפיד (BS) המשתמשת בלוחות מיקרוטיטר שקופים של 96 בארות. תרבית חיידקים שולבה עם תמיסת ביסמוט המכילה L-ציסטאין וטופחה במשך 20 דקות, שבסופה נצפה משקע שחור. מגבלת הזיהוי החזותי עבור H 2 S הייתה_0.2מילימול. בהתבסס על שינוי הצבע החזותי, ניתן להשיג זיהוי פשוט, בעל תפוקה גבוהה ומהיר של חיידקים מייצרי H₂S. לסיכום, שיטה זו יכולה לשמש לזיהוי ייצור H₂S בחיידקים.

Introduction

חיידקים המייצרים מימן גופרתי יכולים לנצל חומצות אמינו וחלבונים המכילים גופרית כדי לייצר מימן גופרתי (H₂S). הייצור של H₂S מתרחש בדרך כלל בחיידקים ממשפחת Enterobacteriaceae גראם-שליליים וגם בחברים Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. ו-Shewanella ^spp.1. חיידקים אלה יש את היכולת להפחית סולפט לתוך מימן גופרתי (H₂S) על מנת לקבל אנרגיה. מימן גופרתי היה מעורב בפיתוח עמידות חיידקית לתרופות. H₂S מגן על חיידקים מפני הרעילות של מיני חמצן תגובתי (ROS), ובכך נוגד את ההשפעה האנטיבקטריאלית של אנטיביוטיקה ^2,3. H₂S יש גם השפעה פיזיולוגית חשובה בשמירה על הומאוסטזיס. ברמות העל-פיזיולוגיות, H₂S הוכח כרעיל מאוד לגוף. בגוף האדם, H₂S יש תפקיד נוסף כמולקולת איתות גז המעורבת במגוון תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. H₂S יכול לווסת את התפקוד הסיסטולי של הלב וממלא תפקיד פיזיולוגי חשוב בהרפיית כלי הדם, עיכוב עיצוב מחדש של כלי הדם והגנה על שריר הלב ^4,5. H₂S גם משחק תפקיד חשוב בוויסות מערכת העצבים ומערכת העיכול ^6,7. נמצא כי כאשר הם נחשפים לאנטיביוטיקה קוטלת חיידקים, חיידקים מייצרים מיני חמצן תגובתי קטלניים (ROS) המובילים למוות תאי 8,9,10,11.

כבדיקה ביוכימית נפוצה בקורסי מעבדה מיקרוביולוגיים, בדיקת מימן גופרתי היא ניסוי חשוב בזיהוי חיידקים, במיוחד חיידקים ממשפחת Enterobacteriaceae. כיום, בדיקת מימן גופרתי מבוצעת בדרך כלל על מספר רב של חומצות אמינו המכילות גופרית ומדיום אצטט עופרת המחוסנים בחיידקים לבדיקה. לאחר תקופה של דגירה (2-3 ימים), התוצאות נשפטות על ידי התבוננות אם מדיום התרבית או רצועת נייר אצטט עופרת מושחרים בגלל ייצור אצטט עופרת¹¹. עם זאת, שיטות מסורתיות אלה הן לא רק מייגעות וגוזלות זמן, אלא גם נוטות לעכב את צמיחת החיידקים בשל ההשפעה הרעילה של מלחי מתכות כבדות בתווך המכיל גופרית, מה שמוביל לעתים קרובות לתוצאות שליליות. נקבעה שיטה מבוססת ביסמוט לזיהוי H₂S^12,13. H₂S יכול להגיב עם ביסמוט, וליצור משקעים גופרתיים ביסמוט שחור. על מנת לבצע רפורמה בבדיקה ביוכימית זו, יש לקבוע שיטה פשוטה ומהירה ללא תופעות לוואי על צמיחת חיידקים. כאן, הקמנו שיטה פשוטה לזיהוי חיידקים מייצרי מימן גופרתי הגדלים בסביבה חוץ גופית באמצעות ביסמוט סולפיד כמצע בפורמט צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות.

Protocol

1. זני חיידקים

הערה: בניסוי זה נעשה שימוש בתשעה זנים סטנדרטיים, כולל סלמונלה פאראטיפי A, סלמונלה פאראטיפי B, פוסובקטריום נוקלאטום, אנטרוקוקוס פאקליס, סטפילוקוקוס זהוב, Pseudomonas aeruginosa PAO1, אירומונס הידרופילה YJ-1, Proteus vuigaris ודלקת ריאות קלבסיאלה (טבלה 1). סלמונלה פאראטיפי A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa, ו Proteus vuigaris יכול לייצר H₂S, כפי שתואר בספרות קודמת¹.

1. הכנת תרבית חיידקים
   1. העבר מושבת חיידקים אחת של סלמונלה paratyphi A, סלמונלה paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, ודלקת ריאות Klebsiella מצלחת אגר Luria-Bertani (LB) ל 100 מ"ל של LB בינוני ותרבית ב 37 ° C במשך 12-16 שעות עד ריכוז החיידקים הוא בערך 1 x 10⁹ תאים / מ"ל (כפי שמצוין על ידי OD₆₀₀ = 1).
   2. העבר מושבת חיידקים אחת של Fusobacterium nucleatum ו- Proteus vuigaris מצלחות אגר של מרק סויה טריפטיקז (TSB) ל -100 מ"ל של TSB בינוני ותרבית ב 37 ° C אנאירובית במשך 24 שעות עד ריכוז החיידקים הוא בערך 1 x 10⁹ תאים / מ"ל (כפי שמצוין על ידי OD₆₀₀ = 1).

2. בדיקת זיהוי H₂S

1. בדיקת ייצור מימן גופרתי
   1. יש לערבב 100 μL של תרבית חיידקים עם 100 μL של תמיסת ביסמוט שהוכנה לאחרונה (pH 8.0; 10 mM ביסמוט (III) כלוריד, 0.4 M triethanolamine-HCl, 20 mM פירידוקסל 5-פוספט מונוהידרט, 20 mM EDTA ו-40 mM L-ציסטאין) בצלחות מיקרוטיטר 96 בארות ובתרבית במשך 20 דקות ב-37°C. עבור כל זן חיידקי, לבצע את הניתוח משולש.
   2. לאחר 20 דקות, בדוק אם יש שינוי צבע. אם צבע התמיסה משתנה מצהוב בהיר לשחור, הדבר מצביע על כך שהחיידקים מסוגלים לייצר H₂S. חזור על מדידה זו 3x.
2. רגישות השיטה
   1. לקבוע את הרגישות של השיטה באמצעות ריכוזים שונים של hydrosulfide נתרן (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM, ו 0 mM, מעורבב עם BS פתרון ¹⁴.
   2. קבע את נוכחותו של HS−/S²⁻ על ידי התבוננות בהיווצרות של משקע BS שחור. הניקוד את צבע הבארות באמצעות סולם חזותי מהפקת צבע ללא ייצור צבע (-) להפקת צבע שחור כהה ביותר (++++++).

תוצאות

איתור חיידקים מימנים גופרתיים
הביצועים של בדיקת H₂S נחקרו באמצעות תרביות טהורות של זני חיידקים נבחרים, כמפורט בטבלה 1. התוצאות הצביעו על כך שסלמונלה פאראטיפי B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, ו- Proteus vuigaris יכולים לייצר H₂S עם משקע BS שח?...

Discussion

בדיקת ייצור מימן גופרתי היא אחת הבדיקות הפנוטיפיות המקובלות לזיהוי והתמיינות של זני חיידקים. מיני חיידקים רבים יכולים לייצר מימן גופרתי בסביבתם הטבעית, כגון מים ימיים. מיני חיידקים אלה כוללים סלמונלה sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., כמה זנים של Klebsiella sp., Escherichia coli,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bismuth (III)chloride	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	7787-60-2
EDTA	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd	60-00-4
Enterococcus faecalis	ATCC	19433
Fusobacterium nucleatum	ATCC	25586
Klebsiella pneumoniae	ATCC	43816
L-cysteine	Amresco	52-90-4
Proteus vuigaris	CMCC	49027
Salmonella paratyphi A	CMCC	50001
Salmonella paratyphi B	CMCC	50094
Staphylococcus aureus	ATCC	25923
Triethanolamine-HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	637-39-8