Um Método Visual Sensível para a Detecção de Bactérias Produtoras de Sulfeto de Hidrogênio

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para detecção de bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio com um protocolo modificado usado para precipitação de sulfeto de bismuto (BS). As principais vantagens deste método são que é fácil de avaliar e não requer equipamentos especializados.

Resumo

O sulfeto de hidrogênio (H₂S) é um gás tóxico produzido por bactérias na proteólise de aminoácidos e proteínas contendo enxofre que desempenha um papel importante na saúde humana. O teste de produção de H₂S é um dos importantes testes de identificação bioquímica bacteriana. Os métodos tradicionais não são apenas tediosos e demorados, mas também propensos à inibição do crescimento bacteriano devido ao efeito tóxico dos sais de metais pesados em meio contendo enxofre, o que muitas vezes leva a resultados negativos. Aqui, estabelecemos um método simples e sensível para detectar H₂S em bactérias. Este método é uma versão modificada da precipitação de sulfeto de bismuto (BS) que usa placas de microtitulação transparentes de 96 poços. A cultura bacteriana foi combinada com solução de bismuto contendo L-cisteína e cultivada por 20 min, ao final do qual um precipitado negro foi observado. O limite de detecção visual para H 2 S foi de_0,2mM. Com base na mudança de cor visual, a detecção simples, de alto rendimento e rápida de bactérias produtoras de H₂S pode ser alcançada. Em resumo, este método pode ser usado para identificar a produção de H₂S em bactérias.

Introdução

As bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio podem utilizar aminoácidos e proteínas contendo enxofre para produzir sulfeto de hidrogênio (H₂S). A produção de H₂S ocorre geralmente em bactérias da família Enterobacteriaceae gram-negativas e também em membros de Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp., e Shewanella spp.1. Essas bactérias têm a capacidade de reduzir o sulfato em sulfeto de hidrogênio (H₂S) para obter energia. O sulfeto de hidrogênio tem sido implicado no desenvolvimento de resistência bacteriana a drogas. O H 2 S protege as bactérias da toxicidade das espécies reativas de oxigênio (EROs), antagonizando o efeito antibacteriano dos antibióticos ^2,3. H₂S também tem um efeito fisiológico importante na manutenção da homeostase. Em níveis suprafisiológicos, H₂S tem sido mostrado para ser profundamente tóxico para o corpo. No corpo humano, H₂S tem outro papel como uma molécula de sinalização de gás que está envolvida em uma variedade de processos fisiológicos e patológicos. A H₂S pode regular a função sistólica do coração e desempenha importante papel fisiológico no relaxamento dos vasos sanguíneos, inibindo o remodelamento vascular e protegendo o miocárdio ^4,5. A H₂S também desempenha um papel importante na regulação do sistema nervoso e do trato digestivo ^6,7. Verificou-se que, quando expostas a antibióticos bactericidas, as bactérias produzem espécies reativas letais de oxigênio (EROs), levando à morte celular 8,9,10,11.

Como um teste bioquímico comum em cursos de laboratório microbiológico, o teste de sulfeto de hidrogênio é um experimento importante na identificação de bactérias, especialmente bactérias da família Enterobacteriaceae. Atualmente, o teste de sulfeto de hidrogênio é geralmente realizado em um grande número de aminoácidos contendo enxofre e meio acetato de chumbo inoculado com as bactérias a serem testadas. Após um período de incubação (2-3 dias), os resultados são julgados observando-se se o meio de cultura ou a tira de papel acetato de chumbo está enegrecido devido à produção de acetato de chumbo¹¹. No entanto, esses métodos tradicionais não são apenas tediosos e demorados, mas também propensos à inibição do crescimento bacteriano devido ao efeito tóxico de sais de metais pesados em meio contendo enxofre, o que muitas vezes leva a resultados negativos. Um método baseado em bismuto foi estabelecido para a detecção de H₂S^12,13. H₂S pode reagir com bismuto, formando precipitação de sulfeto de bismuto preto. A fim de realizar uma reforma para este teste bioquímico, um método simples e rápido, sem efeitos colaterais sobre o crescimento bacteriano precisa ser estabelecido. Aqui, montamos um método simples para a detecção de bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio cultivadas em ambiente in vitro usando sulfeto de bismuto como substrato em um formato de placa de microtitulação de 96 poços.

Protocolo

1. Cepas bacterianas

NOTA: Para este experimento, nove cepas padrão foram utilizadas, incluindo Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris e Klebsiella pneumoniae (Tabela 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa e Proteus vuigaris podem produzir H₂S, como descrito na literatura anterior¹.

1. Preparo da cultura bacteriana
   1. Transferir uma colônia bacteriana de Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 e Klebsiella pneumoniae de uma placa de ágar Luria-Bertani (LB) para 100 mL de meio LB e cultura a 37 °C por 12-16 h até que a concentração bacteriana seja de cerca de 1 x 10⁹ células/mL (conforme indicado por OD₆₀₀ = 1).
   2. Transferir uma colônia bacteriana de Fusobacterium nucleatum e Proteus vuigaris de placas de ágar caldo de soja tripticase (TSB) para 100 mL de meio TSB e cultura a 37 °C por via anaeróbia por 24 h até que a concentração bacteriana seja de cerca de 1 x 10⁹ células/mL (conforme indicado por OD₆₀₀ = 1).

2. Ensaio de detecção de H₂S

1. Teste de produção de sulfeto de hidrogênio
   1. Misturar 100 μL de cultura bacteriana com 100 μL de solução de bismuto recém-preparada (pH 8,0; cloreto de bismuto (III) 10 mM, 0,4 M de trietanolamina-HCl, piridoxal 20 mM 5-fosfato monohidratado, 20 mM EDTA e 40 mM L-cisteína) nas placas de microtitulação de 96 poços e cultura por 20 min a 37 °C. Para cada cepa bacteriana, realizar a análise em triplicata.
   2. Após 20 min, verifique se há mudança de cor. Se a cor da solução mudar de amarelo claro para preto, isso indica que a bactéria é capaz de produzir H₂S. Repita esta medida 3x.
2. Sensibilidade do método
   1. Determinar a sensibilidade do método utilizando diferentes concentrações de hidrossulfeto de sódio (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM e 0 mM, misturados com solução BS ¹⁴.
   2. Determinar a presença de HS−/S²⁻ observando a formação de um precipitado BS preto. Pontuar a cor dos poços usando uma escala visual de nenhuma produção de cores (-) para a produção de cores pretas mais escuras (++++++).

Resultados

Detecção de bactérias produtoras de sulfeto de hidrogênio
O desempenho do teste H₂S foi investigado por meio de culturas puras de cepas bacterianas selecionadas, conforme listado na Tabela 1. Os resultados indicaram que Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa e Proteus vuigaris podem produzir H₂S com precipitado BS preto, enquanto Salmonella paratyphi A, Staphylococ...

Discussão

O teste de produção de sulfeto de hidrogênio é um dos testes fenotípicos convencionais para a identificação e diferenciação de cepas bacterianas. Muitas espécies bacterianas podem produzir sulfeto de hidrogênio em seu ambiente natural, como a água aquática. Essas espécies bacterianas incluem Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., algumas cepas de Klebsiella sp., Escherichia coli e algumas espécies anaeróbias de Clostridia

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bismuth (III)chloride	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	7787-60-2
EDTA	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd	60-00-4
Enterococcus faecalis	ATCC	19433
Fusobacterium nucleatum	ATCC	25586
Klebsiella pneumoniae	ATCC	43816
L-cysteine	Amresco	52-90-4
Proteus vuigaris	CMCC	49027
Salmonella paratyphi A	CMCC	50001
Salmonella paratyphi B	CMCC	50094
Staphylococcus aureus	ATCC	25923
Triethanolamine-HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	637-39-8