Eine empfindliche visuelle Methode zum Nachweis von Schwefelwasserstoff produzierenden Bakterien

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von Schwefelwasserstoff produzierenden Bakterien mit einem modifizierten Protokoll vor, das für die Wismutsulfid (BS)-Fällung verwendet wird. Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie einfach zu bewerten ist und keine spezielle Ausrüstung erfordert.

Zusammenfassung

Schwefelwasserstoff (_H2S) ist ein giftiges Gas, das von Bakterien bei der Proteolyse schwefelhaltiger Aminosäuren und Proteine produziert wird und eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit spielt. Der_{H2S-Produktionstest}ist einer der wichtigsten bakteriellen biochemischen Identifikationstests. Die traditionellen Methoden sind nicht nur mühsam und zeitaufwändig, sondern neigen auch dazu, das Bakterienwachstum aufgrund der toxischen Wirkung von Schwermetallsalzen in schwefelhaltigen Medien zu hemmen, was oft zu negativen Ergebnissen führt. Hier haben wir eine einfache und sensitive Methode etabliert, um_H2Sin Bakterien nachzuweisen. Bei dieser Methode handelt es sich um eine modifizierte Version der Wismutsulfid (BS)-Fällung, bei der transparente 96-Well-Mikrotiterplatten verwendet werden. Die Bakterienkultur wurde mit einer L-Cysteinhaltigen Wismutlösung kombiniert und 20 min lang kultiviert, an deren Ende ein schwarzer Niederschlag beobachtet wurde. Die visuelle Nachweisgrenze für H 2 S lag bei_0,2mM. Anhand des visuellen Farbwechsels kann eine einfache, durchsatzreiche und schnelle Detektion von_{H2S-produzierenden}Bakterien erreicht werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit dieser Methode die_{H2S-Produktion}in Bakterien nachgewiesen werden kann.

Einleitung

Schwefelwasserstoff produzierende Bakterien können schwefelhaltige Aminosäuren und Proteine nutzen, um Schwefelwasserstoff (_H2S) herzustellen. Die Produktion von_H2Serfolgt in der Regel in gramnegativen Bakterien der Familie der Enterobacteriaceae sowie in Mitgliedern von Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. und Shewanella spp.1. Diese Bakterien haben die Fähigkeit, Sulfat zu Schwefelwasserstoff (_H2S) zu reduzieren, um Energie zu gewinnen. Schwefelwasserstoff wird mit der Entwicklung bakterieller Arzneimittelresistenzen in Verbindung gebracht. _H2Sschützt Bakterien vor der Toxizität reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und wirkt so der antibakteriellen Wirkung von Antibiotika entgegen ^2,3. _H2Shat auch eine wichtige physiologische Wirkung bei der Aufrechterhaltung der Homöostase. Auf supraphysiologischer Ebene hat sich_H2Sals hochgradig toxisch für den Körper erwiesen. Im menschlichen Körper hat_H2Seine weitere Rolle als gasförmiges Signalmolekül, das an einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt ist. _H2Skann die systolische Funktion des Herzens regulieren und spielt eine wichtige physiologische Rolle bei der Entspannung der Blutgefäße, der Hemmung des Gefäßumbaus und dem Schutz des Myokards ^4,5. _H2Sspielt auch eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Nervensystems und des Verdauungstraktes ^6,7. Es wurde festgestellt, dass Bakterien, wenn sie bakteriziden Antibiotika ausgesetzt sind, tödliche reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produzieren, die zum Zelltod führen 8,9,10,11.

Als gängiger biochemischer Test in mikrobiologischen Laborkursen ist der Schwefelwasserstofftest ein wichtiges Experiment zur Identifizierung von Bakterien, insbesondere Bakterien der Familie Enterobacteriaceae. Derzeit wird der Schwefelwasserstofftest in der Regel an einer Vielzahl von schwefelhaltigen Aminosäuren und Bleiacetatmedium durchgeführt, die mit den zu testenden Bakterien beimpft sind. Nach einer Inkubationszeit (2-3 Tage) werden die Ergebnisse beurteilt, indem beobachtet wird, ob das Nährmedium oder der Bleiacetat-Papierstreifen aufgrund der Bleiacetatproduktion geschwärzt ist¹¹. Diese traditionellen Methoden sind jedoch nicht nur mühsam und zeitaufwändig, sondern neigen auch dazu, das Bakterienwachstum aufgrund der toxischen Wirkung von Schwermetallsalzen in schwefelhaltigen Medien zu hemmen, was oft zu negativen Ergebnissen führt. Für den Nachweis von H2S^12,13 wurde ein Wismut-basiertes Verfahren etabliert. _H2Skann mit Wismut reagieren und schwarze Wismutsulfidausfällung bilden. Um eine Reform für diesen biochemischen Test durchzuführen, muss eine einfache und schnelle Methode ohne Nebenwirkungen auf das Bakterienwachstum etabliert werden. Hier haben wir eine einfache Methode zum Nachweis von Schwefelwasserstoff produzierenden Bakterien entwickelt, die in einer in vitro Umgebung unter Verwendung von Wismutsulfid als Substrat in einem 96-Well-Mikrotiterplattenformat gezüchtet wurden.

Protokoll

1. Bakterienstämme

HINWEIS: Für dieses Experiment wurden neun Standardstämme verwendet, darunter Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigaris und Klebsiella pneumoniae (Tabelle 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa und Proteus vuigaris können_H2Sproduzieren, wie in der bisherigen Literatur^{beschrieben 1}.

1. Vorbereitung der Bakterienkultur
   1. Übertragen Sie eine Bakterienkolonie von Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 und Klebsiella pneumoniae von einer Luria-Bertani (LB)-Agarplatte auf 100 ml LB-Medium und Kultur bei 37 °C für 12-16 h, bis die Bakterienkonzentration etwa 1 x 10⁹ Zellen/ml beträgt (wie durch OD₆₀₀ = 1 angegeben).
   2. Übertragen Sie eine Bakterienkolonie von Fusobacterium nucleatum und Proteus vuigaris von Trypticase-Sojabrühe-Agarplatten (TSB) auf 100 ml TSB-Medium und kultivieren Sie sie bei 37 °C anaerob für 24 h, bis die Bakterienkonzentration etwa 1 x 10⁹ Zellen/ml beträgt (wie durch OD₆₀₀ = 1 angegeben).

2. H2S-Detektionsassay

1. Test zur Herstellung von Schwefelwasserstoff
   1. Mischen Sie 100 μl Bakterienkultur mit 100 μl neu hergestellter Wismutlösung (pH 8,0; 10 mM Wismut(III)-chlorid, 0,4 M Triethanolamin-HCl, 20 mM Pyridoxal-5-Phosphat-Monohydrat, 20 mM EDTA und 40 mM L-Cystein) in den 96-Well-Mikrotiterplatten und kultivieren Sie sie 20 min lang bei 37 °C. Führen Sie für jeden Bakterienstamm die Analyse in dreifacher Ausfertigung durch.
   2. Prüfen Sie nach 20 Minuten, ob sich die Farbe verändert hat. Ändert sich die Farbe der Lösung von hellgelb nach schwarz, deutet dies darauf hin, dass das Bakterium in der Lage ist,_H2Szu produzieren. Wiederholen Sie diese Messung 3x.
2. Sensitivität der Methode
   1. Bestimmen Sie die Sensitivität der Methode unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von Natriumhydrosulfid (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM und 0 mM, gemischt mit BS-Lösung ¹⁴.
   2. Bestimmen Sie das Vorhandensein von HS−/S²⁻ durch Beobachtung der Bildung eines schwarzen BS-Niederschlags. Bewerten Sie die Farbe der Vertiefungen mit einer visuellen Skala von keiner Farberzeugung (-) bis zur dunkelsten schwarzen Farberzeugung (++++++).

Ergebnisse

Nachweis von Schwefelwasserstoff-produzierenden Bakterien
Die Leistungsfähigkeit des_H2S-Testswurde anhand von Reinkulturen ausgewählter Bakterienstämme untersucht, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa und Proteus vuigaris _H2Smit schwarzem BS-Niederschlag produzieren können, während Salmonella paratyphi A,

Diskussion

Der Schwefelwasserstoffproduktionstest ist einer der konventionellen phänotypischen Tests zur Identifizierung und Differenzierung von Bakterienstämmen. Viele Bakterienarten können in ihrer natürlichen Umgebung, wie z. B. Wasser, Schwefelwasserstoff produzieren. Zu diesen Bakterienarten gehören Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., einige Stämme von Klebsiella sp., Escherichia coli und einige Arten von anaeroben Clostridien

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bismuth (III)chloride	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	7787-60-2
EDTA	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd	60-00-4
Enterococcus faecalis	ATCC	19433
Fusobacterium nucleatum	ATCC	25586
Klebsiella pneumoniae	ATCC	43816
L-cysteine	Amresco	52-90-4
Proteus vuigaris	CMCC	49027
Salmonella paratyphi A	CMCC	50001
Salmonella paratyphi B	CMCC	50094
Staphylococcus aureus	ATCC	25923
Triethanolamine-HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	637-39-8