JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

طور البروتوكول الحالي طريقة لتقدير إنتاجية المركبات على لوحة TLC باستخدام تقنية الإضاءة الزرقاء LED. تتمثل مزايا هذا النهج في أنه آمن وفعال وغير مكلف ويسمح للباحث بقياس عينات متعددة في وقت واحد.

Abstract

كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) هي تقنية تحليلية يمكن الوصول إليها تم استخدامها على نطاق واسع في أبحاث الكيمياء العضوية لتحديد عائد العينات غير المعروفة. طورت الدراسة الحالية طريقة فعالة ورخيصة وآمنة لتقدير إنتاجية العينات على لوحة TLC باستخدام مصباح LED الأزرق. كان لوفاستاتين المستخرج من Aspergillus terreus هو المثال المركب المستخدم في الدراسة الحالية. تم استخدام نماذج الانحدار القائمة على معيار لوفاستاتين لتقييم محصول لوفاستاتين. تمت مقارنة ثلاث طرق: الفحص الحيوي ، والكشف عن الأشعة فوق البنفسجية ، وإضاءة LED الزرقاء. أظهرت النتائج أن طريقة إضاءة LED الزرقاء أكثر فعالية من حيث الوقت من طرق الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية والمقايسة الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، كانت إضاءة LED الزرقاء خيارا آمنا نسبيا بسبب القلق من المخاطر البيولوجية في طريقة الفحص الحيوي (مثل العدوى الميكروبية) والتعرض للأشعة فوق البنفسجية في طريقة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية. مقارنة بالطرق باهظة الثمن التي تتطلب أدوات متخصصة وتدريبا طويل الأجل قبل العمل بشكل مستقل ، مثل GC و HPLC و HPTLC ، كان استخدام مصباح LED الأزرق خيارا اقتصاديا لتقدير إنتاجية العينات من لوحة TLC.

Introduction

يستخدم كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) على نطاق واسع كتقنية نوعية وكمية في مجال الكيمياء العضوية1،2،3. تتمثل المزايا الرئيسية ل TLC في أنه يوفر كشفا سريعا ومتطلبات عينة مرنة ولا يتطلب معدات متخصصة4. حتى الآن ، على الرغم من إنشاء العديد من الأساليب المتقدمة ، لا يزال TLC هو الطريقة الرئيسية لتحديد العينات غير المعروفة في الخليط. ومع ذلك ، فإن التحدي الذي يواجهه هذا النهج هو عدم وجود معدات آمنة وغير مكلفة لتحديد عائد العينة ، خاصة لتطوير المختبرات ذات الميزانيات المحدودة. لذلك ، هدفت الدراسة الحالية إلى تطوير طريقة فعالة وآمنة وغير مكلفة تتحد مع TLC لتقدير إنتاجية العينات.

على عكس TLC عالي الأداء (HPTLC) ، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) ، وكروماتوغرافيا الغاز (GC) مع متطلبات عينة صارمة ، وتستغرق وقتا طويلا ، وإشراك خطوات متعددة لإعداد العينات 1,5 ، أظهر TLC العديد من المزايا. أولا ، لإعداد العينة ، لا يمكن ل HPLC و GC اكتشاف المستخلص الخام لأن المستخلص الخام قد يسد عمود HPLC و GC. ثانيا ، عندما لا تكون العينات مناسبة للأشعة فوق البنفسجية (مهمة لتحليل HPLC) أو ذات تقلب منخفض (مهم لتحليل GC) ، يمكن تطبيق TLC على هذه العينات ، واستخدام كاشف التصور يجعل العينات المعزولة مرئية على طبقات رقيقة6،7،8. ثالثا ، بالنسبة للمستخدمين العاديين ، يتطلب HPLC و GC عموما وقتا طويلا نسبيا قبل التدريب قبل العمل بشكل مستقل ، مقارنة ب TLC. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لتحليل TLC الكمي ، المعروف باسم TLC عالي الأداء (HPTLC) ، رقمنة المعلومات الموجودة على لوحة TLC باستخدام ماسح ضوئي شديد الحساسية. ومع ذلك ، فإن تكلفة نظام HPTLC مكلفة نسبيا. على هذا النحو ، يعد تطوير نهج فعال من حيث التكلفة وسريع لتحديد العينات على لوحة TLC موضوعا مهما.

وقد وضعت أساليب مماثلة لتحديد كمية غلة TLC؛ على سبيل المثال ، أبلغ جونسون9 عن تقنية تسمح بتحديد كمية العينات على لوحة TLC باستخدام ماسح ضوئي مسطح متصل بجهاز كمبيوتر. في عام 2001 ، طور الجندي وآخرون 10 طريقة TLC- قياس الكثافة ، والتي تم استخدامها للكشف عن المركب بكثافة بصرية ، وتم تطبيق هذه التقنية أيضا بواسطة Elkady et al.11. في عام 2007 ، قدم Hess2 طريقة TLC (DE-TLC) المحسنة رقميا المطبقة للكشف عن عائد مركب على لوحة TLC باستخدام كاميرا رقمية مدمجة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. قارن هيس أيضا فروق التكلفة بين طريقة HPTLC و DE-TLC وخلص إلى أنه يمكن استخدام طريقة DE-TLC في مختبرات المدارس الثانوية والكليات بسبب تكلفتها المعقولة2. ومع ذلك ، كانت تكلفة طريقة TLC-densitometric لا تزال باهظة الثمن ، ويتطلب تشغيل الأشعة فوق البنفسجية تدريبا مسبقا كافيا في حالة تعرض المستخدمين للأشعة فوق البنفسجية. لذلك ، متوافق مع TLC ، من المستحسن تطوير طريقة فعالة وآمنة وغير مكلفة لتحديد عائد العينة.

وصفت الدراسة الحالية بروتوكولا للكشف عن العينة على لوحة TLC باستخدام مصباح LED الأزرق ، وطورت نموذج انحدار بموثوقية عالية (قيمة R مربعة عالية) لقياس أبعاد النطاقات ، ثم تحديد العائد المركب. أخيرا ، وجد أن طريقة إضاءة LED الزرقاء آمنة نسبيا (مقابل. طريقة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية) ، رخيصة (مقابل. GC و HPLC و HPTLC) ، ونهج فعال (مقابل طريقة المقايسة الحيوية) لتحديد كمية الغلة.

Protocol

يوصف البروتوكول الحالي باستخدام لوفاستاتين كمثال. تم استخراج لوفاستاتين من فطر الرشاشيات تيريوس البالغ من العمر أسبوعا واحدا.

1. استخراج مركب

ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول استخراج المركب ، يرجى الاطلاع على الشكل 1.

  1. ثقافة الرشاشيات تيريوس على أجار سكر العنب البطاطس (PDA ، انظر جدول المواد) وسط عند 30 درجة مئوية.
  2. جفف المزرعة عند 40 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. انقل المزرعة المجففة إلى أنبوب سعة 50 مل باستخدام ملاقط معقمة وأضف 15 مل من أسيتات الإيثيل.
  3. رج الخليط بقوة عن طريق التحريك لمدة دقيقة واحدة واحتضانه لمدة 1 ساعة عند 40 درجة مئوية مع الرج عند 200 دورة في الدقيقة.
  4. سونيك الخليط باستخدام حمام بالموجات فوق الصوتية 40 كيلو هرتز (انظر جدول المواد) عند 40 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. قم بالطرد المركزي للخليط على حرارة 5000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وقم بالتصفية من خلال ورق ترشيح 11 ميكرومتر.
  6. استخراج المرشح مع حجم متساو من الماء المعقم في قمع فصل.
  7. بعد فصل الطور ، اجمع الطبقة العضوية ، ثم تبخر في مبخر دوار (انظر جدول المواد). حل البقايا في 2 مل من خلات الإيثيل.

2. فصل المستخلص الخام بواسطة عمود امتزاز المرحلة العادية (NP)

  1. قم بتعبئة العمود بهلام السيليكا NP كمرحلة ثابتة ، واستخدم n-hexane: خلات الإيثيل: حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (H: E: T ؛ 80: 20: 0.1 ، v / v / v) كمرحلة متحركة.
  2. قم بتحميل 2 مل من المستخلص (الخطوة 1) على العمود وأضف مذيب الطور المتحرك بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة لتقليب المستخلص.
    ملاحظة: تم التحكم في معدل التدفق يدويا باستخدام محبس.
  3. تحقق من النفايات السائلة بواسطة TLC للتأكد من وجود لوفاستاتين ، ثم تتبخر في مبخر دوار عند 45 درجة مئوية حتى تتم إزالة المذيب. تستغرق هذه الخطوة حوالي 20-25 دقيقة.
  4. قم بإذابة البقايا في 1 مل من أسيتات الإيثيل ، ثم اخلطها مع حجم متساو من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 1٪.
  5. الطرد المركزي الخليط في 5000 × غرام لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وجمع الطبقة العضوية في أنبوب زجاجي جديد.

3. تحضير وتحميل ألواح كروماتوجرام رقيقة الطبقة (TLC)

  1. ضع 5 ميكرولتر من العينات ومعايير لوفاستاتين (انظر جدول المواد) على خط الأساس للوحة TLC باستخدام ماصة شعرية ، تاركا حدا يبلغ 1 سم على جانبي لوحة TLC.
  2. جفف طبق TLC في غطاء دخان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. ضع اللوحة برفق بواسطة ملقط في غرفة زجاجية مشبعة تحتوي على مذيب الطور المتحرك. قم بتغطية الحجرة بغطاء زجاجي واترك اللوحة تتطور بالكامل.
  4. أخرج اللوحة من الحجرة عندما يصل خط المذيب إلى 1 سم من أعلى اللوحة.

4. تحليل بواسطة مصباح LED أزرق

  1. ضع علامة على خط المذيبات بقلم رصاص. جفف الطبق في غطاء الدخان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. بعد التجفيف ، انقع اللوحة على الفور في مذيب 10٪ H2SO4 ، ثم جفف في غطاء الدخان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. ضع اللوحة على لوحة التسخين حتى تظهر البقع البنية. تأكد من عدم ارتفاع درجة حرارة اللوحة ، لأن هذا قد يجعل تصور لوفاستاتين صعبا.
  4. انقل اللوحة إلى مصباح LED الأزرق وامسحها ضوئيا باستخدام برنامج مجاني متوافق (MiBio Fluo) (انظر جدول المواد).

5. تقدير العائد بواسطة نموذج الانحدار

  1. قم بقياس أبعاد النطاقات باستخدام برنامج ImageJ (انظر جدول المواد).
  2. إنشاء نموذج انحدار باستخدام برنامج تحليل البيانات والرسوم البيانية (انظر جدول المواد) بناء على التركيزات التنازلية لمعايير لوفاستاتين ، بما في ذلك 1 مجم / مل و 0.75 مجم / مل و 0.5 مجم / مل و 0.25 مجم / مل.
  3. تطبيق نموذج الانحدار لتقدير عائد العينات.

النتائج

قدمت هذه الدراسة طريقة إضاءة LED الزرقاء لتقدير إنتاجية المركبات ، وتم التحقق من صحة هذه الطريقة ومقارنتها بالطرق المكتشفة للأشعة فوق البنفسجية (الجدول 1). تم تطوير نماذج الانحدار بناء على أبعاد النطاقات وتركيز المعايير لثلاث طرق ، على التوالي ، للتنبؤ بإنتاجية العينات. أولا ، في ن...

Discussion

وصفت الدراسة الحالية نهجا جديدا ، وهو مصباح LED الأزرق ، لقياس المركبات دون استخدام معدات باهظة الثمن ومتخصصة ، مثل طريقة HPTLC و HPLC و GC ، وتمت مقارنة الطريقة مع طرق المقايسة الحيوية والأشعة فوق البنفسجية المكتشفة لتقييم أداء القياس الكمي. نتيجة لذلك ، تم استنتاج أن طريقة إضاءة LED الزرقاء هي بر...

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا ، تايوان (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
American bacteriological AgarCondalab1802.00
Aspergillus terreus ATCC 20542
Blue-LED illuminatorMICROTEKBio-1000F
CentrifugeThermo Scientific HERAEUS Megafuge 8
Compact UV lampUVPUVGL-25
Ethyl AcetateMACRONMA-H078-10
Filter Paper 125mmADVANTEC60311102
ImageJNIHFreewarehttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Lovastatin standardACROSA0404262
MiBio Fluo MICROTEKV1.04
n-HexaneC-ECHOHH3102-000000-72EC
OriginProOriginLab9.1https://www.originlab.com/origin
Potato dextrose broth HSTBIO MEDIA110533
Rotary evaporatorEYELASB-1000
Sulfuric acidFluka30743-2.5L-GL
TLC silica gel 60 F254MERCK1.05554.0001
Trifluoroacetic acidAlfa Aesar10229873
Ultrasonic vibration machineDELTADC600

References

  1. Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078 (2014).
  2. Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
  3. Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
  4. Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
  5. Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
  6. Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
  7. Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
  8. Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
  9. Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
  10. El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
  11. Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
  12. Musharraf, S. G., Ul Arfeen, ., Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

188

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved