Abschätzung der Ausbeute von Compounds auf der TLC-Platte mittels Blue-LED-Beleuchtungstechnik

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll entwickelte eine Methode zur Abschätzung der Ausbeute von Verbindungen auf der TLC-Platte unter Verwendung der Blau-LED-Beleuchtungstechnik. Die Vorteile dieses Ansatzes sind, dass er sicher, effektiv und kostengünstig ist und es dem Forscher ermöglicht, mehrere Proben gleichzeitig zu messen.

Zusammenfassung

Die Dünnschichtchromatographie (TLC) ist eine zugängliche Analysetechnik, die in der organischen Chemie umfassend eingesetzt wurde, um die Ausbeute unbekannter Proben zu quantifizieren. Die vorliegende Studie entwickelte eine effektive, kostengünstige und sichere Methode, um die Ausbeute von Proben auf einer TLC-Platte mit dem blauen LED-Illuminator abzuschätzen. Lovastatin, extrahiert aus Aspergillus terreus , war die Beispielverbindung, die in der vorliegenden Studie verwendet wurde. Zur Bewertung der Ausbeute von Lovastatin wurden Regressionsmodelle verwendet, die auf dem Lovastatin-Standard basieren. Drei Methoden wurden verglichen: Bioassay, UV-Detektion und Blue-LED-Beleuchtung. Das Ergebnis zeigte, dass die Blue-LED-Beleuchtungsmethode deutlich zeiteffektiver ist als UV-Detektions- und Bioassay-Methoden. Darüber hinaus war die Blau-LED-Beleuchtung eine relativ sichere Option, da biologische Gefahren bei der Bioassay-Methode (z. B. mikrobielle Infektion) und UV-Exposition bei der UV-Detektionsmethode besorgt waren. Im Vergleich zu den teuren Methoden, die spezielle Instrumente und langes Training erfordern, bevor sie unabhängig arbeiten können, wie GC, HPLC und HPTLC, war die Verwendung des Blue-LED-Illuminators eine wirtschaftliche Option, um die Ausbeute von Proben von einer TLC-Platte abzuschätzen.

Einleitung

Die Dünnschichtchromatographie (TLC) ist als qualitative und quantitative Technik auf dem Gebiet der organischen Chemie weit verbreitet ^1,2,3. Die Hauptvorteile von TLC sind, dass es eine schnelle Erkennung und flexible Probenanforderungen bietet und keine spezielle Ausrüstung erfordert⁴. Obwohl viele fortschrittliche Ansätze etabliert wurden, ist TLC bis heute die Hauptmethode zur Identifizierung unbekannter Proben in einem Gemisch. Die Herausforderung dieses Ansatzes ist jedoch der Mangel an sicheren und kostengünstigen Geräten zur Quantifizierung der Probenausbeute, insbesondere für Entwicklungslaboratorien mit begrenzten Budgets. Die vorliegende Studie zielte daher darauf ab, eine effiziente, sichere und kostengünstige Methode in Kombination mit TLC zu entwickeln, um die Ausbeute der Proben abzuschätzen.

Im Gegensatz zu Hochleistungs-TLC (HPTLC), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Gaschromatographie (GC) mit strengen Probenanforderungen, zeitaufwändig und Mehrschritt-Beteiligung für die Probenvorbereitung ^1,5 zeigte TLC mehrere Vorteile. Erstens können HPLC und GC für die Probenvorbereitung den Rohextrakt nicht nachweisen, da der Rohextrakt die Säule von HPLC und GC verstopfen kann. Zweitens, wenn die Proben nicht UV-geeignet sind (wichtig für die HPLC-Analyse) oder mit geringer Flüchtigkeit (wichtig für die GC-Analyse), kann TLC auf diese Proben angewendet werden, und die Verwendung von Visualisierungsreagenz macht die isolierten Proben auf dünnen Schichten^{sichtbar 6,7,8}. Drittens erfordern HPLC und GC für allgemeine Anwender im Vergleich zu TLC im Allgemeinen ein relativ langes Vortraining, bevor sie unabhängig arbeiten können. Darüber hinaus kann die quantitative TLC-Analyse, bekannt als Hochleistungs-TLC (HPTLC), die Informationen auf einer TLC-Platte mit einem hochempfindlichen Scanner digitalisieren. Die Kosten für das HPTLC-System sind jedoch relativ teuer. Daher ist die Entwicklung eines kostengünstigen und schnellen Ansatzes zur Quantifizierung von Proben auf der TLC-Platte ein wichtiges Thema.

Ähnliche Methoden wurden für die TLC-Ertragsquantifizierung entwickelt; Zum Beispiel berichtete Johnson⁹ über eine Technik, die die Quantifizierung der Proben auf einer TLC-Platte ermöglicht, indem ein Flachbettscanner verwendet wird, der an einen Computer angeschlossen ist. Im Jahr 2001 entwickelten El-Gindy et al.10 die TLC-densitometrische Methode, mit der die Verbindung mit optischer Dichte nachgewiesen wurde, und die Technik wurde auch von Elkady et ^al.11 angewendet. Im Jahr 2007 präsentierte Hess² die digital enhanced-TLC (DE-TLC) Methode, die angewendet wird, um die Ausbeute einer Verbindung auf einer TLC-Platte mit einer Digitalkamera in Kombination mit UV-Licht zu detektieren. Hess verglich auch die Kostenunterschiede zwischen HPTLC- und DE-TLC-Methode und kam zu dem Schluss, dass die DE-TLC-Methode aufgrund ihrer erschwinglichen Kosten in High-School- und College-Labors verwendet werden könnte². Die Kosten für die TLC-densitometrische Methode waren jedoch immer noch teuer, und der Betrieb von ultraviolettem Licht erfordert eine angemessene Vorschulung, falls die Benutzer ultravioletter Strahlung ausgesetzt werden könnten. Daher ist es wünschenswert, in Übereinstimmung mit TLC eine effiziente, sichere und kostengünstige Methode zur Quantifizierung der Probenausbeute zu entwickeln.

Die vorliegende Studie beschrieb ein Protokoll zur Detektion der Probe auf einer TLC-Platte unter Verwendung des blauen LED-Illuminators und entwickelte ein Regressionsmodell mit hoher Zuverlässigkeit (hoher R-Quadrat-Wert), um die Abmessungen der Bänder zu messen und dann die Wirkstoffausbeute zu bestimmen. Schließlich wurde festgestellt, dass die Blau-LED-Beleuchtungsmethode eine relativ sichere (vs. UV-Detektionsmethode), billig (vs. GC, HPLC und HPTLC) und effektiver (vs. Bioassay-Methode) Ansatz zur Ertragsquantifizierung.

Protokoll

Das vorliegende Protokoll wird am Beispiel von Lovastatin beschrieben. Lovastatin wurde aus dem eine Woche alten Aspergillus terreus extrahiert.

1. Extraktion von Verbindungen

HINWEIS: Einzelheiten zur Extraktion von Verbindungen finden Sie in Abbildung 1.

1. Kultur Aspergillus terreus auf dem Medium Kartoffeldextrose (PDA, siehe Materialtabelle) bei 30 °C.
2. Die Kultur wird 24 h bei 40 °C getrocknet. Die getrocknete Kultur wird mit einer sterilisierten Pinzette in ein 50-ml-Röhrchen überführt und 15 mL Ethylacetat hinzugefügt.
3. Die Mischung 1 min lang kräftig durch Wirbeln schütteln und 1 h bei 40 °C mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
4. Das Gemisch mit einem 40 kHz Ultraschallbad (siehe Materialtabelle) bei 40 °C für 1 h beschallen.
5. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 5.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur und filtrieren Sie durch ein 11 μm Filterpapier.
6. Extrahieren Sie das Filtrat mit einer gleichen Menge sterilen Wassers in einem Scheidetrichter.
7. Nach der Phasentrennung die organische Schicht sammeln und dann in einem Rotationsverdampfer verdampfen (siehe Materialtabelle). Der Rückstand wird in 2 mL Ethylacetat gelöst.

2. Trennung des Rohextrakts durch Normalphasenadsorptionssäule (NP)

1. Packen Sie die Säule mit NP-Kieselgel als stationäre Phase und verwenden Sie n-Hexan:Ethylacetat:Trifluoressigsäure (H:E:T; 80:20:0,1, v/v/v) als mobile Phase.
2. Laden Sie 2 mL des Extrakts (Schritt 1) auf die Säule und fügen Sie das Lösungsmittel der mobilen Phase mit einer Flussrate von 1 ml / min hinzu, um den Extrakt zu eluieren.
   HINWEIS: Der Durchfluss wurde manuell mit einem Absperrhahn gesteuert.
3. Überprüfen Sie das Abwasser durch TLC, um das Vorhandensein von Lovastatin zu bestätigen, und verdampfen Sie dann in einem Rotationsverdampfer bei 45 °C, bis das Lösungsmittel entfernt ist. Dieser Schritt dauert ca. 20-25 min.
4. Der Rückstand wird in 1 ml Ethylacetat gelöst und dann mit einem gleichen Volumen von 1% Trifluoressigsäure gemischt.
5. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 5.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur und sammeln Sie die organische Schicht in einem neuen Glasröhrchen.

3. Herstellung und Beladung von Dünnschichtchromatogrammplatten (TLC)

1. 5 μL Proben und Lovastatin-Standards (siehe Materialtabelle) mit einer Kapillarpipette auf die Grundlinie der TLC-Platte setzen, wobei an den Seiten der TLC-Platte ein Rand von 1 cm verbleibt.
2. Trocknen Sie die TLC-Platte in einem Abzug für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Legen Sie die Platte vorsichtig mit einer Pinzette in eine gesättigte Glaskammer, die das Lösungsmittel der mobilen Phase enthält. Decken Sie die Kammer mit einem Glasdeckel ab und lassen Sie die Platte vollständig entfalten.
4. Entfernen Sie die Platte aus der Kammer, wenn die Lösungsmittellinie 1 cm von der Oberseite der Platte entfernt ist.

4. Analyse durch die blaue LED-Beleuchtung

1. Markieren Sie die Lösungsmittellinie mit einem Bleistift. Trocknen Sie die Platte im Abzug für 10 min bei Raumtemperatur.
2. Nach dem Trocknen die Platte sofort in 10%_H2SO4 Lösungsmittel einweichen und anschließend 10 min bei Raumtemperatur im Abzug trocknen.
3. Legen Sie die Platte auf die Heizplatte, bis die braunen Flecken erscheinen. Stellen Sie sicher, dass die Platte nicht überhitzt ist, da dies die Visualisierung von Lovastatin erschweren könnte.
4. Übertragen Sie die Platte auf die blaue LED-Beleuchtung und scannen Sie mit einer kompatiblen Freeware (MiBio Fluo) (siehe Materialtabelle).

5. Ertragsschätzung durch das Regressionsmodell

1. Messen Sie die Abmessungen von Bändern mit der ImageJ-Software (siehe Materialtabelle).
2. Erstellen Sie ein Regressionsmodell mit Datenanalyse- und Grafiksoftware (siehe Materialtabelle), das auf den absteigenden Konzentrationen der Lovastatin-Standards basiert, einschließlich 1 mg / ml, 0,75 mg / ml, 0,5 mg / ml und 0,25 mg / ml.
3. Wenden Sie das Regressionsmodell an, um die Ausbeute der Stichproben zu schätzen.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde die Blue-LED-Beleuchtungsmethode zur Abschätzung der Ausbeute von Verbindungen vorgestellt, und diese Methode wurde validiert und mit Bioassay- und UV-detektierten Methoden verglichen (Tabelle 1). Die Regressionsmodelle wurden basierend auf den Dimensionen der Banden und der Konzentration von Standards für jeweils drei Methoden entwickelt, um die Ausbeute von Proben vorherzusagen. Erstens betrug in den Ergebnissen der Bioassay-Methode das R-Quadrat zwischen den Dimensionen der He...

Diskussion

Die vorliegende Studie beschrieb einen neuen Ansatz, den Blue-LED-Illuminator, zur Quantifizierung von Verbindungen ohne Verwendung teurer und spezialisierter Geräte wie HPTLC-, HPLC- und GC-Methode, und die Methode wurde mit den Bioassay- und UV-detektierten Methoden verglichen, um die Quantifizierungsleistung zu bewerten. Als Ergebnis wurde der Schluss gezogen, dass die Blue-LED-Beleuchtungsmethode ein relativ sicheres und effektives Protokoll ist, das verwendet wird, um die Ausbeute von Zielverbindungen auf der TLC-P...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
American bacteriological Agar	Condalab	1802.00
Aspergillus terreus		ATCC 20542
Blue-LED illuminator	MICROTEK	Bio-1000F
Centrifuge	Thermo Scientific	HERAEUS Megafuge 8
Compact UV lamp	UVP	UVGL-25
Ethyl Acetate	MACRON	MA-H078-10
Filter Paper 125mm	ADVANTEC	60311102
ImageJ	NIH	Freeware	https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Lovastatin standard	ACROS	A0404262
MiBio Fluo	MICROTEK	V1.04
n-Hexane	C-ECHO	HH3102-000000-72EC
OriginPro	OriginLab	9.1	https://www.originlab.com/origin
Potato dextrose broth H	STBIO MEDIA	110533
Rotary evaporator	EYELA	SB-1000
Sulfuric acid	Fluka	30743-2.5L-GL
TLC silica gel 60 F254	MERCK	1.05554.0001
Trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	10229873
Ultrasonic vibration machine	DELTA	DC600