Оценка выхода соединений на пластине TLC с помощью метода сине-светодиодного освещения

Резюме

В настоящем протоколе разработан метод оценки выхода соединений на пластине TLC с использованием метода сине-светодиодного освещения. Преимущества такого подхода заключаются в том, что он безопасен, эффективен, недорог и позволяет исследователю измерять несколько образцов одновременно.

Аннотация

Тонкослойная хроматография (TLC) является доступным аналитическим методом, который широко используется в исследованиях органической химии для количественной оценки выхода неизвестных образцов. В настоящем исследовании был разработан эффективный, дешевый и безопасный метод оценки выхода образцов на пластине TLC с использованием синего светодиодного осветителя. Ловастатин, извлеченный из Aspergillus terreus , был примером соединения, используемого в настоящем исследовании. Регрессионные модели, основанные на стандарте ловастатина, были использованы для оценки выхода ловастатина. Сравнивались три метода: биоанализ, УФ-детектирование и сине-светодиодное освещение. Результат показал, что метод сине-светодиодного освещения значительно более эффективен по времени, чем методы обнаружения ультрафиолета и биоанализа. Кроме того, синее светодиодное освещение было относительно безопасным вариантом из-за обеспокоенности биологическими опасностями в методе биоанализа (например, микробная инфекция) и ультрафиолетовым воздействием в методе обнаружения ультрафиолета. По сравнению с дорогостоящими методами, требующими специализированных приборов и длительного обучения перед самостоятельной работой, такими как GC, HPLC и HPTLC, использование синего светодиодного осветителя было экономичным вариантом для оценки выхода образцов из пластины TLC.

Введение

Тонкослойная хроматография (ТЛК) широко используется как качественная и количественная методика в области органической химии ^1,2,3. Основными преимуществами TLC являются то, что он обеспечивает быстрое обнаружение, гибкие требования к образцам и не требует специализированного оборудования⁴. На сегодняшний день, несмотря на то, что было установлено много передовых подходов, TLC по-прежнему является основным методом идентификации неизвестных образцов в смеси. Однако проблема этого подхода заключается в отсутствии безопасного и недорогого оборудования для количественной оценки выхода проб, особенно для развивающихся лабораторий с ограниченными бюджетами. Таким образом, настоящее исследование было направлено на разработку эффективного, безопасного и недорогого метода в сочетании с TLC для оценки выхода образцов.

В отличие от высокоэффективного TLC (HPTLC), высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и газовой хроматографии (GC) со строгими требованиями к образцам, трудоемкими и участием многоступенчатой для пробоподготовки ^1,5, TLC показал ряд преимуществ. Во-первых, для пробоподготовки ВЭЖХ и ГК не могут обнаружить сырой экстракт, поскольку сырой экстракт может заткнуть колонну ВЭЖХ и ГХ. Во-вторых, когда образцы не подходят для УФ-излучения (важно для анализа ВЭЖХ) или с низкой летучестью (важно для анализа ГК), К этим образцам может быть применен TLC, а использование реагента визуализации делает изолированные образцы видимыми на тонких слоях ^6,7,8. В-третьих, для обычных пользователей ВЭЖХ и ГК, как правило, требуют относительно длительного времени предварительной подготовки перед самостоятельной работой по сравнению с TLC. Кроме того, количественный анализ TLC, известный как высокопроизводительный TLC (HPTLC), может оцифровать информацию на пластине TLC с помощью высокочувствительного сканера. Однако стоимость системы ВЭЖХ относительно дорогая. Таким образом, разработка экономически эффективного и быстрого подхода к количественной оценке образцов на пластине TLC является важной темой.

Аналогичные методы были разработаны для количественной оценки урожайности TLC; Например, Джонсон⁹ сообщил о методе, который позволяет количественно оценить образцы на пластине TLC с помощью планшетного сканера, подключенного к компьютеру. В 2001 году El-Gindy et ^al.10 разработали TLC-денситометрический метод, который использовался для обнаружения соединения с оптической плотностью, и этот метод также был применен Elkady et ^al.11. В 2007 году Hess² представил метод цифрового усовершенствования TLC (DE-TLC), применяемый для обнаружения выхода соединения на пластине TLC с использованием цифровой камеры в сочетании с ультрафиолетовым светом. Гесс также сравнил разницу в стоимости между методом HPTLC и DE-TLC и пришел к выводу, что метод DE-TLC может использоваться в лабораториях средней школы и колледжа из-за его доступной стоимости². Тем не менее, стоимость TLC-денситометрического метода все еще была дорогой, и работа ультрафиолетового света требует адекватной предварительной подготовки на случай, если пользователи могут подвергнуться воздействию ультрафиолетового излучения. Поэтому, совместимый с TLC, желательно разработать эффективный, безопасный и недорогой метод количественной оценки выхода образца.

В настоящем исследовании описан протокол обнаружения образца на пластине TLC с использованием синего светодиодного осветителя и разработана регрессионная модель с высокой надежностью (высоким значением R-квадрата) для измерения размеров полос, а затем определения выхода соединения. Наконец, было установлено, что метод сине-светодиодного освещения является относительно безопасным (vs. Метод УФ-детектирования), дешевый (vs. GC, ВЭЖХ и ВЭЖХ) и эффективный (по сравнению с методом биоанализа) подход к количественной оценке урожайности.

протокол

Настоящий протокол описан на примере ловастатина. Ловастатин был извлечен из недельного Aspergillus terreus.

1. Экстракция соединений

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации об извлечении соединений см. Рисунок 1.

1. Культура Aspergillus terreus на картофельный агар декстрозы (КПК, см. Таблицу материалов) в среде при 30 °C.
2. Высушите культуру при 40 °C в течение 24 ч. Переложите высушенную культуру в 50 мл пробирку с помощью стерилизованного пинцета и добавьте 15 мл этилацетата.
3. Смесь энергично встряхнуть вихрем в течение 1 мин и инкубировать в течение 1 ч при 40 °С с встряхиванием при 200 об/мин.
4. Обжайте смесь ультразвуком с помощью ультразвуковой ванны 40 кГц (см. Таблицу материалов) при 40 °C в течение 1 ч.
5. Центрифугируйте смесь при 5000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре и фильтруйте через фильтровальную бумагу 11 мкм.
6. Экстрагировать фильтрат равным объемом стерильной воды в сепараторную воронку.
7. После разделения фаз собирают органический слой, а затем испаряют во вращающемся испарителе (см. Таблицу материалов). Растворить остаток в 2 мл этилацетата.

2. Разделение сырого экстракта по адсорбционной колонне нормальной фазы (NP)

1. Упакуйте колонку силикагелем NP в качестве стационарной фазы и используйте n-гексан:этилацетат:трифторуксусную кислоту (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) в качестве подвижной фазы.
2. Загрузите 2 мл экстракта (стадия 1) на колонну и добавьте растворитель подвижной фазы со скоростью потока 1 мл/мин для элюляции экстракта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока управлялась вручную с помощью запорного крана.
3. Проверьте сточные воды с помощью TLC, чтобы подтвердить наличие ловастатина, а затем испарите во вращающемся испарителе при 45 °C до тех пор, пока растворитель не будет удален. Этот шаг занимает примерно 20-25 минут.
4. Растворяют остаток в 1 мл этилацетата, а затем смешивают с равным объемом 1% трифторуксусной кислоты.
5. Центрифугируйте смесь при 5000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре и соберите органический слой в новую стеклянную трубку.

3. Подготовка и загрузка пластин тонкослойной хроматограммы (TLC)

1. Нанесите 5 мкл образцов и эталонов ловастатина (см. Таблицу материалов) на базовую линию пластины TLC с помощью капиллярной пипетки, оставив границу 1 см по бокам пластины TLC.
2. Высушите пластину TLC в вытяжном шкафу в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Аккуратно поместите пластину щипцами в насыщенную стеклянную камеру, содержащую растворитель подвижной фазы. Накройте камеру стеклянной крышкой и дайте пластине полностью развиться.
4. Снимите пластину из камеры, когда линия растворителя достигнет 1 см от верхней части пластины.

4. Анализ с помощью сине-светодиодного осветителя

1. Пометьте линию растворителя карандашом. Высушите пластину в вытяжке в течение 10 мин при комнатной температуре.
2. После высыхания сразу же замочите пластину в 10% растворителе_H2SO₄ , а затем высушите в вытяжке в течение 10 мин при комнатной температуре.
3. Поместите пластину на нагревательную панель до появления коричневых пятен. Убедитесь, что пластина не перегревается, так как это может затруднить визуализацию ловастатина.
4. Перенесите пластину на сине-светодиодный осветитель и отсканируйте с помощью совместимого бесплатного программного обеспечения (MiBio Fluo) (см. Таблицу материалов).

5. Оценка доходности по регрессионной модели

1. Измерьте размеры полос с помощью программного обеспечения ImageJ (см. Таблицу материалов).
2. Создание регрессионной модели с использованием программного обеспечения для анализа данных и построения графиков (см. Таблицу материалов) на основе нисходящих концентраций стандартов ловастатина, включая 1 мг/мл, 0,75 мг/мл, 0,5 мг/мл и 0,25 мг/мл.
3. Примените регрессионную модель для оценки выхода образцов.

Результаты

В этом исследовании был представлен метод сине-светодиодного освещения для оценки выхода соединений, и этот метод был валидирован и сопоставлен с методами биоанализа и УФ-детектирования (таблица 1). Регрессионные модели были разработаны на основе размеров полос и концентраци?...

Обсуждение

В настоящем исследовании описан новый подход, синий светодиодный осветитель, для количественной оценки соединений без использования дорогостоящего и специализированного оборудования, такого как метод ВЭЖХ, ВЭЖХ и ГК, и этот метод сравнивали с методами биоанализа и УФ-детектирования ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
American bacteriological Agar	Condalab	1802.00
Aspergillus terreus		ATCC 20542
Blue-LED illuminator	MICROTEK	Bio-1000F
Centrifuge	Thermo Scientific	HERAEUS Megafuge 8
Compact UV lamp	UVP	UVGL-25
Ethyl Acetate	MACRON	MA-H078-10
Filter Paper 125mm	ADVANTEC	60311102
ImageJ	NIH	Freeware	https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Lovastatin standard	ACROS	A0404262
MiBio Fluo	MICROTEK	V1.04
n-Hexane	C-ECHO	HH3102-000000-72EC
OriginPro	OriginLab	9.1	https://www.originlab.com/origin
Potato dextrose broth H	STBIO MEDIA	110533
Rotary evaporator	EYELA	SB-1000
Sulfuric acid	Fluka	30743-2.5L-GL
TLC silica gel 60 F254	MERCK	1.05554.0001
Trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	10229873
Ultrasonic vibration machine	DELTA	DC600