通过蓝光LED照明技术 估算 TLC板上化合物的产量

摘要

本协议开发了一种使用蓝光LED照明技术估计TLC板上化合物产量的方法。这种方法的优点是安全、有效、便宜，并允许研究人员同时测量多个样品。

摘要

薄层色谱（TLC）是一种可访问的分析技术，已广泛用于有机化学研究，以量化未知样品的产量。本研究开发了一种有效、廉价且安全的方法来使用蓝光LED照明器估计TLC板上样品的产量。从 土曲霉 中提取的洛伐他汀是本研究中使用的示例化合物。基于洛伐他汀标准的回归模型用于评估洛伐他汀的产量。比较了三种方法:生物测定，紫外线检测和蓝光LED照明。结果表明，蓝光LED照明方法比紫外检测和生物测定方法具有显著的时效性。此外，由于生物测定方法中的生物危害（例如微生物感染）和紫外线检测方法中的紫外线暴露，蓝光LED照明是一种相对安全的选择。与在独立工作之前需要专业仪器和长期培训的昂贵方法（如GC、HPLC和HPTLC）相比，使用蓝光LED照明器是估算TLC板样品产量的经济选择。

引言

薄层色谱（TLC）被广泛用作有机化学领域的定性和定量技术¹，^2，3。TLC的主要优点是检测速度快，样品要求灵活，不需要专用设备⁴.迄今为止，尽管已经建立了许多先进的方法，但TLC仍然是识别混合物中未知样品的主要方法。然而，这种方法的挑战是缺乏安全且廉价的设备来量化样品产量，特别是对于开发预算有限的实验室。因此，本研究旨在开发一种高效、安全且廉价的方法，结合TLC来估计样品的产量。

与高效TLC（HPTLC）、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）不同，TLC具有严格的样品要求，耗时长，并且涉及样品制备^的多步骤1，^5，TLC表现出几个优点。首先，对于样品制备，HPLC和GC无法检测到粗提取物，因为粗提取物可能会堵塞HPLC和GC的色谱柱。其次，当样品不适合紫外线（对HPLC分析很重要）或挥发性低（对GC分析很重要）时，可以将TLC应用于这些样品，并且使用可视化试剂使分离的样品在薄层⁶，^7，8上可见。第三，对于一般用户来说，与TLC相比，HPLC和GC在独立工作之前通常需要相对较长的预训练时间。此外，定量TLC分析，称为高性能TLC（HPTLC），可以使用高灵敏度扫描仪将TLC板上的信息数字化。然而，HPTLC系统的成本相对昂贵。因此，开发一种经济高效且快速的方法来定量TLC板上的样品是一个重要的主题。

已经开发了类似的TLC产量定量方法;例如，Johnson⁹ 报告了一种技术，该技术允许使用连接到计算机的平板扫描仪对TLC板上的样品进行定量。2001年，El-Gindy等人¹⁰ 开发了TLC-密度测定法，该方法用于检测具有光密度的化合物，该技术也被Elkady等人¹¹应用。2007年，Hess² 提出了数字增强TLC（DE-TLC）方法，该方法用于使用结合紫外光的数码相机检测TLC板上化合物的产量。Hess还比较了HPTLC和DE-TLC方法之间的成本差异，并得出结论，DE-TLC方法^{由于其可承受}的成本2而可用于高中和大学实验室。然而，TLC密度法的成本仍然昂贵，并且紫外线的操作需要足够的预培训，以防用户可能暴露于紫外线辐射。因此，与TLC兼容，开发一种高效，安全且廉价的方法来定量样品产量是可取的。

本研究描述了一种使用蓝光LED照明器检测TLC板上样品的协议，并开发了一种具有高可靠性（高R平方值）的回归模型来测量条带的尺寸，然后确定化合物产量。最后，发现蓝光LED照明方法相对安全（与紫外线检测方法），便宜（与GC、HPLC 和 HPTLC）以及用于产量定量的有效（与生物测定方法相比）。

研究方案

使用洛伐他汀作为示例描述本协议。洛伐他汀是从一周大的 土曲霉中提取的。

1. 化合物萃取

注:有关化合物提取的详细信息，请参见 图1。

1. 在30°C的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，见材料表）培养基上培养土曲霉。
2. 将培养物在40°C干燥24小时。使用灭菌的镊子将干燥的培养物转移到50 mL管中，并加入15 mL乙酸乙酯。
3. 通过涡旋1分钟剧烈摇动混合物，并在40°C下以200rpm振荡孵育1小时。
4. 使用40kHz超声波浴（见 材料表）在40°C下超声处理混合物1小时。
5. 在室温下以5，000× g 离心混合物1分钟，并通过11μm滤纸过滤。
6. 在分离漏斗中用等体积的无菌水提取滤液。
7. 相分离后，收集有机层，然后在旋转蒸发器中蒸发（见 材料表）。将残留物溶解在 2 mL 乙酸乙酯中。

2. 通过正相（NP）吸附柱分离粗提物

1. 以NP硅胶为固定相填料柱，以正己烷:乙酸乙酯:三氟乙酸（H:E:T;80:20:0.1，v/v/v）为流动相。
2. 将2 mL提取物（步骤1）上样到色谱柱上，并以1 mL/min的流速加入流动相溶剂以洗脱提取物。
   注意:流量是使用旋塞阀手动控制的。
3. 通过TLC验证流出物以确认洛伐他汀的存在，然后在45°C的旋转蒸发器中蒸发，直到溶剂被除去。此步骤大约需要 20-25 分钟。
4. 将残留物溶解在1mL乙酸乙酯中，然后与等体积的1%三氟乙酸混合。
5. 在室温下以5，000× g 离心混合物1分钟，并将有机层收集在新玻璃管中。

3. 薄层色谱（TLC）板的制备和上样

1. 使用毛细管移液管将5μL样品和洛伐他汀标准品（参见 材料表）点到TLC板的基线上，在TLC板的侧面留下1cm的边界。
2. 在室温下将TLC板在通风橱中干燥5分钟。
3. 用镊子将板轻轻放入含有流动相溶剂的饱和玻璃室中。用玻璃盖盖住腔室，让板充分展开。
4. 当溶剂管线距离板顶部 1 厘米时，将板从腔室中取出。

4. 蓝光LED照明器分析

1. 用铅笔标记溶剂线。在室温下将板在通风橱中干燥10分钟。
2. 干燥后，立即将板浸泡在10%H₂SO₄ 溶剂中，然后在室温下在通风橱中干燥10分钟。
3. 将板放在加热板上，直到出现棕色斑点。确保板没有过热，因为这可能会使洛伐他汀的可视化变得困难。
4. 将印版转移到蓝色LED照明器，并使用兼容的免费软件（MiBio Fluo）进行扫描（参见 材料表）。

5. 通过回归模型估算产量

1. 使用 ImageJ 软件测量条带的尺寸（参见 材料表）。
2. 使用数据分析和绘图软件（参见 材料表）建立回归模型，基于洛伐他汀标准品的降序浓度，包括1 mg/mL、0.75 mg/mL、0.5 mg/mL和0.25 mg/mL。
3. 应用回归模型来估计样本的产量。

结果

本研究介绍了用于估计化合物产量的蓝光LED照明方法，该方法得到了验证，并与生物测定和紫外线检测方法进行了比较（表1）。基于3种方法的条带维数和标准品浓度分别建立了回归模型，以预测样品的产量。首先，在生物测定方法的结果中，抑制区尺寸与洛伐他汀标准品尺寸之间的R平方为0.99，回归模型预测的样品产率为0.56mg（图2）。其次，在UV检测方法中，?...

讨论

本研究描述了一种新的方法，即蓝光LED照明器，无需使用昂贵和专门的设备（如HPTLC，HPLC和GC方法）即可定量化合物，并将该方法与生物测定和紫外检测方法进行比较以评估定量性能。因此，得出的结论是，蓝光LED照明方法是一种相对安全有效的方案，用于量化TLC板上目标化合物的产率。

以前的研究已经报道了几种不使用专用定量设备的定量方法，并且所有研究表明定量的准...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
American bacteriological Agar	Condalab	1802.00
Aspergillus terreus		ATCC 20542
Blue-LED illuminator	MICROTEK	Bio-1000F
Centrifuge	Thermo Scientific	HERAEUS Megafuge 8
Compact UV lamp	UVP	UVGL-25
Ethyl Acetate	MACRON	MA-H078-10
Filter Paper 125mm	ADVANTEC	60311102
ImageJ	NIH	Freeware	https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Lovastatin standard	ACROS	A0404262
MiBio Fluo	MICROTEK	V1.04
n-Hexane	C-ECHO	HH3102-000000-72EC
OriginPro	OriginLab	9.1	https://www.originlab.com/origin
Potato dextrose broth H	STBIO MEDIA	110533
Rotary evaporator	EYELA	SB-1000
Sulfuric acid	Fluka	30743-2.5L-GL
TLC silica gel 60 F254	MERCK	1.05554.0001
Trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	10229873
Ultrasonic vibration machine	DELTA	DC600