Estimación del rendimiento de compuestos en la placa TLC mediante la técnica de iluminación Blue-LED

Resumen

El presente protocolo desarrolló un método para estimar el rendimiento de compuestos en la placa TLC utilizando la técnica de iluminación azul-LED. Las ventajas de este enfoque son que es seguro, efectivo, económico y permite al investigador medir múltiples muestras simultáneamente.

Resumen

La cromatografía en capa fina (TLC) es una técnica analítica accesible que se ha utilizado ampliamente en la investigación de química orgánica para cuantificar el rendimiento de muestras desconocidas. El presente estudio desarrolló un método efectivo, barato y seguro para estimar el rendimiento de las muestras en una placa TLC utilizando el iluminador LED azul. La lovastatina extraída de Aspergillus terreus fue el compuesto de ejemplo utilizado en el presente estudio. Se utilizaron modelos de regresión basados en el estándar de lovastatina para evaluar el rendimiento de lovastatina. Se compararon tres métodos: bioensayo, detección UV e iluminación LED azul. El resultado mostró que el método de iluminación LED-azul es significativamente más efectivo en el tiempo que los métodos de detección UV y bioensayo. Además, la iluminación LED azul fue una opción relativamente segura debido a la preocupación por los peligros biológicos en el método de bioensayo (por ejemplo, infección microbiana) y la exposición ultravioleta en el método de detección UV. En comparación con los métodos costosos que requieren instrumentos especializados y capacitación a largo plazo antes de trabajar de forma independiente, como GC, HPLC y HPTLC, el uso del iluminador LED azul fue una opción económica para estimar el rendimiento de las muestras de una placa TLC.

Introducción

La cromatografía en capa fina (TLC) es ampliamente utilizada como técnica cualitativa y cuantitativa en el campo de la química orgánica ^1,2,3. Las principales ventajas de TLC son que proporciona una detección rápida, requisitos de muestra flexibles y no requiere equipos especializados⁴. Hasta la fecha, a pesar de que se han establecido muchos enfoques avanzados, TLC sigue siendo el método principal para identificar muestras desconocidas en una mezcla. Sin embargo, el desafío de este enfoque es la falta de equipos seguros y económicos para cuantificar el rendimiento de la muestra, especialmente para desarrollar laboratorios con presupuestos limitados. El presente estudio, por lo tanto, tuvo como objetivo desarrollar un método eficiente, seguro y económico combinado con TLC para estimar el rendimiento de las muestras.

A diferencia de la TLC de alta resolución (HPTLC), la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la cromatografía de gases (GC) con requisitos estrictos de muestra, tiempo y participación de múltiples pasos para la preparación de muestras^1,5, TLC mostró varias ventajas. Primero, para la preparación de la muestra, la HPLC y el GC no pueden detectar el extracto crudo porque el extracto crudo puede tapar la columna de HPLC y GC. En segundo lugar, cuando las muestras no son aptas para UV (importante para el análisis de HPLC) o con baja volatilidad (importante para el análisis de GC), se puede aplicar TLC a estas muestras, y el uso de reactivo de visualización hace que las muestras aisladas sean visibles en capas delgadas ^6,7,8. En tercer lugar, para los usuarios generales, HPLC y GC generalmente requieren un tiempo relativamente largo de capacitación previa antes de trabajar de forma independiente, en comparación con TLC. Además, el análisis cuantitativo de TLC, conocido como TLC de alto rendimiento (HPTLC), puede digitalizar la información en una placa TLC con un escáner altamente sensible. Sin embargo, el costo del sistema HPTLC es relativamente caro. Como tal, el desarrollo de un enfoque rentable y rápido para cuantificar muestras en la placa TLC es un tema importante.

Se han desarrollado métodos similares para la cuantificación del rendimiento de TLC; por ejemplo, Johnson⁹ informó de una técnica que permite la cuantificación de las muestras en una placa TLC mediante el uso de un escáner plano conectado a una computadora. En 2001, El-Gindy et al.10 desarrollaron el método TLC-densitométrico, que fue utilizado para detectar el compuesto con densidad óptica, y la técnica también fue aplicada por Elkady et ^al.11. En 2007, Hess² presentó el método digitalmente mejorado TLC (DE-TLC) aplicado para detectar el rendimiento de un compuesto en una placa TLC utilizando una cámara digital combinada con luz UV. Hess también comparó las diferencias de costos entre el método HPTLC y el método DE-TLC y concluyó que el método DE-TLC podría usarse en laboratorios de escuelas secundarias y universidades debido a su costo asequible². Sin embargo, el costo del método TLC-densitométrico seguía siendo caro, y la operación de la luz ultravioleta requiere un entrenamiento previo adecuado en caso de que los usuarios puedan exponerse a la radiación ultravioleta. Por lo tanto, compatible con TLC, es deseable desarrollar un método eficiente, seguro y económico para cuantificar el rendimiento de la muestra.

El presente estudio describió un protocolo para detectar la muestra en una placa TLC utilizando el iluminador LED-azul, y desarrolló un modelo de regresión con alta confiabilidad (alto valor R-cuadrado) para medir las dimensiones de las bandas y luego determinar el rendimiento compuesto. Finalmente, se encontró que el método de iluminación azul-LED es relativamente seguro (vs. Método de detección UV), barato (vs. GC, HPLC y HPTLC), y un enfoque efectivo (frente al método de bioensayo) para la cuantificación del rendimiento.

Protocolo

El presente protocolo se describe utilizando lovastatina como ejemplo. La lovastatina se extrajo de Aspergillus terreus de una semana de edad.

1. Extracción de compuestos

NOTA: Para obtener detalles sobre la extracción de compuestos, consulte la Figura 1.

1. Cultivo de Aspergillus terreus en el medio de agar dextrosa de patata (PDA, ver Tabla de materiales) a 30 °C.
2. Secar el cultivo a 40 °C durante 24 h. Transfiera el cultivo seco a un tubo de 50 ml con pinzas esterilizadas y agregue 15 ml de acetato de etilo.
3. Agitar vigorosamente la mezcla haciendo vórtice durante 1 min e incubar durante 1 h a 40 °C agitando a 200 rpm.
4. Sonicar la mezcla con un baño ultrasónico de 40 kHz (ver Tabla de materiales) a 40 °C durante 1 h.
5. Centrifugar la mezcla a 5.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y filtrar a través de un papel de filtro de 11 μm.
6. Extraiga el filtrado con un volumen igual de agua estéril en un embudo separador.
7. Después de la separación de fases, recoja la capa orgánica y luego evapore en un evaporador rotativo (consulte la Tabla de materiales). Disolver el residuo en 2 mL de acetato de etilo.

2. Separación del extracto crudo por columna de adsorción en fase normal (NP)

1. Empaque la columna con gel de sílice NP como fase estacionaria y use n-hexano: acetato de etilo: ácido trifluoroacético (H: E: T; 80: 20: 0.1, v / v / v) como fase móvil.
2. Cargue 2 ml del extracto (paso 1) en la columna y agregue el disolvente de fase móvil a un caudal de 1 ml / min para eluyir el extracto.
   NOTA: El caudal se controló manualmente mediante una llave de paso.
3. Verifique el efluente mediante TLC para confirmar la presencia de lovastatina y luego evapore en un evaporador rotativo a 45 °C hasta que se elimine el disolvente. Este paso dura aproximadamente 20-25 min.
4. Disuelva el residuo en 1 ml de acetato de etilo y luego mezcle con un volumen igual de ácido trifluoroacético al 1%.
5. Centrifugar la mezcla a 5.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y recoger la capa orgánica en un nuevo tubo de vidrio.

3. Preparación y carga de placas de cromatograma en capa fina (TLC)

1. Coloque 5 μL de muestras y patrones de lovastatina (ver Tabla de materiales) en la línea de base de la placa TLC usando una pipeta capilar, dejando un borde de 1 cm en los lados de la placa TLC.
2. Seque la placa TLC en una campana extractora durante 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Coloque la placa suavemente con pinzas en una cámara de vidrio saturado que contenga el disolvente de fase móvil. Cubra la cámara con una tapa de vidrio y permita que la placa se desarrolle completamente.
4. Retire la placa de la cámara cuando la línea de disolvente alcance 1 cm de la parte superior de la placa.

4. Análisis por el iluminador LED-azul

1. Marque la línea del disolvente con un lápiz. Seque la placa en la campana extractora durante 10 minutos a temperatura ambiente.
2. Después del secado, remoje inmediatamente la placa en un disolvente de_H2SO4 al 10% y luego seque en la campana extractora durante 10 minutos a temperatura ambiente.
3. Coloque la placa en el panel calefactor hasta que aparezcan las manchas marrones. Asegúrese de que la placa no esté sobrecalentada, ya que esto podría dificultar la visualización de lovastatina.
4. Transfiera la placa al iluminador LED azul y escanee utilizando un software gratuito compatible (MiBio Fluo) (consulte la Tabla de materiales).

5. Estimación del rendimiento por el modelo de regresión

1. Mida la dimensión de las bandas utilizando el software ImageJ (consulte Tabla de materiales).
2. Establecer un modelo de regresión utilizando software de análisis de datos y gráficos (consulte la Tabla de materiales) basado en las concentraciones descendentes de los estándares de lovastatina, incluidos 1 mg / ml, 0.75 mg / ml, 0.5 mg / ml y 0.25 mg / ml.
3. Aplicar el modelo de regresión para estimar el rendimiento de las muestras.

Resultados

Este estudio presentó el método de iluminación azul-LED para estimar el rendimiento de los compuestos, y este método fue validado y comparado con los métodos de bioensayo y detección UV (Tabla 1). Los modelos de regresión se desarrollaron en base a las dimensiones de las bandas y la concentración de patrones para tres métodos, respectivamente, para predecir el rendimiento de las muestras. En primer lugar, en los resultados del método de bioensayo, el R-cuadrado entre las dimensiones de la zona ...

Discusión

El presente estudio describió un nuevo enfoque, el iluminador azul-LED, para cuantificar compuestos sin utilizar equipos costosos y especializados, como HPTLC, HPLC y GC, y el método se comparó con los métodos de bioensayo y UV detectados para evaluar el rendimiento de cuantificación. Como resultado, se concluyó que el método de iluminación blue-LED es un protocolo relativamente seguro y efectivo utilizado para cuantificar el rendimiento de compuestos específicos en la placa TLC.

Estu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
American bacteriological Agar	Condalab	1802.00
Aspergillus terreus		ATCC 20542
Blue-LED illuminator	MICROTEK	Bio-1000F
Centrifuge	Thermo Scientific	HERAEUS Megafuge 8
Compact UV lamp	UVP	UVGL-25
Ethyl Acetate	MACRON	MA-H078-10
Filter Paper 125mm	ADVANTEC	60311102
ImageJ	NIH	Freeware	https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Lovastatin standard	ACROS	A0404262
MiBio Fluo	MICROTEK	V1.04
n-Hexane	C-ECHO	HH3102-000000-72EC
OriginPro	OriginLab	9.1	https://www.originlab.com/origin
Potato dextrose broth H	STBIO MEDIA	110533
Rotary evaporator	EYELA	SB-1000
Sulfuric acid	Fluka	30743-2.5L-GL
TLC silica gel 60 F254	MERCK	1.05554.0001
Trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	10229873
Ultrasonic vibration machine	DELTA	DC600