JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم تطوير جسيم نانوي من الببتيد والبولوكسامين ذاتي التجميع (PP-sNp) باستخدام جهاز خلط ميكروفلويديك لتغليف وتسليم الحمض النووي الريبي المرسال المنسوخ في المختبر . يمكن ل mRNA / PP-sNp الموصوف نقل الخلايا المستزرعة بكفاءة في المختبر.

Abstract

أظهرت لقاحات الحمض النووي الريبي المرسال المنسوخة في المختبر إمكانات هائلة في مكافحة جائحة مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19). يجب تضمين أنظمة التسليم الفعالة والآمنة في لقاحات الحمض النووي الريبوزي المرسال بسبب الخصائص الهشة للحمض النووي الريبوزي المرسال. تم تصميم نظام توصيل الجينات النانوية الببتيد بولوكسامين (PP-sNp) ذاتي التجميع خصيصا للتوصيل الرئوي للأحماض النووية ويعرض قدرات واعدة في التوسط في نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال الناجح. هنا ، يتم وصف طريقة محسنة لإعداد PP-sNp لتوضيح كيفية تغليف PP-sNp ل Metridia luciferase (MetLuc) mRNA ونقل الخلايا المستزرعة بنجاح. يتم الحصول على MetLuc-mRNA عن طريق عملية النسخ في المختبر من قالب الحمض النووي الخطي. يتم إنتاج PP-sNp عن طريق خلط الببتيد الاصطناعي / البولوكسامين مع محلول mRNA باستخدام خلاط microfluidic ، مما يسمح بالتجميع الذاتي ل PP-sNp. يتم تقييم شحنة PP-sNp لاحقا عن طريق قياس إمكانات زيتا. وفي الوقت نفسه ، يتم قياس التشتت المتعدد والحجم الهيدروديناميكي للجسيمات النانوية PP-sNp باستخدام تشتت الضوء الديناميكي. يتم نقل الجسيمات النانوية mRNA / PP-sNp إلى خلايا مستزرعة ، ويتم فحص المواد الفائقة من زراعة الخلايا لنشاط luciferase. تظهر النتائج التمثيلية قدرتها على النقل في المختبر. قد يلقي هذا البروتوكول الضوء على تطوير الجيل التالي من أنظمة توصيل لقاح الحمض النووي الريبوزي المرسال.

Introduction

وقد تم الإعلان عن التطعيم باعتباره واحدا من أكثر التدخلات الطبية كفاءة للحد من المراضة والوفيات الناجمة عن الأمراض المعدية1. وقد أثبتت أهمية اللقاحات منذ تفشي مرض فيروس كورونا 2019 (كوفيد-19). وعلى عكس المفهوم التقليدي لحقن مسببات الأمراض المعطلة أو الموهنة الحية، تركز أحدث نهج اللقاحات، مثل اللقاحات القائمة على الأحماض النووية، على الحفاظ على الخصائص المناعية لمسببات الأمراض المستهدفة مع تجنب قضايا السلامة المحتملة المرتبطة بالفيروس الميكروبي الكامل التقليدي أو في اللقاحات القائمة على البكتيريا. تظهر كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي (أي الحمض النووي الريبي المرسال المنسوخ في المختبر ، IVT mRNA) إمكانات وقائية إلى علاجية ضد مجموعة متنوعة من الأمراض ، بما في ذلك الأمراض المعدية والسرطانات 2,3. من حيث المبدأ، ترتبط إمكانات اللقاحات القائمة على الأحماض النووية بإنتاجها وفعاليتها وسلامتها4. يمكن تصنيع هذه اللقاحات بطريقة خالية من الخلايا للسماح بإنتاج فعال من حيث التكلفة وقابل للتطوير وسريع.

يمكن للقاح واحد قائم على الحمض النووي تشفير مستضدات متعددة ، مما يتيح استهداف العديد من المتغيرات الفيروسية أو البكتيريا مع انخفاض عدد التطعيمات وتعزيز الاستجابة المناعية ضد مسببات الأمراض المرنة 5,6. إلى جانب ذلك، يمكن أن تحاكي اللقاحات القائمة على الحمض النووي عملية الغزو الطبيعي للفيروس أو العدوى البكتيرية، مما يجلب استجابات مناعية بوساطة الخلايا البائية والخلايا التائية. على عكس بعض الفيروسات أو في اللقاحات القائمة على الحمض النووي ، توفر اللقاحات القائمة على IVT mRNA ميزة كبيرة من حيث السلامة. يمكنهم التعبير بسرعة عن المستضد المطلوب في السيتوسول ولا يتم دمجهم في الجينوم المضيف ، مما يغني عن المخاوف بشأن الطفرات الإدخالية7. يتحلل IVT-mRNA تلقائيا بعد الترجمة الناجحة ، لذلك يمكن التحكم بسهولة في حركية التعبير عن البروتين 8,9. بتحفيز من جائحة فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة، مكنت الجهود التي تبذلها الشركات/المؤسسات في جميع أنحاء العالم من إطلاق العديد من أنواع اللقاحات في السوق. وتظهر تكنولوجيا اللقاحات القائمة على الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT إمكانات كبيرة، وقد أثبتت لأول مرة نجاحها المتوقع سابقا، نظرا لتصميمها السريع وقدرتها المرنة على التكيف مع أي مستضدات مستهدفة في غضون عدة أشهر. لم يفتح نجاح لقاحات IVT mRNA ضد COVID-19 في التطبيقات السريرية حقبة جديدة من البحث والتطوير في لقاح IVT mRNA فحسب ، بل تراكم أيضا خبرة قيمة للتطوير السريع للقاحات الفعالة للتعامل مع تفشي الأمراض المعدية10,11.

على الرغم من الإمكانات الواعدة للقاحات الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT ، فإن التسليم الفعال داخل الخلايا ل IVT mRNA إلى موقع العمل (أي السيتوبلازم) لا يزال يشكل عقبة رئيسية12 ، خاصة بالنسبة لتلك التي تدار عبر الشعب الهوائية4. IVT mRNA هو بطبيعته جزيء غير مستقر مع عمر نصف قصير للغاية (~ 7 h)13 ، مما يجعل IVT mRNA عرضة للغاية للتدهور بواسطة RNase14 في كل مكان. تميل الخلايا الليمفاوية في الجهاز المناعي الفطري إلى ابتلاع الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT المعترف به في حالات التطبيق في الجسم الحي . علاوة على ذلك ، فإن كثافة الشحنة السالبة العالية والوزن الجزيئي الكبير (1 × 104-1 × 106 Da) ل IVT mRNA تضعف نفاذيتها الفعالة عبر الطبقة الثنائية من الدهون الأنيونية للأغشية الخلوية15. لذلك ، هناك حاجة إلى نظام توصيل مع بعض المواد الحيوية الوظيفية لمنع تدهور جزيئات الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT وتسهيل امتصاص الخلايا16.

بصرف النظر عن بعض الحالات الاستثنائية التي تم فيها استخدام الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT العاري مباشرة في التحقيقات في الجسم الحي ، يتم استخدام أنظمة التسليم المختلفة لنقل الحمض النووي الريبي المرسال IVT إلى الموقع العلاجي للعمل17,18. وقد كشفت الدراسات السابقة أنه يتم الكشف عن عدد قليل فقط من الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT في سيتوسول دون مساعدة من نظام التسليم19. تم تطوير العديد من الاستراتيجيات لتحسين توصيل الحمض النووي الريبي مع الجهود المستمرة في هذا المجال ، بدءا من تكثيف البروتامين إلى تغليف الدهون20. الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) هي الأكثر تقدما سريريا بين مركبات توصيل الحمض النووي الريبوزي المرسال ، كما ثبت من حقيقة أن جميع لقاحات mRNA COVID-19 المعتمدة للاستخدام السريري تستخدم أنظمة توصيل قائمة على LNP21. ومع ذلك، لا يمكن لل LNPs التوسط في نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال الفعال عندما يتم تسليم التركيبات عبر الطريق التنفسي22، مما يحد بشكل ملحوظ من تطبيق هذه التركيبات في تحفيز الاستجابات المناعية المخاطية أو معالجة الأمراض المرتبطة بالرئة مثل التليف الكيسي أو نقص α1-antitrypsin. لذلك ، فإن تطوير نظام تسليم جديد لتسهيل التسليم الفعال ونقل الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT في الخلايا المرتبطة بمجرى الهواء مطلوب لحل هذه الحاجة غير الملباة.

وقد تأكد أن نظام إيصال الجسيمات النانوية ذاتية التجميع من الببتيد والبولوكسامين (PP-sNp) يمكن أن يتوسط في النقل الفعال للأحماض النووية في الجهاز التنفسي للفئران23. يعتمد PP-sNp نهج تصميم معياري متعدد الوظائف ، والذي يمكنه دمج وحدات وظيفية مختلفة في الجسيمات النانوية للفحص السريع والتحسين23. يمكن أن تتفاعل الببتيدات الاصطناعية والبوليمرات المشتركة للكتلة البرمائية المحايدة كهربائيا (البولوكسامين) داخل PP-sNp تلقائيا مع IVT mRNA لتوليد جسيمات نانوية موزعة بشكل موحد مع بنية مدمجة وسطح أملس23. يمكن ل PP-sNp تحسين تأثير نقل الجينات لجزيئات IVT mRNA في الخلايا المستزرعة والجهاز التنفسي للفئران23. تصف هذه الدراسة بروتوكولا لتوليد PP-sNp يحتوي على الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT الذي يشفر Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (الشكل 1). يتم استخدام الخلط السريع والمتحكم فيه عبر جهاز خلط الموائع الدقيقة ، والذي يستخدم تصميم خلط العظام المتعرجة المتداخلة ، في هذا البروتوكول. الإجراء سهل التنفيذ ويسمح بتوليد PP-sNp بأحجام أكثر اتساقا. الهدف العام من إنتاج PP-sNp باستخدام خلاط الموائع الدقيقة هو إنشاء PP-sNp لتعقيد mRNA بطريقة يتم التحكم فيها جيدا ، مما يسمح بنقل الخلايا بكفاءة وقابلية للتكرار في المختبر. يصف هذا البروتوكول إعداد وتجميع وتوصيف PP-sNp المحتوي على MetLuc-mRNA.

Protocol

1. النسخ في المختبر من الحمض النووي الريبي المرسال المعدل كيميائيا

ملاحظة: يلزم استخدام أنابيب خالية من النوكليز ، والكواشف ، والأواني الزجاجية ، ونصائح الماصة ، وما إلى ذلك ، لأن RNases موجودة في كل مكان في البيئة ، مثل المحاليل المختبرية ، وأسطح الأدوات ، والشعر ، والجلد ، والغبار ، وما إلى ذلك. نظف أسطح المقاعد والماصات جيدا قبل الاستخدام ، وارتد قفازات لتجنب تلوث RNase.

  1. إجراء الخطية لقالب الحمض النووي.
    1. توليف إطار القراءة المفتوح (ORF) ل Metridia luciferase (MetLuc) المحاط بمروج بوليميراز T7 ، ومنطقة 5 'غير مترجمة (UTR) ، و 3'UTR ، وذيول poly (A) واستنساخها في ناقل PUC57 ، والذي يتم التعبير عنه في البكتيريا (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يتم توفير تسلسل الترميز لقالب الحمض النووي في الملف التكميلي 1.
    2. استزراع البكتيريا ، وتحلل البكتيريا ، وتنقية الحمض النووي البلازميد بواسطة العمود المقابل (انظر مجموعة استخراج الحمض النووي البلازميد في جدول المواد).
    3. قم بإجراء تفاعل واحد 50 ميكرولتر يحتوي على 2 ميكرولتر من BamHI و 2 ميكرولتر من KpnI (انظر جدول المواد) و 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، وتحقيق خطية لقالب الحمض النووي.
  2. قم بإجراء النسخ في المختبر لإنشاء الحمض النووي الريبوزي المرسال غير المغطى بتقنية IVT.
    1. قم بإجراء تخليق mRNA بواسطة تفاعل واحد 20 ميكرولتر باستخدام مجموعة نسخ T7 و pseudouridine (انظر جدول المواد): 10 ميكرولتر (0.8-1 ميكروغرام) من قالب الحمض النووي الخطي ، و 1.5 ميكرولتر (150 ملليمتر) من ATP ، و UTP الزائف ، و GTP ، و CTP ، و 2 ميكرولتر من مخزن النسخ المؤقت 10x ، و 1 ميكرولتر من إنزيم T7 ، و 1 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز (NF-water). امزج المكونات المذكورة أعلاه جيدا واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
  3. إزالة الحمض النووي القالب.
    1. أضف 1 ميكرولتر (1 U) من DNase (خال من RNase) بعد عملية النسخ واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. قم بإجراء تنقية الحمض النووي الريبوزي المرسال غير المغطاة IVT باستخدام ترسيب كلوريد الليثيوم.
    1. تنقية الحمض النووي الريبوزي المرسال غير المغطى باستخدام كلوريد الليثيوم (انظر جدول المواد) بتركيز عمل يبلغ 10 مللي متر. أضف 50 ميكرولتر من كلوريد الليثيوم 10 مللي متر إلى 20 ميكرولتر من محلول الحمض النووي الريبوزي المرسال غير المغطى IVT.
    2. امزج الحجم الكامل جيدا واتركه يبرد عند -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. اجمع الحمض النووي الريبوزي المرسال غير المغطى IVT لمدة 12 دقيقة عند 12000 × g ، والذي ينتج بشكل روتيني 80-120 ميكروغرام من mRNA غير المغطى IVT من كل تفاعل واحد 20 ميكرولتر.
  5. أداء IVT mRNA السقوف.
    1. قم بإجراء تغطية IVT mRNA باستخدام نظام تغطية الغطاء 1 (انظر جدول المواد). باختصار ، قم بإزالة البنية الثانوية ل 50 ميكروغرام من الحمض النووي الريبوزي المرسال غير المغطى بتقنية IVT عن طريق التسخين عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم قم بربط نهاية 5' من mRNA غير المغطاة بالغطاء 1 ، والذي يتم إعداده عن طريق تعديل بنية غطاء m7G باستخدام 2.5 ميكرولتر من s-adenosylmethionine (SAM) (20 mM) و 4 ميكرولتر من 2'-O-methyltransferase (100 U) في تفاعل 100 ميكرولتر عند 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
    2. تنقية 100 ميكرولتر من الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT المغطى باستخدام 250 ميكرولتر من كلوريد الليثيوم 10 مللي متر وتمييعه في 50 ميكرولتر من الماء NF.
  6. تحديد النقاء والحجم الجزيئي للحمض النووي الريبوزي المرسال المغطى بتقنية IVT.
    1. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبوزي المرسال المغطى بتقنية IVT باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية. باستخدام علامة الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد) ، قم بتحليل الحجم الجزيئي ل mRNA المغطى بتقنية IVT في هلام أغاروز 1٪ من الفورمالديهايد الذي يحتوي على 18٪ من الفورمالديهايد (الجهد هو 120 فولت). تأكد من تخزين الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) غير المغطى بتقنية IVT والحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) المغطى بتقنية IVT عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: اعتبر الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT ذا نقاء جيد في نسبة A 260 / A280 من 1.8-2.1 ونسبة A260 / A230 من 2.0 أو أعلى قليلا.

2. توليد IVT mRNA / PP-sNp

  1. تحضير محلول مخزون البولوكسامين 704 (T704) عن طريق إذابة T704 (انظر جدول المواد) في الماء NF للحصول على محلول مخزون 10 ملغم / مل. تخزين الحل المحضر في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يحتوي T704 على هيكل على شكل حرف X مصنوع من مجموعة مركزية من الإيثيلين ديامين مرتبطة بأربع سلاسل من كتل البولي (أكسيد البروبيلين) (PPO) وكتل البولي (أكسيد الإيثيلين) (PEO)24. الوزن الجزيئي (Mw) ل T704 هو 5500.
  2. تحضير محلول مخزون الببتيد الاصطناعي (sPep ، انظر جدول المواد) عن طريق إذابة sPep (التسلسل: KETWWETWWTEWTEWTEWKKRRRRRKKKKGACSE
    RSMNFCG) في NF-water للحصول على محلول مخزون 2 ملغم / مل وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
  3. قم بإعداد محلول IVT mRNA عن طريق إذابة الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT (الخطوة 1) على الجليد والطرد المركزي قريبا لمدة 3 ثوان عند 300 × g في درجة حرارة الغرفة قبل فتح الأنبوب. قم بتخفيف محلول IVT mRNA إلى 0.04 ميكروغرام / ميكرولتر بماء NF.
    ملاحظة: يوصى بالعمل في خزانة السلامة الأحيائية كلما أمكن ذلك باستخدام الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT.
  4. قم بإعداد محلول مزيج T704 و sPep عن طريق تخفيف محلول sPep إلى 0.555 ميكروغرام / ميكرولتر ومحلول T704 إلى 8 ميكروغرام / ميكرولتر بماء NF. احتضن المحلول المختلط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام الإضافي.
    ملاحظة: حساب مكون sPep المطلوب استنادا إلى نسبة N/P المطلوبة. نسبة N / P هي العدد الإجمالي لبقايا النيتروجين (N) داخل sPep إلى العدد الإجمالي لمجموعات الفوسفات سالبة الشحنة (P) داخل الحمض النووي الريبوزي المرسال IVT. احسب T704 المطلوب استنادا إلى نسبة الوزن/الوزن (w/w) بين T704 و IVT mRNA. من الضروري أن تكون نسبة N / P هي 5 ونسبة w / w هي 100.
  5. قم بإعداد صيغة IVT mRNA / PP-sNp باتباع الخطوات أدناه.
    1. اسحب محلول IVT mRNA (الخطوة 3) إلى حقنة سعة 1 مل ، مما يضمن عدم وجود فجوات هوائية أو فقاعات في طرف المحقنة. قم بتحميل المحقنة في جانب واحد من الخرطوشة بجوار الكتلة الدوارة.
    2. املأ حقنة سعة 1 مل بمحلول مزيج T704 و sPep (الخطوة 4). قم بإزالة أي فقاعات أو فجوات هوائية عند طرف المحقنة ووضع المحقنة في المدخل الآخر للمضخة (انظر جدول المواد).
    3. اضبط المضخة بنسبة تدفق 1:1 ومعدل تدفق إجمالي يتراوح بين 4-10 ملليلتر/دقيقة.
      ملاحظة: معدل التدفق الإجمالي البالغ 6 مل / دقيقة هو الأمثل في الدراسات المقدمة هنا.
    4. ضع أنبوبا مخروطيا خاليا من RNase سعة 10 مل (انظر جدول المواد) لجمع محلول IVT-mRNA/PP-sNp المختلط في نهاية مسار تدفق جهاز الخلط.
    5. قم بتشغيل المضخة لبدء الخلط ، مما يضمن إدخال المعلمات بشكل صحيح. بعد الانتهاء من تشغيل المضخة لمدة 6 ثوان ، قم بجمع عينة IVT-mRNA / PP-sNp من الأنبوب المخروطي.
      ملاحظة: تم إنشاء PP-sNp باستخدام خلاط ميكروفلويديك (الشكل التكميلي 1). يتكون الجهاز من مضخة تدفق ثابت وجهاز ربط وشريحة وجهاز ثابت. في عملية الخلط ، تقوم مضخة التدفق الثابت المتصلة بالشريحة بتوصيل السائل إلى الشريحة وفقا لمعدل التدفق المحدد مسبقا. يمكن توصيل مضخة التدفق الثابت المتصلة بقنوات إدخال متعددة للشريحة باستخدام قناة إخراج واحدة. تم الحصول على مكونات الجهاز ، بما في ذلك الشريحة ، من مصادر تجارية وتجميعها بشكل عقلاني (انظر جدول المواد). قد تختلف المعلمات ، مثل معدل التدفق وحجم حل IVT mRNA والحل المختلط T704-sPep ، عن تلك المعروضة في البروتوكول الحالي إذا تم استخدام بعض الإعدادات المختلفة ويجب تحسينها وفقا لذلك.

3. قياس القطر الهيدروديناميكي وتعدد التشتت ل IVT-mRNA / PP-sNp

  1. قم بتخفيف أليكوت من محلول IVT mRNA / PP-sNp (الخطوة 2) باستخدام NF-water للحصول على حجم نهائي قدره 1 مل.
  2. قم بقياس الحجم الهيدروديناميكي ومؤشر التشتت المتعدد (PDI) باستخدام كوفيت25 شبه صغير. أضف محلول IVT mRNA / PP-sNp إلى الكوفيت وضعه في مقياس حجم الجسيمات (انظر جدول المواد). قم بإعداد إجراء تشغيل قياسي وانقر فوق ابدأ لبدء الحصول على البيانات.

4. إعداد الخلايا للنقل

  1. صفيحة الخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية (16HBE) وخط الخلايا المتغصنة (DC2.4) في 96 لوحة بئر بكثافة 3.5 × 104 خلايا / بئر 24 ساعة قبل النقل. تنمو الخلايا في وسط ثقافة مكمل بنسبة 10٪ مصل بقري جنيني معطل حراريا و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    ملاحظة: تم الحصول على الخلايا من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
  2. احتضان الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2 الغلاف الجوي) لمدة 24 ساعة لضمان أن الخلايا تلتقي 60٪ -80٪ قبل النقل.

5. نقل الخلايا المستزرعة

  1. بعد إزالة وسط النمو ، اغسل الخلايا المطلية ب 0.2 مل / بئر 1x PBS.
  2. أضف 170 ميكرولتر من وسط الاستزراع الخالي من المصل إلى كل بئر يحتوي على مزارع الخلايا المطلية.
  3. أضف تركيبة IVT mRNA / PP-sNp التي تحتوي على 0.4 ميكروغرام من MetLuc mRNA (المحضر في الخطوة 2) بكمية 30 ميكرولتر / بئر.
  4. احتضن الخلايا باستخدام تركيبة IVT mRNA / PP-sNp عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 4 ساعات.
  5. استبدل وسط النقل ب 0.2 مل من وسط الثقافة الطازجة المكمل بمصل بقري جنيني معطل حراريا بنسبة 10٪ و 1٪ (v / v) بنسلين / ستربتومايسين.
    ملاحظة: تم تسخين مصل البقر الجنيني عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للتعطيل.
  6. احتضان الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية وفي جو غني بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة 24 ساعة وجمع المواد الفائقة ليتم اكتشافها من كل بئر.

6. تحليل فعالية نقل الخلايا باستخدام فحص Metridia luciferase (MetLuc)

  1. فحص supernatant من كل بئر لنشاط MetLuc باستخدام الركيزة coelenterazine (انظر جدول المواد) باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بإعداد محلول فحص جديد عن طريق إضافة 1x PBS إلى ركيزة coelenterazine (تركيز coelenterazine هو 15 mM).
    2. دوامة حل coelenterazine لمدة 10 ثانية للخلط الشامل.
    3. أضف 50 ميكرولتر من supernatant (تم جمعها في الخطوة 5) إلى لوحة 96 بئرا.
    4. قم بإعداد قارئ الصفائح الدقيقة (انظر جدول المواد) مع وقت قراءة يبلغ 1000 مللي ثانية قبل إضافة 30 ميكرولتر من محلول coelenterazine (15 mM) إلى كل بئر يدويا أو عن طريق الحقن الآلي.
    5. انقر فوق ابدأ لقياس إشارة التلألؤ مباشرة بعد إضافة محلول coelenterazine إلى supernatant.
      ملاحظة: يتم قياس إشارة التلألؤ باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة، ويتم التعبير عن نشاطها بوحدات ضوئية نسبية. سيتم استخدام القيم التي تم الحصول عليها من الآبار المنقولة بواسطة PBS كعناصر تحكم فارغة.

النتائج

تم هضم البلازميد المؤتلف لإنتاج قالب الحمض النووي الخطي (الشكل 2A). باستخدام البروتوكول الموصوف ، يمكن لمجموعة النسخ T7 في المختبر إنتاج ما يصل إلى 80-120 ميكروغرام من MetLuc-mRNA غير المغطى لكل تفاعل 20 ميكرولتر و 50-60 ميكروغرام من MetLuc-mRNA المغطى لكل تفاعل 100 ميكرولتر. عند تحليلها ب...

Discussion

لا يسمح البروتوكول الموصوف هنا فقط بالإنتاج الفعال من حيث التكلفة والسريع لتركيبات لقاح IVT mRNA ذات الخصائص المحددة ، ولكنه يوفر أيضا إمكانية تخصيص تركيبة PP-sNp وفقا لأغراض علاجية محددة ، مثل العلاج الجيني. من أجل ضمان التوليد الناجح ل IVT mRNA / PP-sNp ، يقترح إيلاء المزيد من الاهتمام لبعض الخطوات ا?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ، المنحة رقم 82041045 و 82173764) ، والمشروع الرئيسي لدراسة نظام تكنولوجيا الإمراض والوقاية من الأوبئة (2021YFC2302500) من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين ، ومشروع تشونغتشينغ للمواهب: المواهب الشابة الاستثنائية (CQYC202005027) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغتشينغ (cstc2021jcyj-msxmX0136). المؤلفون ممتنون للدكتور شياويان دينغ لقياس القطر الهيدروديناميكي (نانومتر) ومؤشر التشتت المتعدد (PDI).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BamHITakara1010
cap 1 capping systemJinanM082
Dendritic cell-lineSigmaSCC142
DNA sequenceGenescript
Human bronchial epithelial cellsSigmaSCC150
KpnITakara1068
LPBeyotimeC0533
Lithium chlorideAPEXBioB6083
Malvern Zetasizer Nano ZS90MalvernNB007605
Microfluidic chipZHONGXINQIHENGStandard PDMS chip
Microplate readersThermoFisherVarioskan lux
NanoDrop OneThermoFisherND-ONE-W (A30221)
Nuclease-free waterThermoFisherAM9932
OptiMEMGibco31985070
Penicillin-streptomycinGibco15140122
PseudouridineAPE×BioB7972
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Quanti-LucInvivoGenRep-qlc2
RiboRuler High Range RNA LadderThermoFisherSM1821
RNase-free conical tubeBiosharpBS-100-M
RPMI Medium 1640ThermoFisherC11875500BT
Syringe pumpChemyxFusion 101
T7 transcription KitJinanE131

References

  1. Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020)
  2. Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
  3. Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
  4. Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).
  5. Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
  6. Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
  7. Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
  8. Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  9. Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
  10. Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
  11. Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
  12. Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
  13. Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
  14. Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  15. Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
  16. Sahin, U., Karikó, K., Türeci, &. #. 2. 1. 4. ;. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
  17. Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).
  18. Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
  19. Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).
  20. Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
  21. Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
  22. Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788 (2022).
  23. Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
  24. Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).
  25. Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).
  26. Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
  27. Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
  28. Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
  29. Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673 (2020).
  30. Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).
  31. Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826 (2021).
  32. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved