Effiziente Transfektion von in vitro transkribierter mRNA in kultivierten Zellen mit Peptid-Poloxamin-Nanopartikeln

Zusammenfassung

Ein selbstorganisiertes Peptid-Poloxamin-Nanopartikel (PP-sNp) wird unter Verwendung einer mikrofluidischen Mischvorrichtung entwickelt, um in vitro transkribierte Boten-RNA zu verkapseln und zu liefern. Die beschriebene mRNA/PP-sNp konnte kultivierte Zellen in vitro effizient transfizieren.

Zusammenfassung

In-vitro-transkribierte Boten-RNA (mRNA)-Impfstoffe haben ein enormes Potenzial im Kampf gegen die Coronavirus-Pandemie 2019 (COVID-19) gezeigt. Aufgrund der fragilen Eigenschaften der mRNA müssen effiziente und sichere Verabreichungssysteme in die mRNA-Impfstoffe aufgenommen werden. Ein selbstorganisierendes Peptid-Poloxamin-Nanopartikel (PP-sNp)-Genabgabesystem wurde speziell für die pulmonale Abgabe von Nukleinsäuren entwickelt und zeigt vielversprechende Fähigkeiten bei der Vermittlung einer erfolgreichen mRNA-Transfektion. Hier wird eine verbesserte Methode zur Herstellung von PP-sNp beschrieben, um zu erläutern, wie das PP-sNp Metridia luciferase (MetLuc) mRNA einkapselt und kultivierte Zellen erfolgreich transfiziert. MetLuc-mRNA wird durch einen in vitro Transkriptionsprozess aus einer linearen DNA-Vorlage gewonnen. Ein PP-sNp wird durch Mischen von synthetischem Peptid / Poloxamin mit mRNA-Lösung unter Verwendung eines mikrofluidischen Mischers hergestellt, was die Selbstorganisation von PP-sNp ermöglicht. Die Ladung von PP-sNp wird anschließend durch Messung des Zetapotentials bewertet. Gleichzeitig werden die Polydispersität und hydrodynamische Größe von PP-sNp-Nanopartikeln mittels dynamischer Lichtstreuung gemessen. Die mRNA/PP-sNp-Nanopartikel werden in kultivierte Zellen transfiziert, und Überstände aus der Zellkultur werden auf Luciferase-Aktivität untersucht. Die repräsentativen Ergebnisse belegen ihre Fähigkeit zur In-vitro-Transfektion . Dieses Protokoll könnte Aufschluss über die Entwicklung von mRNA-Impfstoffverabreichungssystemen der nächsten Generation geben.

Einleitung

Die Impfung gilt als eine der effizientesten medizinischen Maßnahmen zur Verringerung der Morbidität und Mortalität durch Infektionskrankheiten¹. Die Bedeutung von Impfstoffen zeigt sich seit dem Ausbruch der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19). Im Gegensatz zum traditionellen Konzept der Injektion inaktivierter oder lebend attenuierter Krankheitserreger konzentrieren sich moderne Impfstoffansätze, wie z. B. Impfstoffe auf Nukleinsäurebasis, darauf, die immunstimulierenden Eigenschaften der Zielpathogene zu erhalten und gleichzeitig die potenziellen Sicherheitsprobleme zu vermeiden, die mit den herkömmlichen ganzmikrobiellen Virus- oder bakte....

Protokoll

1. In-vitro-Transkription chemisch modifizierter mRNA

HINWEIS: Es ist erforderlich, nukleasefreie Röhrchen, Reagenzien, Glaswaren, Pipettenspitzen usw. zu verwenden, da RNasen in der Umwelt allgegenwärtig sind, wie Laborlösungen, Instrumentenoberflächen, Haare, Haut, Staub usw. Reinigen Sie die Tischoberflächen und Pipetten vor Gebrauch gründlich und tragen Sie Handschuhe, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden.

1. Führen Sie eine Linearisierung der DNA-Vorlage durch.
   1. Synthetisieren Sie den offenen Leserahmen (ORF) von Metridia luciferase (MetLuc), flankiert von einem T7-Polymerase-Promotor, 5' untr....

Ergebnisse

Das rekombinante Plasmid wurde verdaut, um die linearisierte DNA-Vorlage herzustellen (Abbildung 2A). Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls kann das T7 in vitro Transkriptionskit bis zu 80-120 μg unverschlossene MetLuc-mRNA pro 20 μL Reaktion und 50-60 μg verschlossene MetLuc-mRNA pro 100 μL Reaktion erzeugen. Bei der Analyse mit Elektrophorese sollte intakte MetLuc-mRNA mit hoher Qualität eine einzige und klare Bande aufweisen, wie in Abbildung 2B<.......

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht nicht nur die kostengünstige und schnelle Herstellung von IVT-mRNA-Impfstoffformulierungen mit definierten Eigenschaften, sondern bietet auch die Möglichkeit, die PP-sNp-Formulierung an spezifische therapeutische Zwecke, wie z.B. Gentherapie, anzupassen. Um die erfolgreiche Generierung von IVT mRNA/PP-sNp zu gewährleisten, wird empfohlen, einige kritische Schritte besonders zu beachten. Denken Sie bei der Arbeit mit mRNA immer daran, dass RNase-freie Bedingungen während des.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI	Takara	1010
cap 1 capping system	Jinan	M082
Dendritic cell-line	Sigma	SCC142
DNA sequence	Genescript
Human bronchial epithelial cells	Sigma	SCC150
KpnI	Takara	1068
LP	Beyotime	C0533
Lithium chloride	APEXBio	B6083
Malvern Zetasizer Nano ZS90	Malvern	NB007605
Microfluidic chip	ZHONGXINQIHENG	Standard PDMS chip
Microplate readers	ThermoFisher	Varioskan lux
NanoDrop One	ThermoFisher	ND-ONE-W (A30221)
Nuclease-free water	ThermoFisher	AM9932
OptiMEM	Gibco	31985070
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Pseudouridine	APE×Bio	B7972
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Quanti-Luc	InvivoGen	Rep-qlc2
RiboRuler High Range RNA Ladder	ThermoFisher	SM1821
RNase-free conical tube	Biosharp	BS-100-M
RPMI Medium 1640	ThermoFisher	C11875500BT
Syringe pump	Chemyx	Fusion 101
T7 transcription Kit	Jinan	E131