Transfection efficace d’ARNm transcrit in vitro dans des cellules cultivées à l’aide de nanoparticules de peptide-poloxamine

Résumé

Une nanoparticule peptide-poloxamine auto-assemblée (PP-sNp) est développée à l’aide d’un dispositif de mélange microfluidique pour encapsuler et délivrer in vitro de l’ARN messager transcrit. L’ARNm/PP-sNp décrit pourrait transfecter efficacement des cellules cultivées in vitro.

Résumé

Les vaccins à ARN messager transcrit in vitro (ARNm) ont montré un énorme potentiel dans la lutte contre la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Des systèmes d’administration efficaces et sûrs doivent être inclus dans les vaccins à ARNm en raison des propriétés fragiles de l’ARNm. Un système de livraison de gènes de nanoparticules peptide-poloxamine (PP-sNp) auto-assemblé est spécialement conçu pour l’administration pulmonaire d’acides nucléiques et présente des capacités prometteuses dans la médiation d’une transfection réussie de l’ARNm. Ici, une méthode améliorée de préparation de PP-sNp est décrite pour expliquer comment le PP-sNp encapsule l’ARNm de la Metridia luciferase (MetLuc) et transfecte avec succès les cellules en culture. L’ARNm MetLuc-est obtenu par un processus de transcription in vitro à partir d’un modèle d’ADN linéaire. Un PP-sNp est produit en mélangeant un peptide synthétique / poloxamine avec une solution d’ARNm à l’aide d’un mélangeur microfluidique, permettant l’auto-assemblage de PP-sNp. La charge de PP-sNp est ensuite évaluée en mesurant le potentiel zêta. Pendant ce temps, la polydispersité et la taille hydrodynamique des nanoparticules PP-sNp sont mesurées à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière. Les nanoparticules d’ARNm / PP-sNp sont transfectées dans des cellules en culture, et les surnageants de la culture cellulaire sont dosés pour l’activité de la luciférase. Les résultats représentatifs démontrent leur capacité de transfection in vitro. Ce protocole pourrait faire la lumière sur le développement de systèmes d’administration de vaccins à ARNm de nouvelle génération.

Introduction

La vaccination a été annoncée comme l’une des interventions médicales les plus efficaces pour réduire la morbidité et la mortalité causées par les maladies infectieuses¹. L’importance des vaccins a été démontrée depuis l’épidémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Contrairement au concept traditionnel d’injection d’agents pathogènes inactivés ou vivants atténués, les approches vaccinales de pointe, telles que les vaccins à base d’acides nucléiques, se concentrent sur la préservation des propriétés immunostimulantes des agents pathogènes cibles tout en évitant les problèmes d’innocuité potentiels associés aux vaccins conventionnels à base de virus microbiens entiers ou à bactéries. Les vaccins à base d’ADN et d’ARN (c.-à-d. ARN messager transcrit in vitro, ARNm IVT) présentent un potentiel prophylactique à thérapeutique contre diverses maladies, y compris les maladies infectieuses et les cancers ^2,3. En principe, le potentiel des vaccins à base d’acides nucléiques est lié à leur production, à leur efficacité et à leur innocuité⁴. Ces vaccins peuvent être fabriqués sans cellules pour permettre une production rentable, évolutive et rapide.

Un seul vaccin à base d’acide nucléique peut coder pour plusieurs antigènes, ce qui permet de cibler de nombreuses variantes virales ou bactéries avec un nombre réduit d’inoculations et de renforcer la réponse immunitaire contre les agents pathogènes résilients ^5,6. En outre, les vaccins à base d’acides nucléiques pourraient imiter le processus d’invasion naturel d’une infection virale ou bactérienne, apportant à la fois des réponses immunitaires médiées par les cellules B et T. Contrairement à certains vaccins à base de virus ou d’ADN, les vaccins à base d’ARNm IVT offrent un énorme avantage en termes de sécurité. Ils peuvent rapidement exprimer l’antigène désiré dans le cytosol et ne sont pas intégrés dans le génome de l’hôte, ce qui évite les inquiétudes concernant la mutagénèse insertionnelle⁷. L’ARNm IVT est automatiquement dégradé après une traduction réussie, de sorte que sa cinétique d’expression protéique peut être facilement contrôlée ^8,9. Catalysés par la pandémie de coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), les efforts des entreprises / institutions du monde entier ont permis la mise sur le marché de nombreux types de vaccins. La technologie vaccinale à base d’ARNm IVT présente un grand potentiel et, pour la première fois, a démontré son succès précédemment attendu, en raison de sa conception rapide et de sa capacité flexible à s’adapter à n’importe quel antigène cible en quelques mois. Le succès des vaccins à ARNm IVT contre la COVID-19 dans les applications cliniques a non seulement ouvert une nouvelle ère de recherche et de développement de vaccins à ARNm IVT, mais a également accumulé une expérience précieuse pour le développement rapide de vaccins efficaces pour faire face aux épidémies de maladies infectieuses^10,11.

Malgré le potentiel prometteur des vaccins à ARNm IVT, l’administration intracellulaire efficace de l’ARNm IVT au site d’action (cytoplasme) continue de poser un obstacle majeur¹², en particulier pour ceux administrés par les voies respiratoires⁴. L’ARNm IVT est intrinsèquement une molécule instable avec une demi-vie extrêmement courte (~7 h)¹³, ce qui rend l’ARNm IVT très sujet à la dégradation par l’omniprésente RNase¹⁴. Les lymphocytes du système immunitaire inné ont tendance à engloutir l’ARNm IVT reconnu en cas d’application in vivo . De plus, la densité de charge négative élevée et le poids moléculaire élevé (1 x 10^4-1 x 10⁶ Da) de l’ARNm IVT altèrent sa perméation efficace à travers la bicouche lipidique anionique des membranes cellulaires¹⁵. Par conséquent, un système d’administration avec certains matériaux biofonctionnels est nécessaire pour inhiber la dégradation des molécules d’ARNm IVT et faciliter l’absorption cellulaire¹⁶.

Mis à part quelques cas exceptionnels dans lesquels l’ARNm IVT nu a été directement utilisé pour des investigations in vivo, divers systèmes d’administration sont utilisés pour transporter l’ARNm IVT vers le site d’action thérapeutique^17,18. Des études antérieures ont révélé que seuls quelques ARNm IVT sont détectés dans le cytosol sans l’aide d’un système d’administration¹⁹. De nombreuses stratégies ont été développées pour améliorer la livraison de l’ARN avec des efforts continus sur le terrain, allant de la condensation de protamine à l’encapsulation^{lipidique 20}. Les nanoparticules lipidiques (LNP) sont les plus avancées cliniquement parmi les véhicules d’administration d’ARNm, comme le prouve le fait que tous les vaccins à ARNm COVID-19 approuvés pour un usage clinique utilisent des systèmes d’administration basés sur la LNP²¹. Cependant, les LNP ne peuvent pas arbitrer une transfection efficace de l’ARNm lorsque les formulations sont administrées par voie respiratoire²², ce qui limite remarquablement l’application de ces formulations pour induire des réponses immunitaires muqueuses ou traiter des maladies pulmonaires telles que la mucoviscidose ou le déficit en α1-antitrypsine. Par conséquent, le développement d’un nouveau système d’administration pour faciliter la livraison et la transfection efficaces de l’ARNm IVT dans les cellules liées aux voies respiratoires est nécessaire pour répondre à ce besoin non satisfait.

Il a été confirmé que le système d’administration de nanoparticules auto-assemblées peptide-poloxamine (PP-sNp) peut arbitrer la transfection efficace des acides nucléiques dans les voies respiratoires des souris²³. Le PP-sNp adopte une approche de conception modulaire multifonctionnelle, qui peut intégrer différents modules fonctionnels dans les nanoparticules pour un criblage et une optimisation rapides²³. Les peptides synthétiques et les copolymères blocs amphiphiles électriquement neutres (poloxamine) au sein du PP-sNp peuvent interagir spontanément avec l’ARNm IVT pour générer des nanoparticules uniformément distribuées avec une structure compacte et une surface lisse²³. PP-sNp peut améliorer l’effet de transfection génique des molécules d’ARNm IVT dans les cellules en culture et les voies respiratoires de souris²³. La présente étude décrit un protocole de génération d’ARNm PP-sNp contenant de l’IVT codant pour la Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (Figure 1). Un mélange contrôlé et rapide via un dispositif de mélange microfluidique, qui utilise la conception de mélange à chevrons décalés, est utilisé dans ce protocole. La procédure est facile à exécuter et permet la génération de PP-sNp avec des tailles plus uniformes. L’objectif général de la production de PP-sNp à l’aide du mélangeur microfluidique est de créer du PP-sNp pour la complexation de l’ARNm de manière bien contrôlée, permettant ainsi une transfection cellulaire efficace et reproductible in vitro. Le présent protocole décrit la préparation, l’assemblage et la caractérisation du PP-sNp contenant de l’ARNm MetLuc.

Protocole

1. Transcription in vitro d’ARNm chimiquement modifié

REMARQUE: Il est nécessaire d’utiliser des tubes sans nucléase, des réactifs, de la verrerie, des pointes de pipettes, etc., car les RNases sont omniprésentes dans l’environnement, tels que les solutions de laboratoire, les surfaces d’instruments, les cheveux, la peau, la poussière, etc. Nettoyez soigneusement les surfaces de paillasse et les pipettes avant utilisation, et portez des gants pour éviter la contamination par RNase.

1. Effectuer la linéarisation du modèle d’ADN.
   1. Synthétiser le cadre de lecture ouvert (ORF) de Metridia luciferase (MetLuc) flanqué d’un promoteur de polymérase T7, de queues de région non traduite (UTR) 5', 3'UTR et poly (A) et clonez-le dans le vecteur PUC57, qui est exprimé en bactéries (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : La séquence de codage du modèle d’ADN est fournie dans le dossier supplémentaire 1.
   2. Culture de bactéries, lyser les bactéries et purifier l’ADN plasmidique par la colonne correspondante (voir kit d’extraction d’ADN plasmidique dans le tableau des matériaux).
   3. Effectuer une seule réaction de 50 μL contenant 2 μL de BamHI, 2 μL de KpnI (voir le tableau des matériaux) et 2 μg d’ADN plasmidique à 37 °C pendant 1 h, et obtenir la linéarisation de la matrice d’ADN.
2. Effectuer une transcription in vitro pour générer un ARNm IVT non plafonné.
   1. Effectuer la synthèse de l’ARNm par une seule réaction de 20 μL à l’aide d’un kit de transcription T7 et de pseudouridine (voir le tableau des matériaux) : 10 μL (0,8-1 μg) de matrice d’ADN linéarisée, 1,5 μL (150 mM) d’ATP, pseudo-UTP, GTP et CTP, 2 μL de tampon de transcription 10x, 1 μL d’enzyme T7 et 1 μL d’eau sans nucléase (NF-eau). Bien mélanger les composants susmentionnés et incuber à 37 °C pendant 3 h.
3. Supprimez l’ADN du modèle.
   1. Ajouter 1 μL (1 U) de DNase (sans RNase) après le processus de transcription et incuber à 37 °C pendant 15 min.
4. Effectuer une purification de l’ARNm IVT non plafonné en utilisant la précipitation du chlorure de lithium.
   1. Purifier l’ARNm IVT non coiffé à l’aide de chlorure de lithium (voir le tableau des matériaux) à une concentration de travail de 10 mM. Ajouter 50 μL de chlorure de lithium 10 mM à 20 μL de solution d’ARNm IVT non bouchée.
   2. Bien mélanger le volume complet et refroidir à −20 °C pendant 1 h. Recueillir l’ARNm IVT non capiffé pendant 12 minutes à 12 000 x g, ce qui produit systématiquement 80 à 120 μg d’ARNm IVT non capifié à partir de chaque réaction de 20 μL.
5. Effectuer le plafonnement de l’ARNm IVT.
   1. Effectuer le plafonnement de l’ARNm IVT à l’aide du système de coiffage de la coiffe 1 (voir le tableau des matériaux). Brièvement, enlever la structure secondaire de 50 μg d’ARNm IVT non coiffé en chauffant à 65 °C pendant 10 min, puis relier l’extrémité 5' de l’ARNm IVT non capiffé avec le capuchon 1, qui est préparé en modifiant la structure du chapeau m7G en utilisant 2,5 μL de s-adénosylméthionine (SAM) (20 mM) et 4 μL de 2'-O-méthyltransférase (100 U) dans une réaction de 100 μL à 37 °C pendant 30-60 min.
   2. Purifier 100 μL de l’ARNm IVT coiffé en utilisant 250 μL de chlorure de lithium 10 mM et diluer dans 50 μL d’eau NF.
6. Déterminer la pureté et la taille moléculaire de l’ARNm IVT coiffé.
   1. Mesurer la concentration d’ARNm IVT coiffé avec un spectrophotomètre UV-visible. À l’aide d’un marqueur d’ARN (voir le tableau des matériaux), analyser la taille moléculaire de l’ARNm IVT coiffé dans un gel d’agarose dénaturant au formaldéhyde à 1 % contenant 18 % de formaldéhyde (tension de 120 V). Assurez-vous que l’ARNm IVT non capuchonné et l’ARNm IVT coiffé sont stockés à -80 °C.
      REMARQUE: L’ARNm IVT a été considéré comme ayant une bonne pureté dans un rapport A 260 / A₂₈₀ de 1,8-2,1 et un rapport A_{260 / A 230} de 2,0 ou légèrement supérieur.

2. Génération d’ARNm/PP-sNp IVT

1. Préparer la solution mère de poloxamine 704 (T704) en solubilisant la T704 (voir le tableau des matières) dans de l’eau NF pour obtenir une solution mère à 10 mg/mL. Conserver la solution préparée à 4 °C.
   NOTE: T704 contient une structure en forme de X faite d’un groupe central d’éthylènediamine liée à quatre chaînes de blocs de poly(oxyde de propylène) (PPO) et de blocs de poly(oxyde d’éthylène) (PEO)²⁴. Le poids moléculaire (Mw) de T704 est de 5500.
2. Préparer la solution mère de peptide synthétique (sPep, voir le tableau des matières) en solubilisant la sPep (séquence : KETWWETWWTEWWTEWKKKKRRRRRKKKKGACSE
   RSMNFCG) dans de l’eau NF pour obtenir une solution mère à 2 mg/mL et conserver à 4 °C.
3. Préparer la solution d’ARNm IVT en décongelant l’ARNm IVT (étape 1) sur de la glace et en centrifugeant brièvement pendant 3 s à 300 x g à température ambiante avant d’ouvrir le tube. Diluer la solution d’ARNm IVT à 0,04 μg/μL avec de l’eau NF.
   REMARQUE: Il est recommandé de travailler dans une enceinte de biosécurité chaque fois que possible avec l’ARNm IVT.
4. Préparer la solution de mélange T704 et sPep en diluant la solution de sPep à 0,555 μg/μL et la solution de T704 à 8 μg/μL avec de l’eau NF. Incuber la solution mélangée pendant 15 min à température ambiante avant de l’utiliser à nouveau.
   REMARQUE: Calculez le composant sPep requis en fonction du rapport N/P souhaité. Le rapport N/P est le nombre total de résidus d’azote (N) dans le sPep par rapport au nombre total de groupes phosphate chargés négativement (P) dans l’ARNm IVT. Calculez le T704 requis en fonction du rapport poids/poids (p/p) entre T704 et l’ARNm IVT. Il faut que le rapport N/P soit de 5 et que le rapport p/p soit de 100.
5. Préparez la formulation IVT mRNA/PP-sNp en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Aspirez la solution d’ARNm IVT (étape 3) dans une seringue de 1 mL, en veillant à éviter les trous d’air ou les bulles dans l’embout de la seringue. Chargez la seringue sur un côté de la cartouche, à côté du bloc rotatif.
   2. Remplissez une seringue de 1 mL avec la solution de mélange T704 et sPep (étape 4). Enlevez les bulles ou les espaces d’air à l’extrémité de la seringue et placez la seringue dans l’autre entrée de la pompe (voir le tableau des matériaux).
   3. Réglez la pompe avec un rapport de débit de 1:1 et un débit total de 4-10 mL/min.
      REMARQUE : Un débit total de 6 mL/min est optimal dans les études présentées ici.
   4. Placer un tube conique sans RNase de 10 mL (voir le tableau des matériaux) pour recueillir la solution mixte IVT-ARNm/PP-sNp à la fin du trajet d’écoulement du dispositif de mélange.
   5. Faites fonctionner la pompe pour démarrer le mélange, en vous assurant que les paramètres sont entrés correctement. Une fois que la pompe a fini de fonctionner pendant 6 s, prélever l’échantillon IVT-mRNA/PP-sNp du tube conique.
      REMARQUE : Les PP-sNp ont été générés à l’aide d’un mélangeur microfluidique (figure supplémentaire 1). Le dispositif comprend une pompe à débit constant, un dispositif de liaison, une puce et un dispositif fixe. Dans le processus de mélange, la pompe à débit constant connectée à la puce fournit du liquide à la puce en fonction du débit prédéfini. La pompe à débit constant connectée peut être connectée à plusieurs canaux d’entrée de la puce avec un seul canal de sortie. Les composants de l’appareil, y compris la puce, ont été obtenus de sources commerciales et assemblés rationnellement (voir le tableau des matériaux). Les paramètres, tels que le débit et le volume de la solution d’ARNm IVT et de la solution mixte T704-sPep, peuvent différer de ceux affichés dans le protocole actuel si une configuration différente est utilisée et doivent être optimisés en conséquence.

3. Mesure du diamètre hydrodynamique et de la polydispersité de l’IVT-ARNm/PP-sNp

1. Diluer une partie aliquote de la solution IVT d’ARNm/PP-sNp (étape 2) avec de l’eau NF pour obtenir un volume final de 1 mL.
2. Mesurer la taille hydrodynamique et l’indice de polydispersité (PDI) à l’aide d’une semi-micro cuvette²⁵. Ajouter la solution IVT d’ARNm/PP-sNp dans la cuvette et la placer dans le compteur granulométrique (voir Tableau des matériaux). Configurez une procédure opérationnelle standard et cliquez sur Démarrer pour commencer l’acquisition des données.

4. Préparation des cellules pour la transfection

1. Plaquer des cellules épithéliales bronchiques humaines (16HBE) et une lignée cellulaire dendritique (DC2.4) dans des plaques de 96 puits à une densité de 3,5 x 10⁴ cellules/puits 24 h avant la transfection. Cultiver les cellules dans un milieu de culture additionné de 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et de 1 % de pénicilline/streptomycine.
   REMARQUE : Les cellules ont été obtenues d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).
2. Incuber les cellules dans un incubateur (atmosphère de 37 °C et 5% de CO₂ ) pendant 24 h pour s’assurer que les cellules sont confluentes à 60%-80% avant la transfection.

5. Transfection des cellules cultivées

1. Après avoir retiré le milieu de croissance, laver les cellules plaquées avec 0,2 mL/puits 1x PBS.
2. Ajouter 170 μL de milieu de culture sans sérum à chaque puits contenant les cultures cellulaires plaquées.
3. Ajouter goutte à goutte la formulation IVT ARNm/PP-sNp contenant 0,4 μg d’ARNm MetLuc (préparée à l’étape 2) avec une quantité de 30 μL/puits.
4. Incuber les cellules avec la formulation IVT mRNA/PP-sNp à 37 °C dans une atmosphère humidifiée enrichie en CO₂ à 5% pendant 4 h.
5. Remplacer le milieu de transfection par 0,2 mL de milieu de culture frais additionné de 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et de 1 % (v/v) de pénicilline/streptomycine.
   NOTE: Le sérum bovin fœtal a été chauffé à 56 °C pendant 30 minutes pour inactivation.
6. Incuber les cellules transfectées à 37 °C et dans une atmosphère enrichie en CO₂ à 5% pendant 24 h et recueillir les surnageants à détecter dans chaque puits.

6. Analyse de l’efficacité de la transfection cellulaire à l’aide du test Metridia luciferase (MetLuc)

1. Doser le surnageant de chaque puits pour déterminer l’activité de MetLuc à l’aide d’un substrat de coelentérazine (voir le tableau des matériaux) en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Préparer une solution de dosage fraîche en ajoutant 1x PBS au substrat de la coelentérazine (la concentration de coelenterazine est de 15 mM).
   2. Vortex la solution de coelentérazine pendant 10 s pour un mélange complet.
   3. Ajouter 50 μL de surnageant (recueilli à l’étape 5) dans une plaque de 96 puits.
   4. Installez le lecteur de microplaques (voir le tableau des matériaux) avec un temps de lecture de 1 000 ms avant d’ajouter 30 μL de solution de coelentérazine (15 mM) à chaque puits manuellement ou par injection automatisée.
   5. Cliquez sur Démarrer pour mesurer le signal de luminescence immédiatement après l’ajout de la solution de coelentérazine au surnageant.
      REMARQUE: Le signal de luminescence est mesuré à l’aide d’un lecteur de microplaques et son activité est exprimée en unités lumineuses relatives. Les valeurs obtenues à partir de puits transfectés par PBS seront utilisées comme témoins blancs.

Résultats

Le plasmide recombinant a été digéré pour produire la matrice d’ADN linéarisée (Figure 2A). En utilisant le protocole décrit, le kit de transcription in vitro T7 peut produire jusqu’à 80-120 μg d’ARNm MetLuc non coiffé par réaction de 20 μL et 50-60 μg d’ARNm MetLuc-coiffé par réaction de 100 μL. Lorsqu’il est analysé par électrophorèse, l’ARNm MetLuc intact de haute qualité doit présenter une bande unique et claire, comme le montre

Discussion

Le protocole décrit ici permet non seulement la production rentable et rapide de formulations de vaccins à ARNm IVT avec des propriétés définies, mais il offre également la possibilité de personnaliser la formulation PP-sNp en fonction d’objectifs thérapeutiques spécifiques, tels que la thérapie génique. Afin d’assurer la génération réussie de l’ARNm IVT / PP-sNp, il est suggéré de porter une attention particulière à certaines étapes critiques. Lorsque vous travaillez avec l’ARNm, rappelez-vous...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI	Takara	1010
cap 1 capping system	Jinan	M082
Dendritic cell-line	Sigma	SCC142
DNA sequence	Genescript
Human bronchial epithelial cells	Sigma	SCC150
KpnI	Takara	1068
LP	Beyotime	C0533
Lithium chloride	APEXBio	B6083
Malvern Zetasizer Nano ZS90	Malvern	NB007605
Microfluidic chip	ZHONGXINQIHENG	Standard PDMS chip
Microplate readers	ThermoFisher	Varioskan lux
NanoDrop One	ThermoFisher	ND-ONE-W (A30221)
Nuclease-free water	ThermoFisher	AM9932
OptiMEM	Gibco	31985070
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Pseudouridine	APE×Bio	B7972
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Quanti-Luc	InvivoGen	Rep-qlc2
RiboRuler High Range RNA Ladder	ThermoFisher	SM1821
RNase-free conical tube	Biosharp	BS-100-M
RPMI Medium 1640	ThermoFisher	C11875500BT
Syringe pump	Chemyx	Fusion 101
T7 transcription Kit	Jinan	E131