Transfección eficiente del ARNm transcrito in vitro en células cultivadas utilizando nanopartículas de péptido-poloxamina

Resumen

Se desarrolla una nanopartícula de péptido-poloxamina autoensamblada (PP-sNp) utilizando un dispositivo de mezcla microfluídica para encapsular y entregar ARN mensajero transcrito in vitro . El ARNm/PP-sNp descrito podría transfectar eficientemente células cultivadas in vitro.

Resumen

Las vacunas de ARN mensajero transcritas in vitro (ARNm) han mostrado un enorme potencial en la lucha contra la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). Los sistemas de administración eficientes y seguros deben incluirse en las vacunas de ARNm debido a las frágiles propiedades del ARNm. Un sistema de administración de genes de nanopartículas de péptido-poloxamina autoensamblado (PP-sNp) está diseñado específicamente para la administración pulmonar de ácidos nucleicos y muestra capacidades prometedoras para mediar la transfección exitosa de ARNm. Aquí, se describe un método mejorado para preparar PP-sNp para explicar cómo el PP-sNp encapsula el ARNm de Metridia luciferase (MetLuc) y transfecta con éxito las células cultivadas. El ARNm de MetLuc se obtiene mediante un proceso de transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN lineal. Un PP-sNp se produce mezclando péptido sintético / poloxamina con solución de ARNm utilizando un mezclador microfluídico, lo que permite el autoensamblaje de PP-sNp. La carga de PP-sNp se evalúa posteriormente midiendo el potencial zeta. Mientras tanto, la polidispersidad y el tamaño hidrodinámico de las nanopartículas de PP-sNp se miden utilizando dispersión dinámica de luz. Las nanopartículas de ARNm/PP-sNp se transfieren en células cultivadas, y los sobrenadantes del cultivo celular se analizan para determinar la actividad de la luciferasa. Los resultados representativos demuestran su capacidad de transfección in vitro. Este protocolo puede arrojar luz sobre el desarrollo de sistemas de administración de vacunas de ARNm de próxima generación.

Introducción

La vacunación ha sido anunciada como una de las intervenciones médicas más eficientes para reducir la morbilidad y mortalidad causadas por enfermedades infecciosas¹. La importancia de las vacunas se ha demostrado desde el brote de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). A diferencia del concepto tradicional de inyectar patógenos inactivados o vivos atenuados, los enfoques de vacunas de última generación, como las vacunas basadas en ácidos nucleicos, se concentran en preservar las propiedades inmunoestimulantes de los patógenos objetivo al tiempo que evitan los posibles problemas de seguridad asociados con el virus microbiano completo convencional o en las vacunas basadas en bacterias. Tanto las vacunas basadas en ADN como en ARN (es decir, ARN mensajero transcrito in vitro, ARNm IVT) exhiben potencial profiláctico a terapéutico contra una variedad de enfermedades, incluidas las enfermedades infecciosas y los cánceres ^2,3. En principio, el potencial de las vacunas basadas en ácidos nucleicos se relaciona con su producción, eficacia y seguridad⁴. Estas vacunas se pueden fabricar de manera libre de células para permitir una producción rentable, escalable y rápida.

Una sola vacuna basada en ácidos nucleicos puede codificar múltiples antígenos, permitiendo el objetivo de numerosas variantes virales o bacterias con un número reducido de inoculaciones y fortaleciendo la respuesta inmune contra patógenos resilientes ^5,6. Además, las vacunas basadas en ácidos nucleicos podrían imitar el proceso de invasión natural de la infección bacteriana o de virus, trayendo respuestas inmunes mediadas por células B y células T. A diferencia de algunas vacunas basadas en virus o en ADN, las vacunas basadas en ARNm IVT ofrecen una gran ventaja en términos de seguridad. Pueden expresar rápidamente el antígeno deseado en el citosol y no están integrados en el genoma del huésped, evitando las preocupaciones sobre la mutagénesis de inserción⁷. El ARNm de IVT se degrada automáticamente después de una traducción exitosa, por lo que su cinética de expresión de proteínas se puede controlar fácilmente ^8,9. Catalizados por la pandemia del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), los esfuerzos de empresas / instituciones de todo el mundo han permitido el lanzamiento al mercado de muchos tipos de vacunas. La tecnología de vacunas basada en ARNm IVT muestra un gran potencial y, por primera vez, ha demostrado su éxito previamente anticipado, debido a su diseño rápido y capacidad flexible para adaptarse a cualquier antígeno objetivo en varios meses. El éxito de las vacunas de ARNm IVT contra COVID-19 en aplicaciones clínicas no solo abrió una nueva era de investigación y desarrollo de vacunas de ARNm IVT, sino que también acumuló una valiosa experiencia para el rápido desarrollo de vacunas efectivas para tratar brotes de enfermedades infecciosas^10,11.

A pesar del potencial prometedor de las vacunas de ARNm IVT, la entrega intracelular eficiente de ARNm IVT al sitio de acción (es decir, citoplasma) continúa planteando un obstáculo importante¹², especialmente para aquellos administrados a través de las vías respiratorias⁴. El ARNm de IVT es inherentemente una molécula inestable con una vida media extremadamente corta (~ 7 h)¹³, lo que hace que el ARNm de IVT sea altamente propenso a la degradación por la ubicua RNasa¹⁴. Los linfocitos del sistema inmune innato tienden a engullir el ARNm IVT reconocido en casos de aplicación in vivo . Además, la alta densidad de carga negativa y el gran peso molecular (1 x 10^4-1 x 10⁶ Da) del ARNm de IVT perjudican su permeación efectiva a través de la bicapa lipídica aniónica de las membranas celulares¹⁵. Por lo tanto, se requiere un sistema de administración con ciertos materiales biofuncionales para inhibir la degradación de las moléculas de ARNm de IVT y facilitar la absorción celular¹⁶.

Aparte de algunos casos excepcionales en los que el ARNm de la IVT desnuda fue utilizado directamente para investigaciones in vivo, se utilizan varios sistemas de administración para llevar el ARNm de la IVT al sitio terapéutico de acción^17,18. Estudios previos han revelado que sólo unos pocos ARNm IVT son detectados en el citosol sin la ayuda de un sistema de administración¹⁹. Se han desarrollado numerosas estrategias para mejorar la entrega de ARN con esfuerzos continuos en el campo, que van desde la condensación de protamina hasta la encapsulación lipídica²⁰. Las nanopartículas lipídicas (PNL) son las más avanzadas clínicamente entre los vehículos de administración de ARNm, como lo demuestra el hecho de que todas las vacunas COVID-19 de ARNm aprobadas para uso clínico emplean sistemas de administración basados en PNL²¹. Sin embargo, los LNP no pueden mediar la transfección efectiva del ARNm cuando las formulaciones se administran por vía respiratoria²², lo que limita notablemente la aplicación de estas formulaciones para inducir respuestas inmunes de la mucosa o abordar enfermedades relacionadas con la pulmón, como la fibrosis quística o la deficiencia de α1-antitripsina. Por lo tanto, se requiere desarrollar un nuevo sistema de administración para facilitar la administración y transfección eficientes del ARNm de IVT en células relacionadas con las vías respiratorias para resolver esta necesidad no satisfecha.

Se ha confirmado que el sistema de entrega de nanopartículas autoensambladas de péptido-poloxamina (PP-sNp) puede mediar la transfección eficiente de ácidos nucleicos en el tracto respiratorio de ratones²³. El PP-sNp adopta un enfoque de diseño modular multifuncional, que puede integrar diferentes módulos funcionales en las nanopartículas para una rápida detección y optimización²³. Los péptidos sintéticos y los copolímeros de bloque anfifílico eléctricamente neutros (poloxamina) dentro del PP-sNp pueden interactuar espontáneamente con el ARNm de IVT para generar nanopartículas distribuidas uniformemente con una estructura compacta y superficie lisa²³. PP-sNp puede mejorar el efecto de transfección génica de las moléculas de ARNm de IVT en células cultivadas y el tracto respiratorio de ratones²³. El presente estudio describe un protocolo para generar PP-sNp que contiene ARNm IVT que codifica Metridia luciferasa (MetLuc-mRNA) (Figura 1). En este protocolo se utiliza una mezcla controlada y rápida a través de un dispositivo de mezcla microfluídica, que emplea el diseño de mezcla escalonada en espiga. El procedimiento es fácil de ejecutar y permite la generación de PP-sNp con tamaños más uniformes. El objetivo general de la producción de PP-sNp utilizando el mezclador microfluídico es crear PP-sNp para la complejación de ARNm de una manera bien controlada, permitiendo así una transfección celular eficiente y reproducible in vitro. El presente protocolo describe la preparación, ensamblaje y caracterización de PP-sNp que contiene MetLuc-mRNA.

Protocolo

1. Transcripción in vitro de ARNm modificado químicamente

NOTA: Se requiere el uso de tubos libres de nucleasa, reactivos, cristalería, puntas de pipeta, etc., porque las RNasas son omnipresentes en el medio ambiente, como soluciones de laboratorio, superficies de instrumentos, cabello, piel, polvo, etc. Limpie bien las superficies y pipetas del banco antes de usarlas, y use guantes para evitar la contaminación por RNasa.

1. Realizar la linealización de la plantilla de ADN.
   1. Sintetizar el marco de lectura abierto (ORF) de Metridia luciferasa (MetLuc) flanqueado por un promotor de polimerasa T7, colas de región no traducida (UTR) 5' (UTR), 3'UTR y poli (A) y clonarlo en el vector PUC57, que se expresa en bacterias (ver Tabla de materiales).
      NOTA: La secuencia de codificación de la plantilla de ADN se proporciona en el Archivo complementario 1.
   2. Cultive bacterias, lisar las bacterias y purificar el ADN plásmido por la columna correspondiente (consulte el kit de extracción de ADN plásmido en la Tabla de materiales).
   3. Realice una sola reacción de 50 μL que contenga 2 μL de BamHI, 2 μL de KpnI (consulte la Tabla de materiales) y 2 μg de ADN plásmido a 37 °C durante 1 h, y logre la linealización de la plantilla de ADN.
2. Realizar la transcripción in vitro para generar ARNm IVT sin tapa.
   1. Realizar la síntesis de ARNm mediante una sola reacción de 20 μL utilizando un kit de transcripción T7 y pseudouridina (ver Tabla de materiales): 10 μL (0.8-1 μg) de plantilla de ADN linealizado, 1.5 μL (150 mM) de ATP, pseudo-UTP, GTP y CTP, 2 μL de tampón de transcripción 10x, 1 μL de enzima T7 y 1 μL de agua libre de nucleasas (NF-agua). Mezclar bien los componentes mencionados anteriormente e incubar a 37 °C durante 3 h.
3. Quite el ADN de la plantilla.
   1. Añadir 1 μL (1 U) de DNasa (libre de RNasa) después del proceso de transcripción e incubar a 37 °C durante 15 min.
4. Realice la purificación de ARNm IVT sin tapa utilizando precipitación de cloruro de litio.
   1. Purificar el ARNm IVT sin tapa usando cloruro de litio (ver Tabla de materiales) con una concentración de trabajo de 10 mM. Añadir 50 μL de cloruro de litio de 10 mM a 20 μL de solución de ARNm IVT sin tapa.
   2. Mezclar bien todo el volumen y enfriar a -20 °C durante 1 h. Recoja el ARNm de IVT sin tapa durante 12 minutos a 12,000 x g, lo que produce rutinariamente 80-120 μg de ARNm de IVT sin tapa de cada reacción individual de 20 μL.
5. Realizar el tapado de ARNm IVT.
   1. Realice el tapado de ARNm IVT utilizando el sistema de taponado cap 1 (consulte la Tabla de materiales). Brevemente, retire la estructura secundaria de 50 μg de ARNm IVT sin tapa calentando a 65 °C durante 10 min, luego vincule el extremo 5' del ARNm IVT sin tapa con la tapa 1, que se prepara modificando la estructura de la tapa m7G utilizando 2.5 μL de s-adenosilmetionina (SAM) (20 mM) y 4 μL de 2'-O-metiltransferasa (100 U) en una reacción de 100 μL a 37 °C durante 30-60 min.
   2. Purificar 100 μL del ARNm IVT tapado usando 250 μL de cloruro de litio 10 mM y diluir en 50 μL de agua NF.
6. Determinar la pureza y el tamaño molecular del ARNm de IVT tapado.
   1. Mida la concentración de ARNm de IVT tapado con un espectrofotómetro UV-visible. Usando un marcador de ARN (consulte la Tabla de materiales), analice el tamaño molecular del ARNm de IVT tapado en un gel de agarosa desnaturalizante de formaldehído al 1% que contenga 18% de formaldehído (el voltaje es de 120 V). Asegúrese de que el ARNm de IVT sin tapa y el ARNm de IVT tapado se almacenen a -80 °C.
      NOTA: Se consideró que el ARNm IVT tenía buena pureza en una relación A 260/A₂₈₀ de 1.8-2.1 y una relación A_{260/A 230} de 2.0 o ligeramente superior.

2. Generación de ARNm/PP-sNp de la TRI

1. Preparar la solución madre de poloxamina 704 (T704) solubilizando la T704 (ver Tabla de materiales) en agua NF para obtener una solución madre de 10 mg/ml. Conservar la solución preparada a 4 °C.
   NOTA: T704 contiene una estructura en forma de X hecha de un grupo central de etilendiamina unido a cuatro cadenas de bloques de poli(óxido de propileno) (PPO) y bloques de poli(óxido de etileno) (PEO)²⁴. El peso molecular (Mw) de T704 es 5500.
2. Preparar la solución madre del péptido sintético (sPep, ver Tabla de materiales) solubilizando la sPep (secuencia: KETWWETWWTEWWWWKKKKRRRRRKKKKGACSE
   RSMNFCG) en agua NF para obtener una solución madre de 2 mg/ml y almacenar a 4 °C.
3. Preparar la solución de ARNm IVT descongelando el ARNm IVT (paso 1) en hielo y centrifugando brevemente durante 3 s a 300 x g a temperatura ambiente antes de abrir el tubo. Diluir la solución de ARNm IVT a 0,04 μg/μL con agua NF.
   NOTA: Se recomienda trabajar en un gabinete de bioseguridad siempre que sea posible con el ARNm de IVT.
4. Preparar la solución de mezcla de T704 y sPep diluyendo la solución de sPep a 0,555 μg/μL y la solución de T704 a 8 μg/μL con agua NF. Incubar la solución mezclada durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de su uso posterior.
   NOTA: Calcule el componente sPep requerido en función de la relación N/P deseada. La relación N/P es el número total de residuos de nitrógeno (N) dentro del sPep al número total de grupos fosfato (P) cargados negativamente dentro del ARNm IVT. Calcule el T704 requerido en función de la relación peso/peso (p/p) entre T704 y el ARNm de IVT. Es necesario que la relación N/P sea 5 y la relación p/p sea 100.
5. Prepare la formulación de ARNm/PP-sNp de IVT siguiendo los pasos a continuación.
   1. Extraiga la solución de ARNm IVT (paso 3) en una jeringa de 1 ml, asegurándose de que no haya espacios de aire ni burbujas en la punta de la jeringa. Cargue la jeringa en un lado del cartucho junto al bloque giratorio.
   2. Llene una jeringa de 1 ml con la solución de mezcla T704 y sPep (paso 4). Retire cualquier burbuja o espacio de aire en la punta de la jeringa y coloque la jeringa en la otra entrada de la bomba (consulte la Tabla de materiales).
   3. Ajuste la bomba con una relación de flujo de 1:1 y un caudal total de 4-10 mL/min.
      NOTA: Un caudal total de 6 mL/min es óptimo en los estudios aquí presentados.
   4. Coloque un tubo cónico libre de RNasa de 10 ml (consulte la Tabla de materiales) para recolectar la solución mixta IVT-mRNA/PP-sNp al final de la trayectoria de flujo del dispositivo mezclador.
   5. Haga funcionar la bomba para iniciar la mezcla, asegurándose de que los parámetros se ingresen correctamente. Después de que la bomba haya terminado de funcionar durante 6 s, recoja la muestra IVT-mRNA/PP-sNp del tubo cónico.
      NOTA: El PP-sNp se generó utilizando un mezclador microfluídico (Figura complementaria 1). El dispositivo comprende una bomba de flujo constante, un dispositivo de enlace, un chip y un dispositivo fijo. En el proceso de mezcla, la bomba de flujo constante conectada al chip suministra líquido al chip de acuerdo con el caudal preestablecido. La bomba de flujo constante conectada se puede conectar a múltiples canales de entrada del chip con un solo canal de salida. Los componentes del dispositivo, incluido el chip, se obtuvieron de fuentes comerciales y se ensamblaron racionalmente (consulte la Tabla de materiales). Los parámetros, como el caudal y el volumen de la solución de ARNm IVT y la solución mixta T704-sPep, pueden diferir de los que se muestran en el protocolo actual si se utiliza una configuración diferente y deben optimizarse en consecuencia.

3. Medición del diámetro hidrodinámico y polidispersidad de IVT-mRNA/PP-sNp

1. Diluir una alícuota de la solución IVT de ARNm/PP-sNp (paso 2) con agua NF para obtener un volumen final de 1 ml.
2. Medir el tamaño hidrodinámico y el índice de polidispersidad (PDI) utilizando una semi-micro cubeta²⁵. Agregue la solución IVT mRNA/PP-sNp en la cubeta y colóquela en el medidor de tamaño de partícula (consulte la Tabla de materiales). Configure un procedimiento operativo estándar y haga clic en Iniciar para comenzar la adquisición de datos.

4. Preparación de las células para la transfección

1. Placas de células epiteliales bronquiales humanas (16HBE) y una línea celular dendrítica (DC2.4) en placas de 96 pocillos a una densidad de 3,5 x 10⁴ células/pocillo 24 h antes de la transfección. Cultivar las células en un medio de cultivo suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor y 1% de penicilina/estreptomicina.
   NOTA: Las células se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales).
2. Incubar las células en una incubadora (37 °C y 5% de_CO2 atmósfera) durante 24 h para asegurarse de que las células son 60% -80% confluentes antes de la transfección.

5. Transfección de las células cultivadas

1. Después de retirar el medio de crecimiento, lavar las células plateadas con 0,2 ml/pocillo 1x PBS.
2. Añadir 170 μL de medio de cultivo sin suero a cada pocillo que contenga los cultivos celulares en placas.
3. Añadir la formulación IVT mRNA/PP-sNp que contenga 0,4 μg de mRNA MetLuc (preparado en el paso 2) gota a gota con una cantidad de 30 μL/pocillo.
4. Incubar las células con la formulación IVT mRNA/PP-sNp a 37 °C en una atmósfera humidificada enriquecida con CO₂ al 5% durante 4 h.
5. Reemplace el medio de transfección con 0,2 ml de medio de cultivo fresco suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10% y penicilina/estreptomicina al 1% (v/v).
   NOTA: El suero fetal bovino se calentó a 56 °C durante 30 min para la inactivación.
6. Incubar las células transfectadas a 37 °C y en una atmósfera enriquecida con_CO2 al 5% durante 24 h y recoger los sobrenadantes que se detectarán en cada pocillo.

6. Análisis de la eficacia de la transfección celular mediante el ensayo de Metridia luciferasa (MetLuc)

1. Analizar el sobrenadante de cada pocillo para detectar la actividad de MetLuc utilizando sustrato de celenterazina (ver Tabla de materiales) siguiendo los pasos a continuación.
   1. Preparar una solución de ensayo fresca añadiendo 1x PBS al sustrato de celenterazina (la concentración de celenterazina es de 15 mM).
   2. Vortex la solución de celenterazina durante 10 s para mezclar bien.
   3. Añadir 50 μL de sobrenadante (recogido en el paso 5) a una placa de 96 pocillos.
   4. Configure el lector de microplacas (consulte la Tabla de materiales) con un tiempo de lectura de 1.000 ms antes de agregar 30 μL de solución de celenterazina (15 mM) a cada pocillo manualmente o mediante inyección automatizada.
   5. Haga clic en Inicio para medir la señal de luminiscencia inmediatamente después de agregar la solución de celenterazina al sobrenadante.
      NOTA: La señal de luminiscencia se mide utilizando un lector de microplacas, y su actividad se expresa en unidades de luz relativa. Los valores obtenidos de los pozos transfectados por PBS se utilizarán como controles en blanco.

Resultados

El plásmido recombinante fue digerido para producir la plantilla de ADN linealizado (Figura 2A). Utilizando el protocolo descrito, el kit de transcripción in vitro T7 puede producir hasta 80-120 μg de ARNm MetLuc sin tapa por reacción de 20 μL y 50-60 μg de ARNm de MetLuc tapado por reacción de 100 μL. Cuando se analiza con electroforesis, el ARNm de MetLuc intacto con alta calidad debe mostrar una banda única y clara, como se muestra en la Figura 2B

Discusión

El protocolo descrito aquí no solo permite la producción rentable y rápida de formulaciones de vacunas de ARNm IVT con propiedades definidas, sino que también ofrece la posibilidad de personalizar la formulación de PP-sNp de acuerdo con fines terapéuticos específicos, como la terapia génica. Con el fin de garantizar la generación exitosa de ARNm / PP-sNp IVT, se sugiere prestar especial atención a algunos pasos críticos. Cuando trabaje con ARNm, recuerde siempre que las condiciones libres de RNasa deben manten...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BamHI	Takara	1010
cap 1 capping system	Jinan	M082
Dendritic cell-line	Sigma	SCC142
DNA sequence	Genescript
Human bronchial epithelial cells	Sigma	SCC150
KpnI	Takara	1068
LP	Beyotime	C0533
Lithium chloride	APEXBio	B6083
Malvern Zetasizer Nano ZS90	Malvern	NB007605
Microfluidic chip	ZHONGXINQIHENG	Standard PDMS chip
Microplate readers	ThermoFisher	Varioskan lux
NanoDrop One	ThermoFisher	ND-ONE-W (A30221)
Nuclease-free water	ThermoFisher	AM9932
OptiMEM	Gibco	31985070
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Pseudouridine	APE×Bio	B7972
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Quanti-Luc	InvivoGen	Rep-qlc2
RiboRuler High Range RNA Ladder	ThermoFisher	SM1821
RNase-free conical tube	Biosharp	BS-100-M
RPMI Medium 1640	ThermoFisher	C11875500BT
Syringe pump	Chemyx	Fusion 101
T7 transcription Kit	Jinan	E131