Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول منهجيات إنشاء عضويات ظهارية بطانة الرحم للفأر للتعبير الجيني والتحليلات النسيجية.

Abstract

تبطن أنسجة بطانة الرحم التجويف الداخلي للرحم وتخضع للسيطرة الدورية للإستروجين والبروجستيرون. وهو نسيج يتكون من ظهارة لمعية وغدية ، ومقصورة انسجة ، وشبكة أوعية دموية ، ومجموعة معقدة من الخلايا المناعية. كانت نماذج الفئران أداة قوية لدراسة بطانة الرحم ، وكشفت عن الآليات الحاسمة التي تتحكم في الزرع والمشيمة والسرطان. يقدم التطور الأخير للثقافات العضوية البطانية 3D نموذجا حديثا لتشريح مسارات الإشارات التي تكمن وراء بيولوجيا بطانة الرحم. يعد إنشاء عضويات بطانة الرحم من نماذج الفئران المعدلة وراثيا ، وتحليل نسخها ، وتصور مورفولوجيتها بدقة خلية واحدة أدوات حاسمة لدراسة أمراض بطانة الرحم. تحدد هذه الورقة طرق إنشاء ثقافات 3D لظهارة بطانة الرحم من الفئران وتصف تقنيات لتحديد التعبير الجيني وتحليل أنسجة الكائنات العضوية. الهدف هو توفير مورد يمكن استخدامه لإنشاء وزراعة ودراسة التعبير الجيني والخصائص المورفولوجية للعضويات الظهارية البطانية.

Introduction

بطانة الرحم - النسيج المخاطي المبطن الداخلي لتجويف الرحم - هي نسيج فريد وديناميكي للغاية يلعب أدوارا حاسمة في الصحة الإنجابية للمرأة. خلال العمر الإنجابي ، يحمل بطانة الرحم القدرة على الخضوع لمئات الدورات من الانتشار والتمايز والانهيار ، بتنسيق من العمل المتضافر لهرمونات المبيض - الاستروجين والبروجستيرون. كشفت الدراسات التي أجريت على الفئران المعدلة وراثيا عن آليات بيولوجية أساسية تدعم استجابة بطانة الرحم للهرمونات والتحكم في زرع الجنين ، ونزع الخلايا اللحمية ، والحمل1. ومع ذلك ، كانت الدراسات في المختبر محدودة بسبب الصعوبات في الحفاظ على أنسجة بطانة الرحم الأولية غير المحولة للفأر في مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية2،3. تقدم التطورات الحديثة في ثقافة أنسجة بطانة الرحم كأنظمة أعضاء 3D ، أو عضويات ، فرصة جديدة للتحقيق في المسارات البيولوجية التي تتحكم في تجديد خلايا بطانة الرحم والتمايز. تم تطوير أنظمة عضوية بطانة الرحم للفأر والإنسان من ظهارة بطانة الرحم النقية المغلفة في مصفوفات مختلفة4،5 ، في حين تم استزراع بطانة الرحم البشرية كمزارع ظهارية / انسجة خالية من السقالات6،7 ، ومؤخرا كمجموعات ظهارية / انسجة مغلفة بالكولاجين8 . يتم دعم النمو والإمكانات التجديدية للثقافات العضوية الظهارية من خلال مزيج محدد من عوامل النمو ومثبطات الجزيئات الصغيرة التي تم تحديدها تجريبيا لزيادة نمو وتجديد المواد العضوية4،5،9. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على تجميد وإذابة عضويات بطانة الرحم تسمح بتخزين عضويات بطانة الرحم على المدى الطويل من الفئران والبشر للدراسات المستقبلية.

كشفت الفئران المعدلة وراثيا عن مسارات الإشارات المعقدة التي تتحكم في الحمل المبكر وإزالة الترسبات ، وقد تم استخدامها كنماذج لفقدان الحمل وسرطان بطانة الرحم وبطانة الرحم. تم تحقيق هذه الدراسات الجينية إلى حد كبير مع حذف خاص بالخلية للأليلات الجانبية loxP ("floxed") باستخدام cre recombinases التي تنشط بشكل خاص في الأنسجة التناسلية الأنثوية. تتضمن نماذج الفئران هذه مستقبلات البروجسترون10 المستخدمة على نطاق واسع ، والتي لها نشاط إعادة اتحاد قوي في الأنسجة الظهارية واللحمية البطانية ، اللاكتوفيرين i-cre ، الذي يحفز إعادة التركيب الظهاري البطاني الرحمي في الفئران البالغة11 ، أو Wnt7a-cre ، مما يؤدي إلى حذف خاص بالظهارة في الأنسجة المشتقة من مولريان12 . وفرت زراعة أنسجة بطانة الرحم من نماذج الفئران المعدلة وراثيا مثل الكائنات العضوية ثلاثية الأبعاد فرصة ممتازة للتحقيق في بيولوجيا بطانة الرحم وتسهيل تحديد عوامل النمو ومسارات الإشارات التي تتحكم في تجديد خلايا بطانة الرحم والتمايز13,14. يتم وصف طرق عزل وثقافة أنسجة بطانة الرحم للفأر في الأدبيات والإبلاغ عن استخدام استراتيجيات إنزيمية مختلفة لعزل ظهارة الرحم للزراعة اللاحقة للعضويات الظهارية البطانية4. بينما توفر الأدبيات السابقة إطارا نقديا لبروتوكولات الثقافة العضوية الظهارية البطانية4،5،6 ، توفر هذه الورقة طريقة واضحة وشاملة لتوليد هذه الكائنات العضوية وصيانتها ومعالجتها وتحليلها. توحيد هذه التقنيات مهم لتسريع التقدم في مجال البيولوجيا الإنجابية للمرأة. هنا ، نبلغ عن منهجية مفصلة للتنقية الأنزيمية والميكانيكية للأنسجة الظهارية البطانية للفأر للثقافة اللاحقة من عضويات بطانة الرحم في سقالة مصفوفة هلام. كما نصف منهجيات التحليلات النسيجية والجزيئية النهائية للعضويات الظهارية بطانة الرحم المغلفة بمصفوفة الهلام.

Protocol

تم إجراء التعامل مع الفئران والدراسات التجريبية بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لكلية بايلور للطب والمبادئ التوجيهية التي وضعها دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر.

1. عزل ظهارة الرحم من الفئران باستخدام الطرق الأنزيمية والميكانيكية

ملاحظة: يصف هذا القسم الخطوات المطلوبة لإنشاء عضويات بطانة الرحم الظهارية ومرورها وتجميدها وإذابتها من الفئران باستخدام سقالة مصفوفة هلامية. وقد حددت الدراسات السابقة أن الثقافات المثلى من عضويات بطانة الرحم الفئران يتم تأسيسها من الفئران خلال مرحلة شبق4 ، والتي يمكن تحديدها عن طريق الفحص الخلوي لمسحة المهبل15. تم استخدام إناث الفئران WT البالغة (6-8 أسابيع ، الهجين C57BL / 6J و 129S5 / SvEvBrd) لجميع التجارب. تم القتل الرحيم للفئران بشكل إنساني وفقا للإرشادات المعتمدة من IACUC باستخدام التخدير الأيزوفلوران متبوعا بتفكيك عنق الرحم. بمجرد القتل الرحيم للفئران ، يجب اتباع الخطوات التالية. راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بالمواد والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

  1. اترك مصفوفة الجل تذوب على الثلج لمدة 1-2 ساعة تقريبا قبل الاستخدام.
  2. لتشريح الفأر ، استخدم المقص لعمل شق في منتصف خط البطن وقشر الجلد برفق لكشف الطبقة البريتونية الأساسية. استخدم الملقط لتثبيت الطبقة البريتونية وقم بعمل شقوق جانبية بالمقص لكشف محتويات البطن.
    1. حدد موقع قرون الرحم عن طريق تحريك ضمادات الدهون في البطن جانبا برفق. قم بتشريحها عن طريق إمساكها أولا عند تقاطع عنق الرحم واستخدام المقص لقطع الدهون المساريقية على طول. بعد تشريح رحم الفأر ، قم بإزالة الأنسجة الدهنية تماما من قرن الرحم بمقص صغير.
      ملاحظة: الحفاظ على العقم أثناء عزل الخلية عن طريق تعقيم جميع أدوات الجراحة قبل الاستخدام ، ورش بطن الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وتنفيذ جميع الخطوات التالية للتشريح تحت غطاء زراعة الأنسجة المعقمة.
  3. قطع كل قرن الرحم إلى أجزاء صغيرة ، كل قياس حوالي 4-5 ملم.
  4. ضع جميع شظايا الرحم من رحم واحد في بئر واحد من صفيحة مكونة من 24 بئرا تحتوي على 0.5 مل من 1٪ تربسين. اسمح للمحلول الأنزيمي بدخول تجويف الرحم ، مما تسبب في فصل إنزيمي لظهارة بطانة الرحم عن السدى الأساسي.
  5. احتضان اللوحة المكونة من 24 بئرا في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة تقريبا.
  6. بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة ، انقل شظايا الرحم إلى صفيحة زراعة الأنسجة مقاس 35 مم تحتوي على 1 مل من محلول دولبيكو المخزن بالفوسفات (DPBS).
  7. تحت مجهر التشريح ، استخدم ملقط دقيق وماصة 1 مل لفصل ظهارة الرحم ميكانيكيا عن أنبوب الرحم. أثناء الضغط باستمرار على أحد طرفي جزء الرحم بالملقط ، مرر طرف الماصة برفق طوليا عبر الجزء ، مع الضغط على الظهارة من الطرف الآخر من أنبوب الرحم. مراقبة الأوراق الظهارية المنفصلة من جزء الرحم تحت مجهر التشريح.
  8. استخدم ماصة سعة 1 مل لجمع الصفائح الظهارية ونقلها برفق إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
  9. كرر العملية لشظايا الرحم المتبقية ، ونقل جميع الأوراق الظهارية إلى نفس أنبوب التجميع.
  10. بيليه الأوراق الظهارية المنفصلة عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 375 × غرام.
  11. قم بإزالة المادة الطافية بعناية لتجنب إزعاج حبيبات الخلية.
  12. أعد تعليق حبيبات الخلية في 0.5 مل من 2.5 مجم / مل كولاجيناز + 2 مجم / مل محلول DNase. ماصة لأعلى ولأسفل حوالي 10 أضعاف ، أو حتى يتم تحقيق تعليق أحادي الخلية.
  13. أضف 0.5 مل من DMEM / F12 + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) + مضادات حيوية ، وقم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 375 × جم.
    ملاحظة: للحصول على معلومات إضافية حول المضادات الحيوية واسعة الطيف المستخدمة في زراعة الخلايا ، راجع جدول المواد.
  14. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من DMEM / F12 + 10٪ FBS + المضادات الحيوية. أجهزة الطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 375 × جم.

2. تجهيز المقصورة اللحمية

ملاحظة: يوضح هذا القسم البروتوكولات اللازمة لعزل المقصورة اللحمية في بطانة الرحم للفأر. نظرا للاهتمام المتزايد بتجارب الاستزراع المشترك الظهاري / اللحمي ، من المهم أن تكون قادرا على معالجة مجموعات الخلايا اللحمية بالإضافة إلى الخلايا الظهارية التي ستولد الكائنات العضوية.

  1. بمجرد فصل كل الظهارة إنزيميا وميكانيكيا عن شظايا الرحم ، فإن الهياكل المتبقية الشبيهة بالأنبوب هي مقصورات "اللحمية / عضل الرحم". اجمع هذا النسيج في كولاجيناز 2.5 ملغم/مل + 2 ملغم/مل DNase في محلول HBSS.
  2. احتضان عينة اللحمية / عضل الرحم على شاكر 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. بعد الحضانة ، أضف 500 ميكرولتر من DMEM / F12 + 10٪ FBS + المضادات الحيوية لكل فأر ، وقم بتصفية الأجزاء غير المنفصلة من خلال مرشح خلية 40 ميكرومتر.
  4. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 375 × غرام.
  5. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من DMEM / F12 + 10٪ FBS + المضادات الحيوية. أضف الخليط بالتنقيط إلى 10 مل من DMEM / F12 + 10٪ FBS + المضادات الحيوية في طبق زراعة خلايا 10 سم. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة.
  6. لتوليد ثقافات مشتركة للخلايا الظهارية واللحمية البطانية للفأر ، اتبع الطرق الموضحة لعضويات بطانة الرحم البشرية باستخدام أنظمة مصفوفة خالية من السقالات أو الكولاجين 6,8.
    ملاحظة: في حين أن هذه التقنيات لم يتم نشرها بعد للفئران ، إلا أنه يمكن تكييفها بناء على البروتوكولات المنشورة مع بطانة الرحم البشرية.

3. تغليف ظهارة الرحم في مصفوفة هلام لإنشاء المواد العضوية

ملاحظة: احتفظ بمصفوفة الجل على الثلج حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

  1. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في حجم مصفوفة هلام يبلغ 20 ضعفا من حبيبات الخلية (على سبيل المثال ، إذا كانت حبيبات الخلية 20 ميكرولتر ، فأعد تعليق الخلايا ب 400 ميكرولتر من مصفوفة الهلام). أعد تعليق الحبيبات بعناية لتجنب إدخال الفقاعات.
  2. اسمح لمصفوفة الهلام / تعليق الخلية بالاستقرار في درجة حرارة الغرفة لمدة ~ 10 دقائق.
  3. بمجرد أن تصبح مصفوفة الهلام / تعليق الخلية هلاما شبه صلب ، استخدم ماصة دقيقة P200 بطرف عريض 200 ميكرولتر لشفط 25 ميكرولتر من مصفوفة الهلام / تعليق الخلية برفق. قم بتوزيع ثلاث قباب منفصلة سعة 25 ميكرولتر لكل بئر من لوحة مكونة من 12 بئرا ، واترك مصفوفة الهلام تعالج لمدة 15 دقيقة في حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
  4. بعد معالجة مصفوفة الهلام ، أضف 750 ميكرولتر من الوسط العضوي إلى كل بئر يحتوي على قباب مصفوفة هلامية. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة.
    ملاحظة: تمت الإشارة إلى تركيبة الوسائط العضوية في جدول المواد. تتشكل الكائنات العضوية عادة في غضون 4 أيام من الثقافة الأولية.

4. تحليل التعبير الجيني للعضويات بطانة الرحم بعد العلاج مع استراديول

ملاحظة: يصف هذا القسم الطرق المستخدمة لتحديد التعبير الجيني للعضويات الظهارية البطانية باستخدام qPCR في الوقت الفعلي بعد العلاج بالإستراديول (E2 ؛ انظر الجدول 1). نظرا لأن بطانة الرحم تخضع للتحكم الدوري لهرمون المبيض E2 ، فإن اختبار استجابة الكائنات العضوية ل E2 يعد مقياسا مهما للوظيفة الفسيولوجية. لقد حصلنا على الحمض النووي الريبي عالي الجودة وأنتجنا ما يكفي من الحمض النووي الريبوزي المرسال لتحديد التعبير الجيني باستخدام qPCR و / أو تسلسل الحمض النووي الريبي من الكائنات العضوية الظهارية البطانية. يصف هذا القسم كيفية جمع المواد العضوية ومعالجتها لتحليل التعبير الجيني. يعكس وسيط العلاج المختار الوسيط المستخدم لعلاج خلايا بطانة الرحم المزروعة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تحسين وسيلة العلاج هذه وفقا لذلك ، كما هو الحال لعلاج ثقافات بطانة الرحم البشرية 3D مع الهرمونات8،16،17.

  1. ثقافة عضويات بطانة الرحم كما هو موضح أعلاه.
  2. قم بإزالة الوسط العضوي واستبدله ب 750 ميكرولتر من وسط الجوع بعد أربعة أيام من البذر. احتضان بين عشية وضحاها.
  3. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة وسط الجوع. أضف 750 ميكرولتر من وسط المعالجة الذي يحتوي إما على مركبة أو 10 نانومتر E2. احتضان لمدة 48 ساعة.
  4. تابع عزل الحمض النووي الريبي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة للمجموعة.

5. التحليل النسيجي للعضويات بطانة الرحم

ملاحظة: يعد تصوير السمات المورفولوجية لعضويات بطانة الرحم أمرا بالغ الأهمية لتقييم التأثير الخلوي لعوامل النمو أو التلاعب الجيني أو مثبطات الجزيئات الصغيرة. يصف هذا القسم التقنيات المستخدمة لإصلاح ومعالجة وتصوير الكائنات العضوية الظهارية البطانية باستخدام البقع النسيجية وتلطيخ الأجسام المضادة المناعي.

  1. قم بإعداد أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل تحتوي على 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد في 1x PBS. ضعها على الثلج.
  2. استنشاق الوسط من آبار الصفيحة المكونة من 12 بئرا والتي تحتوي على المواد العضوية.
  3. باستخدام طرف ماصة 1 مل مع طرف مقطوع ، انقل 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر وافصل قباب مصفوفة الهلام برفق من أسفل اللوحة.
  4. قم بشفط قباب مصفوفة الهلام بالكامل برفق في طرف الماصة وانقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.
  5. ثبت المواد العضوية عن طريق وضعها على دوار عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  6. في صباح اليوم التالي ، قم بجهاز طرد مركزي للأنبوب بسرعة 600 × جم لمدة 5 دقائق لتكوير المواد العضوية. قم بإزالة محلول بارافورمالدهيد 4٪ برفق باستخدام ماصة وتخلص منه. اغسل المواد العضوية 2x بنسبة 70٪ إيثانول.
  7. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة كل الإيثانول باستثناء 50-100 ميكرولتر من الأنبوب. ضع الأنبوب جانبا.
  8. ضع أنبوبا من هلام معالجة العينات في حمام مائي وميكروويف لمدة ~ 30 ثانية لإذابة الجل. تأكد من أن هلام معالجة العينات لا يغلي من خلال مراقبة اتساق الجل.
    ملاحظة: بمجرد ذوبان هلام معالجة العينات ، ولكن ليس غليانا ساخنا ، اعمل بسرعة على تغليف المواد العضوية.
  9. نقل ما يكفي من هلام معالجة العينات لتغطية كامل سطح القالب (حوالي 250 ميكرولتر).
  10. في حين أن هلام معالجة العينات لا يزال منصهرا ، انقل بسرعة 50 ميكرولتر من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ الذي يحتوي على المواد العضوية. تأكد من أن المواد العضوية غارقة أو مدفوعة إلى الجزء السفلي من القالب.
  11. ضع قالب الأنسجة على دلو من الثلج واترك جل معالجة العينة يبرد ويتصلب.
  12. بمجرد أن يجف جل معالجة العينات تماما ، انقل بعناية مربع هلام معالجة العينات إلى كيس عينة ، مع تتبع الطائرة التي توجد بها الكائنات العضوية.
  13. ضع الكيس في كاسيت الأنسجة وقم بمعالجته باستخدام الطرق القياسية المستخدمة لتثبيت الفورمالين وتضمين البارافين للأنسجة18.
  14. بعد التثبيت والتضمين في البارافين ، قسم إلى أقسام 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم19. تابع إجراءات تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) القياسية أو تلطيخ المناعة ، كما هو موضح أدناه.

6. الهيماتوكسيلين وتلطيخ يوزين

  1. إزالة المقاطع على النحو التالي: زيلين ، 2 × 10 دقائق ؛ 100٪ إيثانول ، 2 × 3 دقائق ؛ 80٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 60٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ dH2O ، 2 × 3 دقائق ؛ 1 دقيقة في الهيماتوكسيلين. ماء الصنبور (3 × 5 ثوان) ؛ 1 دقيقة في يوزين.
  2. جفف الأقسام على النحو التالي: 60٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 80٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 95٪ إيثانول ، 3 دقائق ؛ 100٪ إيثانول ، 2 × 3 دقائق ؛ زيلين، 2 × 15 دقيقة.
  3. جبل باستخدام تصاعد المتوسطة.

7. تلطيخ المناعي

  1. قم بإزالة المقاطع كما هو موضح في الخطوة 6.1.
  2. إجراء استرجاع المستضد
    1. اغمر الشرائح في محلول استرجاع المستضد في حاوية آمنة للاستخدام في الميكروويف.
    2. ضعه في الميكروويف على نار عالية لمدة 20 دقيقة ، باستخدام فواصل زمنية مدتها 5 دقائق لضمان عدم غليان المحلول.
  3. بعد اكتمال خطوة استرجاع المستضد لمدة 20 دقيقة ، اترك الشرائح تبرد على الجليد لمدة 40 دقيقة بينما لا تزال مغمورة في المخزن المؤقت لاسترجاع المستضد.
  4. اغسل الشرائح باستخدام 1x TBST لمدة 3 دقائق
  5. منع الشرائح عن طريق احتضان في 3 ٪ BSA في TBST لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. حضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. تمييع الجسم المضاد في 3٪ BSA في TBST (1: 50-1: 1000 ، اعتمادا على Ab).
    2. احتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
    3. اغسل 3 × 5 دقائق باستخدام TBST.
  7. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
    1. تمييع الجسم المضاد في 3٪ BSA (في TBST) (1: 250) ، أو في 5٪ مصل حمار طبيعي.
    2. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام ، حيث يتم اقتران الجسم المضاد بالفلوروفور.
  8. تلطيخ نووي
    1. تمييع 4 ′ ، 6-دياميدينو -2-فينيليندول (DAPI) 1: 1,000 في TBST.
    2. احتضان لمدة 5 دقائق في RT.
    3. اغسل 2 × 5 دقائق باستخدام TBST.
  9. تصاعد
    1. استخدم قطرة واحدة من وسيط التثبيت لتركيب غطاء الغطاء.
    2. أغلق الغطاء باستخدام طلاء الأظافر في اليوم التالي.

النتائج

صور تباين المرحلة من عضويات بطانة الرحم الماوس
أنشأنا عضويات من ظهارة بطانة الرحم للفأر WT ، كما هو موضح في البروتوكول المرفق (انظر الرسم البياني في الشكل 1). بعد التفكك الأنزيمي لظهارة بطانة الرحم للفأر ، تم فصل الصفائح الظهارية ميكانيكيا عن الخلايا اللحمية الرح?...

Discussion

هنا ، نصف طرق توليد عضويات ظهارية بطانة الرحم من بطانة الرحم للفأر والبروتوكولات المستخدمة بشكل روتيني لتحليلها في المراحل النهائية. تعتبر عضويات بطانة الرحم أداة قوية لدراسة الآليات التي تتحكم في الأمراض المرتبطة ببطانة الرحم ، مثل التهاب بطانة الرحم وسرطان بطانة الرحم وفشل الزرع. ذكرت...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

نشكر الدكتورة ستيفاني بانجاس والدكتور مارتن إم ماتزوك (M.M.M.) على القراءة النقدية وتحرير مخطوطتنا. تم دعم الدراسات من قبل منح معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية R00-HD096057 (DM) و R01-HD105800 (DM) و R01-HD032067 (M.M.M.) و R01-HD110038 (M.M.M.) ، ومنحة دعم مركز السرطان NCI- P30 (NCI-CA125123). ديانا مونسيفيس ، دكتوراه حاصلة على جائزة الحمل من الجيل التالي من صندوق بوروز ويلكوم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Organoid Media Formulation
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-freeCorning354230100%
Trypsin from Bovine PancreasSigma AldrichT1426-1G1%
Advanced DMEM/F12Life Technologies126340101X
N2 supplementLife Technologies175020481X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin ALife Technologies125870101X
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165-5G1.25 mM
L-glutamineLife Technologies250300242 mM
NicotinamideSigma AldrichN0636-100G10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01Tocris2939500 nM
Recombinant human EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
Recombinant human NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1Peprotech120-38500 ng/mL
Recombinant human FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
Recombinant human HGFPeprotech100-3950 ng/mL
WNT3aR&D systems5036-WN200 ng/mL
Other supplies and reagents
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma AldrichC0130-1G5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma AldrichDN25-100MG2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesiumThermoFisher14190-2501X
HBSS, no calcium, no magnesiumThermoFisher141701121X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well)Fisher Scientific#08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well)Fisher Scientific#0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µmFisher Scientific#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg)Genesee Scientific11-331
Trizol reagentInvitrogen15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol redThermoFisher11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal strippedSigma AldrichF6765-500ML2%
Estratiol (E2)Sigma AldrichE1024-1G10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM GradeVWR157104%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue CassettesFisher Scientific1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base MoldsFisher Scientific64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%)Fisher Scientific22-032-601 
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Permount Mounting MediumFisher Scientific50-277-97
Epredia Nylon Biopsy BagsFisher Scientific6774010
HistoGel Specimen Processing GelVWR83009-992
Hematoxylin solution PremiumVWR95057-844
Eosin Y (yellowish) solution PremiumVWR95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4GenDEPORTT80541X
TBST (10X), pH 7.4GenDEPORTT80561X
Citric acid Sigma AldrichC0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrateSigma AldrichS4641-500G
Tween20Fisher ScientificBP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-100G3%
DAPI Solution (1 mg/mL)ThermoFisher622481:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LabsH-1000-10
Clear Nail PolishFisher ScientificNC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific22037246
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-106
SuperScript VILO Master MixThermoFisher11755050
SYBR Green PCR Master MixThermoFisher4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I) DSHBTROMA-I 1:50 dilution
Vimentin AntobodyCell Signaling5741S1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		ThermoFisherA-212091:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		ThermoFisherA-212061:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo MicroscopeZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital cameraZEISS
Primer SequenceForward (5'-3')Reverse (5'-3')_
Lipocalin 2 (Lcn2)GCAGGTGGTACGTTGTGGGCTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf)TGAGGCCCTTGGACTCTGTACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr)CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTCTAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)CAATGTGTCCGTCGTGGATCTGCCTGCTTCACCACCTTCTT

References

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84 (2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384 (2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603 (2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623 (2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378 (2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760 (2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12 (2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088 (2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102 (2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863 (2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987 (2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138 (2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042 (2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610 (2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

191

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved