АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает методологии установления эпителиальных органоидов эндометрия мышей для экспрессии генов и гистологического анализа.

Аннотация

Ткань эндометрия выстилает внутреннюю полость матки и находится под циклическим контролем эстрогена и прогестерона. Это ткань, которая состоит из просветного и железистого эпителия, стромального компартмента, сосудистой сети и сложной популяции иммунных клеток. Мышиные модели были мощным инструментом для изучения эндометрия, выявляя критические механизмы, которые контролируют имплантацию, плацентацию и рак. Недавняя разработка 3D-культур органоидов эндометрия представляет собой современную модель для анализа сигнальных путей, лежащих в основе биологии эндометрия. Создание органоидов эндометрия из генетически модифицированных моделей мышей, анализ их транскриптомов и визуализация их морфологии с одноклеточным разрешением являются важнейшими инструментами для изучения заболеваний эндометрия. В этой статье описываются методы создания 3D-культур эпителия эндометрия у мышей и описываются методы количественной оценки экспрессии генов и анализа гистологии органоидов. Цель состоит в том, чтобы предоставить ресурс, который может быть использован для установления, культивирования и изучения экспрессии генов и морфологических характеристик эпителиальных органоидов эндометрия.

Введение

Эндометрий - внутренняя слизистая оболочка полости матки - является уникальной и очень динамичной тканью, которая играет решающую роль в репродуктивном здоровье женщины. В течение репродуктивной жизни эндометрий обладает потенциалом для прохождения сотен циклов пролиферации, дифференцировки и распада, координируемых согласованным действием гормонов яичников - эстрогена и прогестерона. Исследования генетически модифицированных мышей выявили основные биологические механизмы, лежащие в основе реакции эндометрия на гормоны и контроля имплантации эмбриона, децидуализации стромальных клеток и беременности1. Исследования in vitro, однако, были ограничены из-за трудностей в поддержании нетрансформированных первичных тканей эндометрия мыши в традиционных 2D клеточных культурах 2,3. Последние достижения в культуре тканей эндометрия как 3D-систем органов или органоидов представляют собой новую возможность исследовать биологические пути, которые контролируют регенерацию и дифференцировку клеток эндометрия. Органоидные системы эндометрия мышей и человека были разработаны из чистого эпителия эндометрия, инкапсулированного в различные матрицы 4,5, в то время как эндометрий человека культивировался как эпителиальные/стромальные кокультуры без каркаса 6,7, а в последнее время как коллаген-инкапсулированные эпителиальные/стромальные ассамблоиды8 . Рост и регенеративный потенциал эпителиальных органоидных культур поддерживается определенным коктейлем факторов роста и ингибиторов малых молекул, которые были эмпирически определены для максимизации роста и регенерации органоидов 4,5,9. Кроме того, способность замораживать и размораживать органоиды эндометрия позволяет долгосрочно хранить органоиды эндометрия у мышей и людей для будущих исследований.

Генетически модифицированные мыши выявили сложные сигнальные пути, которые контролируют раннюю беременность и децидуализацию, и были использованы в качестве моделей потери беременности, рака эндометрия и эндометриоза. Эти генетические исследования были в значительной степени достигнуты с помощью клеточно-специфической делеции боковых аллелей loxP («floxed») с использованием cre recombinases, которые особенно активны в женских репродуктивных тканях. Эти мышиные модели включают широко используемый рецептор прогестерона-cre10, который обладает сильной активностью рекомбиназы в эпителиальных и стромальных тканях эндометрия, лактоферрин i-cre, который индуцирует рекомбинацию эпителия эндометрия у взрослых мышей11, или Wnt7a-cre, который вызывает эпителиально-специфическую делецию в тканях Мюллера12 . Культивирование тканей эндометрия из генетически модифицированных моделей мышей в качестве 3D-органоидов предоставило отличную возможность исследовать биологию эндометрия и облегчить идентификацию факторов роста и сигнальных путей, которые контролируют обновление и дифференцировку клеток эндометрия13,14. Методы выделения и культивирования тканей эндометрия мышей описаны в литературе и сообщают об использовании различных ферментативных стратегий выделения эпителия матки для последующего культивирования органоидов эпителия эндометрия4. В то время как предыдущая литература обеспечивает критическую основу для протоколов 4,5,6 эпителиальных органоидных культур эндометрия, эта статья предоставляет четкий, всеобъемлющий метод генерации, поддержания, обработки и анализа этих органоидов. Стандартизация этих методов имеет важное значение для ускорения прогресса в области репродуктивной биологии женщин. Здесь мы сообщаем подробную методику ферментативной и механической очистки эпителиальной ткани эндометрия мыши для последующей культивирования органоидов эндометрия в каркасе гелевой матрицы. Мы также описываем методологии последующего гистологического и молекулярного анализа инкапсулированных гелевой матрицей эпителиальных органоидов эндометрия мыши.

протокол

Обращение с мышами и экспериментальные исследования проводились в соответствии с протоколами, одобренными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского колледжа Бейлора, и руководящими принципами, установленными Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Выделение эпителия матки у мышей ферментативными и механическими методами

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются шаги, необходимые для установления, прохождения, замораживания и размораживания эпителиальных органоидов эндометрия у мышей с использованием каркаса гелевой матрицы. Предыдущие исследования определили, что оптимальные культуры органоидов эндометрия мыши устанавливаются у мышей во время фазы течки4, что может быть определено путем цитологического исследования вагинального тампона15. Для всех экспериментов использовались взрослые самки мышей WT (6-8 недель, гибридные C57BL/6J и 129S5/SvEvBrd). Мышей гуманно усыпляли в соответствии с одобренными IACUC руководящими принципами с использованием седации изофлурана с последующей дисартикуляцией шейки матки. После того, как мыши усыплены, следует выполнить следующие шаги. Подробную информацию о материалах и решениях , используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов.

  1. Дайте гелевой матрице оттаять на льду примерно за 1-2 ч перед использованием.
  2. Чтобы рассечь мышь, используйте ножницы, чтобы сделать разрез средней линии на животе и аккуратно отшелушить кожу, чтобы обнажить нижележащий перитонеальный слой. Используйте щипцы, чтобы удерживать брюшиный слой и делать боковые разрезы ножницами, чтобы обнажить брюшное содержимое.
    1. Найдите рога матки, осторожно отодвинув брюшные жировые подушечки в сторону. Рассекните их, сначала удерживая их в шейном соединении и используя ножницы, чтобы разрезать вдоль брыжеечного жира. После рассечения матки мыши тщательно удалите жировую ткань из рога матки небольшими ножницами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте стерильность во время изоляции клеток, стерилизуя все хирургические инструменты перед использованием, опрыскивайте брюшную полость мыши 70% этанолом и выполняйте все шаги после рассечения под стерильной культуральной оболочкой ткани.
  3. Разрежьте каждый рог матки на небольшие фрагменты, каждый размером примерно 4-5 мм.
  4. Поместите все фрагменты матки из одной матки в одну лунку из 24-луночной пластины, содержащей 0,5 мл 1% трипсина. Позвольте ферментативному раствору проникнуть в просвет матки, вызывая ферментативное отделение эпителия эндометрия от нижележащей стромы.
  5. Инкубируйте 24-луночную пластину в инкубаторе увлажненной культуры тканей при температуре 37 °C в течение приблизительно 1 ч.
  6. После инкубации в течение 1 ч перенесите фрагменты матки на 35-миллиметровую пластину культуры ткани, содержащую 1 мл фосфатно-буферного раствора (DPBS) Дульбекко.
  7. Под рассеченным микроскопом используйте тонкие щипцы и пипетку 1 мл, чтобы механически отделить эпителий матки от маточной трубы. Удерживая щипцами один конец фрагмента матки, осторожно проведите кончиком пипетки продольно по фрагменту, выдавив эпителий из другого конца маточной трубы. Наблюдают за отделенными эпителиальными листами от фрагмента матки под рассеченным микроскопом.
  8. Используйте пипетку 1 мл, чтобы собрать и аккуратно перенести эпителиальные листы в трубку объемом 1,5 мл.
  9. Повторите процесс для оставшихся фрагментов матки, перенеся все эпителиальные листы в одну и ту же коллекторную трубку.
  10. Гранулируют диссоциированные эпителиальные листы центрифугированием в течение 5 мин при 375 × г.
  11. Осторожно удалите супернатант, чтобы не потревожить гранулу клетки.
  12. Повторно суспендировать клеточную гранулу в 0,5 мл 2,5 мг/мл коллагеназы + 2 мг/мл раствора ДНКазы. Пипетка вверх и вниз примерно в 10 раз, или до тех пор, пока не будет достигнута одноэлементная суспензия.
  13. Добавьте 0,5 мл DMEM/F12 + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) + антибиотики и центрифугируйте клетки в течение 5 мин при 375 × г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации об антибиотике широкого спектра действия, используемом для клеточной культуры, обратитесь к Таблице материалов.
  14. Осторожно удаляют супернатант и повторно суспендируют клетки в 1 мл DMEM/F12 + 10% FBS + антибиотики. Центрифугируют клетки в течение 5 мин при 375 × г.

2. Обработка стромального отсека

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются протоколы, необходимые для изоляции стромального компартмента эндометрия мыши. Учитывая растущий интерес к экспериментам с эпителиальной / стромальной кокультурой, важно иметь возможность обрабатывать популяции стромальных клеток в дополнение к эпителиальным клеткам, которые будут генерировать органоиды.

  1. После того, как весь эпителий был ферментативно и механически отделен от фрагментов матки, оставшиеся трубчатые структуры являются «стромальными / миометриальными» отсеками. Соберите эту ткань в 2,5 мг/мл коллагеназы + 2 мг/мл ДНКазы в растворе HBSS.
  2. Инкубируйте стромальный/миометриальный образец на шейкере с температурой 37 °C в течение 15 мин.
  3. После инкубации добавьте 500 мкл DMEM/F12 + 10% FBS + антибиотиков на мышь и фильтруйте недиссоциированные фрагменты через клеточный фильтр 40 мкм.
  4. Гранулируют клетки центрифугированием в течение 5 мин при 375 × г.
  5. Осторожно удаляют надосадочный агент и повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл DMEM/F12 + 10% FBS + антибиотики. Добавьте смесь по каплям в 10 мл DMEM/F12 + 10% FBS + антибиотиков в 10 см клеточную культуральную пластину. Инкубируют пластину при 37 °C в увлажненном инкубаторе клеточной культуры.
  6. Для получения кокультур эпителиальных и стромальных клеток эндометрия мыши следуйте методам, описанным для органоидов эндометрия человека, с использованием бесконтактных или коллагеновых матричных систем 6,8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя эти методы еще не были опубликованы для мышей, они могут быть адаптированы на основе опубликованных протоколов с эндометрием человека.

3. Инкапсуляция эпителия матки в гель-матрицу для установления органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Держите гелевую матрицу на льду до тех пор, пока она не будет готова к использованию.

  1. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в объеме гелевой матрицы, который в 20 раз больше, чем у клеточной гранулы (т. Е. Если ячейка гранулы составляет 20 мкл, повторно суспендируйте клетки 400 мкл гелевой матрицы). Тщательно повторно суспендируйте гранулы, чтобы избежать введения пузырьков.
  2. Дайте суспензии гелевой матрицы/ячейки осесть при комнатной температуре в течение ~10 мин.
  3. Как только гелевая матрица/клеточная суспензия станет полутвердым гелем, используйте микропипетку P200 с широким отверстием 200 мкл, чтобы аккуратно аспирировать 25 мкл гелевой матрицы/клеточной суспензии. Дозируйте три отдельных купола по 25 мкл на лунку 12-луночной пластины и дайте гелевой матрице отверждаться в течение 15 минут в инкубаторе культуры увлажненной ткани при температуре 37 °C.
  4. После того, как гелевая матрица отверждается, добавьте 750 мкл органоидной среды к каждой скважине, содержащей купола гелевой матрицы. Инкубировать при 37 °C в инкубаторе культуры увлажненной ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоидная среда рецептура отмечена в Таблице материалов. Органоиды обычно образуются в течение 4 дней после первоначальной культивирования.

4. Анализ экспрессии генов органоидов эндометрия после лечения эстрадиолом

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются методы, используемые для профилирования экспрессии генов эпителиальных органоидов эндометрия с использованием qPCR в режиме реального времени после лечения эстрадиолом (E2; см. Таблицу 1). Поскольку эндометрий находится под циклическим контролем гормона яичников E2, тестирование реакции органоидов на E2 является важной мерой физиологической функции. Мы получили высококачественную РНК и сгенерировали достаточное количество мРНК для профилирования экспрессии генов с использованием qPCR и / или секвенирования РНК из наших органоидов эпителия эндометрия. В этом разделе описывается, как собирать органоиды и обрабатывать их для последующего анализа экспрессии генов. Выбранная среда для лечения отражает ту, которая используется для лечения культивируемых клеток эндометрия. Однако следует отметить, что эта лечебная среда может быть оптимизирована соответствующим образом, как это делается для обработки 3D-культур эндометрия человека гормонами 8,16,17.

  1. Культивируйте органоиды эндометрия, как описано выше.
  2. Удалите органоидную среду и замените ее 750 мкл голодной среды через четыре дня после посева. Инкубировать на ночь.
  3. На следующее утро удалите среду голодания. Добавить 750 мкл среды для обработки, содержащей либо транспортное средство, либо 10 нМ Е2. Инкубировать в течение 48 ч.
  4. Продолжайте изоляцию РНК в соответствии с протоколом производителя комплекта.

5. Гистологический анализ органоидов эндометрия

ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация морфологических особенностей органоидов эндометрия имеет решающее значение для оценки клеточного эффекта факторов роста, генетических манипуляций или ингибиторов малых молекул. В этом разделе описываются методы, используемые для фиксации, обработки и изображения эпителиальных органоидов эндометрия с использованием гистологических пятен и иммунофлуоресцентного окрашивания антителами.

  1. Приготовьте 1,5 мл микроцентрифужных пробирок, содержащих 1 мл 4% параформальдегида в 1x PBS. Поместите их на лед.
  2. Аспирировать среду из лунок 12-луночной пластины, содержащей органоиды.
  3. Используя наконечник пипетки объемом 1 мл с разрезанным наконечником, перенесите 500 мкл 4% параформальдегида в каждую лунку и аккуратно отсоедините купола гелевой матрицы от нижней части пластины.
  4. Аккуратно аспирируйте все купола гелевой матрицы в наконечник пипетки и переложите в трубку микроцентрифуги объемом 1,5 мл.
  5. Зафиксируйте органоиды, поместив их на ротатор при 4 °C в течение ночи.
  6. На следующее утро центрифугируют пробирку при 600 × г в течение 5 мин, чтобы гранулировать органоиды. Аккуратно удалить 4% раствор параформальдегида пипеткой и выбросить. Промыть органоиды в 2 раза 70% этанолом.
  7. После последней промывки удалите из пробирки все, кроме 50-100 мкл этанола. Отложите трубку в сторону.
  8. Поместите тюбик с гелем для обработки образца на водяную баню и микроволновую печь в течение ~ 30 с, чтобы расплавить гель. Убедитесь, что гель для обработки образца не закипает, контролируя консистенцию геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как гель для обработки образца расплавлен, но не закипит горячим, работайте быстро, чтобы инкапсулировать органоиды.
  9. Перенесите достаточное количество геля для обработки образца, чтобы покрыть всю поверхность формы (примерно 250 мкл).
  10. Пока гель для обработки образца все еще расплавлен, быстро переносят 50 мкл 70% раствора этанола, содержащего органоиды. Убедитесь, что органоиды затонули или подтолкнули к нижней части формы.
  11. Поместите гистологическую форму на ведро со льдом и дайте гелю для обработки образца остыть и затвердеть.
  12. Как только гель для обработки образца полностью высохнет, осторожно перенесите квадрат геля для обработки образца в мешок для образца, отслеживая плоскость, в которой расположены органоиды.
  13. Поместите мешок в гистологическую кассету и обработайте с помощью стандартных методов, используемых для фиксации формалина и парафинового встраивания тканей18.
  14. После фиксации и встраивания в парафин, сечение на 5 мкм с помощью микротома19. Продолжайте стандартные процедуры окрашивания гематоксилина и эозина (H & E) или иммуноокрашивания, как описано ниже.

6. Окрашивание гематоксилином и эозином

  1. Депарафинизировать срезы следующим образом: ксилол, 2 х 10 мин; 100% этанол, 2 х 3 мин; 80% этанол, 3 мин; 60% этанол, 3 мин; dH2O, 2 x 3 мин; 1 мин - гематоксилин; водопроводная вода (3 x 5 с); 1 мин - эозин.
  2. Обезвоживать срезы следующим образом: 60% этанол, 3 мин; 80% этанол, 3 мин; 95% этанол, 3 мин; 100% этанол, 2 х 3 мин; ксилол, 2 x 15 мин.
  3. Монтаж с помощью монтажного носителя.

7. Иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. Депарафинизируйте разделы, как описано в шаге 6.1.
  2. Извлечение антигена
    1. Погрузите слайды в раствор для извлечения антигена в контейнер, безопасный для микроволновой печи.
    2. Микроволновая печь на сильном огне в течение 20 минут, используя интервалы 5 минут, чтобы убедиться, что раствор не закипит.
  3. После завершения 20-минутного этапа извлечения антигена дайте слайдам остыть на льду в течение 40 минут, все еще погружаясь в буфер извлечения антигена.
  4. Мойте слайды с 1x TBST в течение 3 минут
  5. Блокируют слайды путем инкубации в 3% BSA в TBST в течение 1 ч при комнатной температуре.
  6. Первичная инкубация антител
    1. Разводят антитела в 3% BSA в TBST (1:50-1:1000, в зависимости от Ab).
    2. Инкубировать в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере.
    3. Стирайте 3 x 5 мин с TBST.
  7. Инкубация вторичных антител
    1. Разводят антитела в 3% BSA (в TBST) (1:250) или в 5% нормальной ослиной сыворотке.
    2. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре (РТ) в темноте, так как антитело конъюгируется с флуорофором.
  8. Ядерное окрашивание
    1. Разбавляют 4′,6-диамидин-2-фенилиндол (DAPI) 1:1000 в TBST.
    2. Инкубировать в течение 5 мин на РТ.
    3. Стирайте 2 x 5 мин с TBST.
  9. Установка
    1. Используйте одну каплю монтажного носителя для крепления крышки.
    2. Запечатайте обшивку лаком для ногтей на следующий день.

Результаты

Фазоконтрастные изображения органоидов эндометрия мыши
Мы установили органоиды из эпителия эндометрия мыши WT, как описано в прилагаемом протоколе (см. диаграмму на рисунке 1). После ферментативной диссоциации эпителия эндометрия мыши эпителиальные листы ме?...

Обсуждение

Здесь мы описываем методы генерации эпителиальных органоидов эндометрия из эндометрия мыши и протоколы, обычно используемые для их последующего анализа. Органоиды эндометрия являются мощным инструментом для изучения механизмов, которые контролируют заболевания, связанные с эндомет...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Стефани Пангас и д-ра Мартина М. Мацука (M.M.M.) за критическое прочтение и редактирование нашей рукописи. Исследования были поддержаны грантами Национального института детского здоровья и развития человека Юнис Кеннеди Шрайвер R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) и R01-HD110038 (M.M.M.), а также грантом поддержки онкологического центра NCI-P30 (NCI-CA125123). Диана Монсивайс, доктор философии, имеет награду Next Gen Pregnancy Award от Burroughs Wellcome Fund.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Organoid Media Formulation
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-freeCorning354230100%
Trypsin from Bovine PancreasSigma AldrichT1426-1G1%
Advanced DMEM/F12Life Technologies126340101X
N2 supplementLife Technologies175020481X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin ALife Technologies125870101X
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165-5G1.25 mM
L-glutamineLife Technologies250300242 mM
NicotinamideSigma AldrichN0636-100G10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01Tocris2939500 nM
Recombinant human EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
Recombinant human NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1Peprotech120-38500 ng/mL
Recombinant human FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
Recombinant human HGFPeprotech100-3950 ng/mL
WNT3aR&D systems5036-WN200 ng/mL
Other supplies and reagents
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma AldrichC0130-1G5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma AldrichDN25-100MG2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesiumThermoFisher14190-2501X
HBSS, no calcium, no magnesiumThermoFisher141701121X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well)Fisher Scientific#08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well)Fisher Scientific#0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µmFisher Scientific#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg)Genesee Scientific11-331
Trizol reagentInvitrogen15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol redThermoFisher11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal strippedSigma AldrichF6765-500ML2%
Estratiol (E2)Sigma AldrichE1024-1G10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM GradeVWR157104%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue CassettesFisher Scientific1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base MoldsFisher Scientific64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%)Fisher Scientific22-032-601 
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Permount Mounting MediumFisher Scientific50-277-97
Epredia Nylon Biopsy BagsFisher Scientific6774010
HistoGel Specimen Processing GelVWR83009-992
Hematoxylin solution PremiumVWR95057-844
Eosin Y (yellowish) solution PremiumVWR95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4GenDEPORTT80541X
TBST (10X), pH 7.4GenDEPORTT80561X
Citric acid Sigma AldrichC0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrateSigma AldrichS4641-500G
Tween20Fisher ScientificBP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-100G3%
DAPI Solution (1 mg/mL)ThermoFisher622481:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LabsH-1000-10
Clear Nail PolishFisher ScientificNC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific22037246
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-106
SuperScript VILO Master MixThermoFisher11755050
SYBR Green PCR Master MixThermoFisher4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I) DSHBTROMA-I 1:50 dilution
Vimentin AntobodyCell Signaling5741S1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		ThermoFisherA-212091:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		ThermoFisherA-212061:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo MicroscopeZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital cameraZEISS
Primer SequenceForward (5'-3')Reverse (5'-3')_
Lipocalin 2 (Lcn2)GCAGGTGGTACGTTGTGGGCTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf)TGAGGCCCTTGGACTCTGTACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr)CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTCTAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)CAATGTGTCCGTCGTGGATCTGCCTGCTTCACCACCTTCTT

Ссылки

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84 (2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384 (2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603 (2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623 (2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378 (2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760 (2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12 (2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088 (2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102 (2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863 (2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987 (2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138 (2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042 (2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610 (2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

191

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены