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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung von Endometrium-Epithel-Organoiden der Maus für die Genexpression und histologische Analysen.

Zusammenfassung

Endometriumgewebe kleidet die innere Höhle der Gebärmutter aus und steht unter der zyklischen Kontrolle von Östrogen und Progesteron. Es ist ein Gewebe, das aus luminalem und Drüsenepithel, einem Stromakompartiment, einem vaskulären Netzwerk und einer komplexen Immunzellpopulation besteht. Mausmodelle waren ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Endometrium zu untersuchen und kritische Mechanismen aufzudecken, die Implantation, Plazenta und Krebs steuern. Die jüngste Entwicklung von 3D-Endometrium-Organoidkulturen stellt ein hochmodernes Modell dar, um die Signalwege zu analysieren, die der Biologie der Gebärmutterschleimhaut zugrunde liegen. Die Etablierung von Endometrium-Organoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen, die Analyse ihrer Transkriptome und die Visualisierung ihrer Morphologie in Einzelzellauflösung sind entscheidende Werkzeuge für die Erforschung von Endometriumerkrankungen. Dieser Artikel skizziert Methoden zur Etablierung von 3D-Kulturen von Endometriumepithel aus Mäusen und beschreibt Techniken zur Quantifizierung der Genexpression und zur Analyse der Histologie der Organoide. Ziel ist es, eine Ressource bereitzustellen, die zur Etablierung, Kultur und Untersuchung der Genexpression und morphologischen Eigenschaften von Endometriumepithel-Organoiden verwendet werden kann.

Einleitung

Das Endometrium - das innere Schleimhautgewebe der Gebärmutterhöhle - ist ein einzigartiges und hochdynamisches Gewebe, das eine entscheidende Rolle für die reproduktive Gesundheit einer Frau spielt. Während der reproduktiven Lebensspanne hat das Endometrium das Potenzial, Hunderte von Zyklen der Proliferation, Differenzierung und des Abbaus zu durchlaufen, die durch die konzertierte Wirkung der Eierstockhormone - Östrogen und Progesteron - koordiniert werden. Studien an gentechnisch veränderten Mäusen haben grundlegende biologische Mechanismen aufgedeckt, die der Reaktion der Gebärmutterschleimhaut auf Hormone und der Kontrolle der Embryoimplantation, der Stromazelldezidualisierung und der Schwangerschaft zugrunde liegen1. In-vitro-Studien waren jedoch aufgrund von Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung nicht transformierter primärer Endometriumgewebe der Maus in traditionellen 2D-Zellkulturen begrenzt 2,3. Jüngste Fortschritte in der Kultur von Endometriumgewebe als 3D-Organsysteme oder Organoide bieten eine neue Möglichkeit, biologische Signalwege zu untersuchen, die die Regeneration und Differenzierung von Endometriumzellen steuern. Endometrium-Organoidsysteme der Maus und des Menschen wurden aus reinem Endometriusepithel entwickelt, das in verschiedenen Matriceseingekapselt ist 4,5, während menschliches Endometrium als gerüstfreie epitheliale/stromale Co-Kulturen 6,7 und in jüngerer Zeit als kollagenverkapselte Epithel-/Stroma-Assembloide kultiviert wurde8 . Das Wachstum und das regenerative Potenzial von epithelialen Organoidkulturen wird durch einen definierten Cocktail aus Wachstumsfaktoren und niedermolekularen Inhibitoren unterstützt, die empirisch bestimmt wurden, um das Wachstum und die Regeneration der Organoide zu maximieren 4,5,9. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, Endometrium-Organoide einzufrieren und aufzutauen, die langfristige Einlagerung von Endometrium-Organoiden von Mäusen und Menschen für zukünftige Studien.

Gentechnisch veränderte Mäuse haben die komplexen Signalwege aufgedeckt, die die frühe Schwangerschaft und Dezidualisierung steuern, und wurden als Modelle für Schwangerschaftsverlust, Endometriumkarzinom und Endometriose verwendet. Diese genetischen Studien wurden weitgehend mit zellspezifischer Deletion von loxP-flankierten Allelen ("gefloxt") unter Verwendung von Cre-Rekombinasen erreicht, die spezifisch im weiblichen Fortpflanzungsgewebe aktiv sind. Zu diesen Mausmodellen gehören der weit verbreitete Progesteronrezeptor-cre 10, der eine starke Rekombinaseaktivität im Epithel- und Stromagewebe des Endometriums aufweist, Lactoferrin i-cre, das bei erwachsenen Mäusen eine endometriumepitheliale Rekombination induziert11, oder Wnt7a-cre, das eine epithelialspezifische Deletion in Müller-abgeleiteten Geweben auslöst12 . Die Kultivierung von Endometriumgewebe aus gentechnisch veränderten Mausmodellen als 3D-Organoide bietet eine hervorragende Möglichkeit, die Biologie des Endometriums zu untersuchen und die Identifizierung von Wachstumsfaktoren und Signalwegen zu erleichtern, die die Erneuerung und Differenzierung von Endometriumzellen steuern13,14. Verfahren zur Isolierung und Kultur von Endometriumgewebe der Maus sind in der Literatur beschrieben und berichten über die Verwendung verschiedener enzymatischer Strategien zur Isolierung von Uterusepithel für die anschließende Kultivierung von Endometriumepithel-Organoiden4. Während die bisherige Literatur einen kritischen Rahmen für Endometriumepithel-Organoid-Kulturprotokolle 4,5,6 bietet, bietet diese Arbeit eine klare, umfassende Methode zur Generierung, Wartung, Verarbeitung und Analyse dieser Organoide. Die Standardisierung dieser Techniken ist wichtig, um den Fortschritt auf dem Gebiet der Reproduktionsbiologie von Frauen zu beschleunigen. Hier berichten wir über eine detaillierte Methodik zur enzymatischen und mechanischen Reinigung von Endometrium-Epithelgewebe der Maus für die anschließende Kultur von Endometrium-Organoiden in einem Gelmatrix-Gerüst. Wir beschreiben auch die Methoden für nachgeschaltete histologische und molekulare Analysen der Gelmatrix-verkapselten Maus-Endometrium-Epithel-Organoide.

Protokoll

Die Handhabung von Mäusen und experimentelle Studien wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Baylor College of Medicine genehmigt wurden, und gemäß den Richtlinien des NIH-Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Isolierung von Uterusepithel aus Mäusen mit enzymatischen und mechanischen Methoden

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Schritte beschrieben, die erforderlich sind, um epitheliale Endometrium-Organoide von Mäusen unter Verwendung eines Gelmatrix-Gerüsts zu etablieren, zu passieren, einzufrieren und aufzutauen. Frühere Studien haben ergeben, dass während der Brunstphase4 optimale Kulturen von Endometrium-Organoiden der Maus aus Mäusen etabliert werden, was durch zytologische Untersuchung eines Vaginalabstrichs bestimmt werden kann15. Für alle Experimente wurden erwachsene weibliche WT-Mäuse (6-8 Wochen alt, Hybride C57BL/6J und 129S5/SvEvBrd) verwendet. Die Mäuse wurden gemäß den von der IACUC genehmigten Richtlinien mit Isofluran-Sedierung und anschließender zervikaler Disartikulation auf humane Weise eingeschläfert. Sobald die Mäuse eingeschläfert sind, sollten die folgenden Schritte befolgt werden. Weitere Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Lösungen finden Sie in der Materialtabelle .

  1. Lassen Sie die Gelmatrix vor Gebrauch ca. 1-2 h auf Eis auftauen.
  2. Um die Maus zu sezieren, verwenden Sie eine Schere, um einen Mittellinienschnitt am Bauch zu machen, und schälen Sie die Haut vorsichtig zurück, um die darunter liegende Peritonealschicht freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Peritonealschicht hochzuhalten, und machen Sie seitliche Schnitte mit der Schere, um den Bauchinhalt freizulegen.
    1. Lokalisieren Sie die Gebärmutterhörner, indem Sie die Bauchfettpolster vorsichtig zur Seite schieben. Sezieren Sie sie, indem Sie sie zuerst an der zervikalen Verbindung halten und mit einer Schere entlang des Mesenterialfetts schneiden. Entfernen Sie nach der Dissektion der Gebärmutter der Maus mit einer kleinen Schere gründlich Fettgewebe aus dem Uterushorn.
      HINWEIS: Halten Sie die Sterilität während der Zellisolierung aufrecht, indem Sie alle Operationswerkzeuge vor Gebrauch sterilisieren, den Mäusebauch mit 70% Ethanol besprühen und alle Schritte nach der Dissektion unter einer sterilen Gewebekulturhaube durchführen.
  3. Schneiden Sie jedes Gebärmutterhorn in kleine Fragmente, die jeweils ca. 4-5 mm groß sind.
  4. Legen Sie alle Uterusfragmente aus einer Gebärmutter in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die 0,5 ml 1% Trypsin enthält. Lassen Sie die enzymatische Lösung in das Uteruslumen eindringen, wodurch das Endometriumepithel vom darunter liegenden Stroma enzymatisch getrennt wird.
  5. Die 24-Well-Platte wird in einem 37 °C warmen befeuchteten Gewebekultur-Inkubator für ca. 1 h inkubiert.
  6. Nach der 1-stündigen Inkubation werden die Uterusfragmente auf eine 35 mm große Gewebekulturplatte übertragen, die 1 ml Phosphat-gepufferte Lösung (DPBS) von Dulbecco enthält.
  7. Verwenden Sie unter einem Dissektionsmikroskop eine feine Pinzette und eine 1-ml-Pipette, um das Uterusepithel mechanisch von der Gebärmuttersonde zu trennen. Während Sie ein Ende eines Uterusfragments mit der Pinzette nach unten halten, führen Sie die Pipettenspitze vorsichtig in Längsrichtung über das Fragment und drücken Sie das Epithel aus dem anderen Ende der Gebärmutterröhre. Beobachten Sie die vom Uterusfragment abgetrennten Epithelblätter unter dem Dissektionsmikroskop.
  8. Verwenden Sie die 1-ml-Pipette, um die Epithelschichten zu sammeln und vorsichtig in ein 1,5-ml-Röhrchen zu überführen.
  9. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Uterusfragmente und übertragen Sie alle Epithelblätter in dasselbe Sammelröhrchen.
  10. Die dissoziierten Epithelschichten werden durch Zentrifugation für 5 min bei 375 × g pelletiert.
  11. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um eine Störung des Zellpellets zu vermeiden.
  12. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 ml 2,5 mg/ml Kollagenase + 2 mg/ml DNase-Lösung. Pipettieren Sie ca. 10x auf und ab, oder bis eine einzellige Suspension erreicht ist.
  13. Fügen Sie 0,5 ml DMEM/F12 + 10% fetales Rinderserum (FBS) + Antibiotika hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 375 × g.
    HINWEIS: Weitere Informationen über das Breitbandantibiotikum, das für die Zellkultur verwendet wird, finden Sie in der Materialtabelle.
  14. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + Antibiotika. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 375 × g.

2. Verarbeitung des Stromakompartiments

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Protokolle beschrieben, die für die Isolierung des Stromakompartiments des Endometriums der Maus erforderlich sind. Angesichts des zunehmenden Interesses an epithelialen/stromalen Kokulturexperimenten ist es wichtig, neben den Epithelzellen, die Organoide erzeugen, auch die Stromazellpopulationen verarbeiten zu können.

  1. Sobald das gesamte Epithel enzymatisch und mechanisch von den Uterusfragmenten getrennt wurde, sind die verbleibenden röhrenförmigen Strukturen die "stromalen / myometrischen" Kompartimente. Sammeln Sie dieses Gewebe in einer 2,5 mg/ml Kollagenase + 2 mg/ml DNase in HBSS-Lösung.
  2. Die stroma-/myometriale Probe wird 15 Minuten lang auf einem 37 °C-Shaker inkubiert.
  3. Nach der Inkubation werden 500 μL DMEM/F12 + 10% FBS + Antibiotika pro Maus hinzugefügt und die nicht dissoziierten Fragmente durch einen 40 μm Zellfilter filtriert.
  4. Die Zellen werden durch Zentrifugation für 5 min bei 375 × g pelletiert.
  5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + Antibiotika. Geben Sie die Mischung tropfenweise in 10 ml DMEM/F12 + 10% FBS + Antibiotika in eine 10 cm Zellkulturplatte. Die Platte wird bei 37 °C in einem befeuchteten Zellkulturbrutschrank inkubiert.
  6. Um Kokulturen von Endometriumepithel- und Stromazellen der Maus zu erzeugen, sind die für menschliche Endometrium-Organoide beschriebenen Methoden unter Verwendung von gerüstfreien oder Kollagenmatrixsystemen 6,8 anzuwenden.
    HINWEIS: Obwohl diese Techniken noch nicht für Mäuse veröffentlicht wurden, können sie basierend auf den veröffentlichten Protokollen mit menschlichem Endometrium angepasst werden.

3. Verkapselung von Uterusepithel in Gelmatrix zur Etablierung von Organoiden

HINWEIS: Bewahren Sie die Gelmatrix auf Eis auf, bis sie gebrauchsfertig ist.

  1. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Volumen der Gelmatrix, das 20x so groß ist wie das des Zellpellets (d. h. wenn das Zellpellet 20 μl beträgt, resuspendieren Sie die Zellen mit 400 μl Gelmatrix). Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig, um das Auftreten von Blasen zu vermeiden.
  2. Lassen Sie die Gelmatrix/Zellsuspension ~10 min bei Raumtemperatur einwirken.
  3. Sobald die Gelmatrix/Zellsuspension zu einem halbfesten Gel wird, verwenden Sie eine P200-Mikropipette mit einer breiten 200-μl-Spitze, um 25 μl der Gelmatrix/Zellsuspension vorsichtig abzusaugen. Dosieren Sie drei separate 25-μl-Kuppeln pro Vertiefung einer 12-Well-Platte und lassen Sie die Gelmatrix 15 Minuten lang in einem 37 °C warmen befeuchteten Gewebekulturinkubator aushärten.
  4. Nachdem die Gelmatrix ausgehärtet ist, geben Sie 750 μL Organoidmedium in jede Vertiefung, die Gelmatrixkuppeln enthält. Inkubation bei 37 °C in einem befeuchteten Gewebekulturbrutscher.
    HINWEIS: Die Formulierung der organoiden Medien ist in der Materialtabelle angegeben. Organoide bilden sich typischerweise innerhalb von 4 Tagen nach der ersten Kultur.

4. Genexpressionsanalyse von Endometrium-Organoiden nach Behandlung mit Östradiol

ANMERKUNG: In diesem Abschnitt werden die Methoden beschrieben, die zur Profilierung der Genexpression von Endometriumepithel-Organoiden mittels real-time qPCR nach Behandlung mit Östradiol verwendet werden (E2; siehe Tabelle 1). Da das Endometrium unter der zyklischen Kontrolle des Ovarialhormons E2 steht, ist das Testen der Reaktionsfähigkeit der Organoide auf E2 ein wichtiges Maß für die physiologische Funktion. Wir haben qualitativ hochwertige RNA erhalten und genügend mRNA generiert, um die Genexpression mittels qPCR und/oder RNA-Sequenzierung aus unseren Endometrium-Epithel-Organoiden zu profilieren. In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Organoide gesammelt und für die nachgelagerte Analyse der Genexpression aufbereitet werden. Das gewählte Behandlungsmedium entspricht demjenigen, das zur Behandlung kultivierter Endometriumzellen verwendet wird. Es ist jedoch zu beachten, dass dieses Behandlungsmedium entsprechend optimiert werden kann, wie es bei der Behandlung von humanen Endometrium-3D-Kulturen mit den Hormonen 8,16,17 der Fall ist.

  1. Kultur der Endometrium-Organoide wie oben beschrieben.
  2. Entfernen Sie das Organoidmedium und ersetzen Sie es vier Tage nach der Aussaat durch 750 μL Hungermedium. Über Nacht inkubieren.
  3. Entfernen Sie am nächsten Morgen das Hungermedium. Fügen Sie 750 μL Behandlungsmedium hinzu, das entweder Vehikel oder 10 nM E2 enthält. Inkubieren für 48 h.
  4. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung gemäß dem Protokoll des Kit-Herstellers fort.

5. Histologische Analyse von Endometrium-Organoiden

HINWEIS: Die Abbildung der morphologischen Merkmale von Endometrium-Organoiden ist entscheidend für die Beurteilung der zellulären Wirkung von Wachstumsfaktoren, genetischen Manipulationen oder niedermolekularen Inhibitoren. In diesem Abschnitt werden die Techniken beschrieben, die zur Fixierung, Verarbeitung und Abbildung von Endometriumepithelorganoiden unter Verwendung histologischer Färbungen und Antikörper-Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden.

  1. Bereiten Sie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen vor, die 1 mL 4% Paraformaldehyd in 1x PBS enthalten. Legen Sie sie auf Eis.
  2. Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 12-Well-Platte ab, die die Organoide enthält.
  3. Übertragen Sie mit einer 1-ml-Pipettenspitze mit einer geschnittenen Spitze 500 μL 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und lösen Sie die Gelmatrixdome vorsichtig vom Boden der Platte.
  4. Die gesamten Gelmatrixdome werden vorsichtig in die Pipettenspitze abgesaugt und in das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
  5. Fixieren Sie die Organoide, indem Sie sie über Nacht bei 4 °C auf einen Rotator legen.
  6. Am nächsten Morgen zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 600 × g für 5 Minuten, um die Organoide zu pelletieren. Entfernen Sie die 4%ige Paraformaldehydlösung vorsichtig mit einer Pipette und entsorgen Sie sie. Waschen Sie die Organoide 2x mit 70% Ethanol.
  7. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche alle bis auf 50-100 μL Ethanol aus dem Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen beiseite.
  8. Legen Sie eine Tube Probenverarbeitungsgel für ~ 30 s in ein Wasserbad und in die Mikrowelle, um das Gel zu schmelzen. Stellen Sie sicher, dass das Probenverarbeitungsgel nicht überkocht, indem Sie die Konsistenz des Gels überwachen.
    HINWEIS: Sobald das Probenverarbeitungsgel geschmolzen ist, aber nicht kochend heiß, arbeiten Sie schnell, um die Organoide zu verkapseln.
  9. Übertragen Sie genügend Probenverarbeitungsgel, um die gesamte Oberfläche der Form (ca. 250 μL) zu bedecken.
  10. Während das Probenverarbeitungsgel noch geschmolzen ist, übertragen Sie schnell die 50 μL 70%ige Ethanollösung, die die Organoide enthält. Stellen Sie sicher, dass die Organoide versenkt oder in den unteren Teil der Form gedrückt werden.
  11. Legen Sie die Histologieform auf einen Eimer Eis und lassen Sie das Probenverarbeitungsgel abkühlen und erstarren.
  12. Sobald das Probenverarbeitungsgel vollständig getrocknet ist, übertragen Sie das Probenverarbeitungsgel vorsichtig in einen Probenbeutel und behalten Sie die Ebene im Auge, in der sich die Organoide befinden.
  13. Legen Sie den Beutel in eine Histologiekassette und verarbeiten Sie ihn unter Verwendung von Standardmethoden, die für die Formalinfixierung und die Paraffineinbettung von Gewebenverwendet werden 18.
  14. Nach der Fixierung und Einbettung in Paraffin wird mit einem Mikrotom19 in 5-μm-Abschnitte geschnitten. Fahren Sie mit Standard-Hämatoxylin- und Eosin-Färbungs- oder Immunfärbungsverfahren fort, wie unten beschrieben.

6. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung

  1. Entparaffinieren Sie die Abschnitte wie folgt: Xylol, 2 x 10 min; 100% Ethanol, 2 x 3 min; 80% Ethanol, 3 min; 60% Ethanol, 3 min; dH2O, 2 x 3 min; 1 min in Hämatoxylin; Leitungswasser (3 x 5 s); 1 min in Eosin.
  2. Die Abschnitte wie folgt entwässern: 60% Ethanol, 3 min; 80% Ethanol, 3 min; 95% Ethanol, 3 min; 100% Ethanol, 2 x 3 min; Xylol, 2 x 15 Min.
  3. Montage mit Montagemedium.

7. Immunfluoreszenzfärbung

  1. Entparaffinieren Sie die Abschnitte, wie in Schritt 6.1 beschrieben.
  2. Antigen-Retrieval durchführen
    1. Tauchen Sie die Objektträger in Antigen-Retrieval-Lösung in einem mikrowellengeeigneten Behälter.
    2. Mikrowelle bei hoher Hitze für 20 Minuten in Intervallen von 5 Minuten, um sicherzustellen, dass die Lösung nicht überkocht.
  3. Nachdem der 20-minütige Antigen-Retrieval-Schritt abgeschlossen ist, lassen Sie die Objektträger 40 Minuten lang auf Eis abkühlen, während sie noch in den Antigen-Retrieval-Puffer getaucht sind.
  4. Waschen Sie die Objektträger mit 1x TBST für 3 min
  5. Blockieren Sie die Objektträger, indem Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur in 3% BSA in TBST inkubieren.
  6. Inkubation mit primären Antikörpern
    1. Verdünnen Sie den Antikörper in 3% BSA in TBST (1:50-1:1.000, abhängig von Ab).
    2. Über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer brüten.
    3. 3 x 5 min mit TBST waschen.
  7. Inkubation von sekundären Antikörpern
    1. Verdünnen Sie den Antikörper in 3% BSA (in TBST) (1:250) oder in 5% normalem Eselserum.
    2. Inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln, da der Antikörper an ein Fluorophor konjugiert ist.
  8. Nukleare Färbung
    1. Verdünntes 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) 1:1.000 in TBST.
    2. Inkubieren Sie für 5 min bei RT.
    3. 2 x 5 min mit TBST waschen.
  9. Montage
    1. Verwenden Sie einen Tropfen Montagemedium, um das Deckglas zu montieren.
    2. Versiegeln Sie das Deckglas am nächsten Tag mit Nagellack.

Ergebnisse

Phasenkontrastaufnahmen von Endometrium-Organoiden der Maus
Wir haben Organoide aus dem WT-Maus-Endometriumepithel etabliert, wie im beigefügten Protokoll beschrieben (siehe Diagramm in Abbildung 1). Nach der enzymatischen Dissoziation des Endometrialepithels der Maus wurden die Epithelschichten mechanisch von den Stromazellen der Gebärmutter getrennt und weiter mit Kollagenase dissoziiert, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Bei korrekter Durchführung sollte die...

Diskussion

Hier beschreiben wir Methoden zur Erzeugung von Endometriumepithel-Organoiden aus dem Endometrium der Maus und die Protokolle, die routinemäßig für ihre nachgeschaltete Analyse verwendet werden. Endometrium-Organoide sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Mechanismen zu untersuchen, die Endometrium-bedingte Erkrankungen wie Endometriose, Endometriumkarzinom und Implantationsversagen kontrollieren. Bahnbrechende Studien, die 2017 veröffentlicht wurden, berichteten über die Bedingungen für die Kultivierung langf...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Stephanie Pangas und Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) für die kritische Lektüre und Bearbeitung unseres Manuskripts. Die Studien wurden durch die Zuschüsse R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.M.) und R01-HD110038 (M.M.M.) sowie durch NCI-P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123) unterstützt. Diana Monsivais, Ph.D. erhält einen Next Gen Schwangerschaftspreis des Burroughs Wellcome Fund.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Organoid Media Formulation
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-freeCorning354230100%
Trypsin from Bovine PancreasSigma AldrichT1426-1G1%
Advanced DMEM/F12Life Technologies126340101X
N2 supplementLife Technologies175020481X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin ALife Technologies125870101X
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165-5G1.25 mM
L-glutamineLife Technologies250300242 mM
NicotinamideSigma AldrichN0636-100G10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01Tocris2939500 nM
Recombinant human EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
Recombinant human NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1Peprotech120-38500 ng/mL
Recombinant human FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
Recombinant human HGFPeprotech100-3950 ng/mL
WNT3aR&D systems5036-WN200 ng/mL
Other supplies and reagents
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma AldrichC0130-1G5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma AldrichDN25-100MG2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesiumThermoFisher14190-2501X
HBSS, no calcium, no magnesiumThermoFisher141701121X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well)Fisher Scientific#08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well)Fisher Scientific#0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µmFisher Scientific#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg)Genesee Scientific11-331
Trizol reagentInvitrogen15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol redThermoFisher11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal strippedSigma AldrichF6765-500ML2%
Estratiol (E2)Sigma AldrichE1024-1G10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM GradeVWR157104%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue CassettesFisher Scientific1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base MoldsFisher Scientific64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%)Fisher Scientific22-032-601 
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Permount Mounting MediumFisher Scientific50-277-97
Epredia Nylon Biopsy BagsFisher Scientific6774010
HistoGel Specimen Processing GelVWR83009-992
Hematoxylin solution PremiumVWR95057-844
Eosin Y (yellowish) solution PremiumVWR95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4GenDEPORTT80541X
TBST (10X), pH 7.4GenDEPORTT80561X
Citric acid Sigma AldrichC0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrateSigma AldrichS4641-500G
Tween20Fisher ScientificBP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-100G3%
DAPI Solution (1 mg/mL)ThermoFisher622481:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LabsH-1000-10
Clear Nail PolishFisher ScientificNC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific22037246
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-106
SuperScript VILO Master MixThermoFisher11755050
SYBR Green PCR Master MixThermoFisher4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I) DSHBTROMA-I 1:50 dilution
Vimentin AntobodyCell Signaling5741S1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		ThermoFisherA-212091:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		ThermoFisherA-212061:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo MicroscopeZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital cameraZEISS
Primer SequenceForward (5'-3')Reverse (5'-3')_
Lipocalin 2 (Lcn2)GCAGGTGGTACGTTGTGGGCTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf)TGAGGCCCTTGGACTCTGTACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr)CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTCTAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)CAATGTGTCCGTCGTGGATCTGCCTGCTTCACCACCTTCTT

Referenzen

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