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  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit des méthodologies pour établir des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de souris pour l’expression génique et les analyses histologiques.

Résumé

Le tissu endométrial tapisse la cavité interne de l’utérus et est sous le contrôle cyclique de l’œstrogène et de la progestérone. C’est un tissu composé d’épithélium luminal et glandulaire, d’un compartiment stromal, d’un réseau vasculaire et d’une population complexe de cellules immunitaires. Les modèles murins ont été un outil puissant pour étudier l’endomètre, révélant des mécanismes critiques qui contrôlent l’implantation, la placentation et le cancer. Le développement récent de cultures organoïdes endométriales 3D présente un modèle de pointe pour disséquer les voies de signalisation qui sous-tendent la biologie de l’endomètre. L’établissement d’organoïdes endométriaux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés, l’analyse de leurs transcriptomes et la visualisation de leur morphologie à une résolution unicellulaire sont des outils cruciaux pour l’étude des maladies de l’endomètre. Cet article décrit les méthodes permettant d’établir des cultures 3D d’épithélium endométrial à partir de souris et décrit des techniques pour quantifier l’expression des gènes et analyser l’histologie des organoïdes. L’objectif est de fournir une ressource qui peut être utilisée pour établir, cultiver et étudier l’expression génique et les caractéristiques morphologiques des organoïdes épithéliaux de l’endomètre.

Introduction

L’endomètre - le tissu muqueux interne de la muqueuse de la cavité utérine - est un tissu unique et très dynamique qui joue un rôle essentiel dans la santé reproductive d’une femme. Au cours de la vie reproductive, l’endomètre a le potentiel de subir des centaines de cycles de prolifération, de différenciation et de dégradation, coordonnés par l’action concertée des hormones ovariennes - œstrogènes et progestérone. Des études sur des souris génétiquement modifiées ont révélé des mécanismes biologiques de base qui sous-tendent la réponse endométriale aux hormones et le contrôle de l’implantation des embryons, de la décidualisation des cellules stromales et de la grossesse1. Les études in vitro, cependant, ont été limitées en raison des difficultés à maintenir les tissus primaires de l’endomètre de souris non transformés dans les cultures cellulaires 2D traditionnelles 2,3. Les progrès récents dans la culture de tissus endométriaux en tant que systèmes d’organes 3D, ou organoïdes, présentent une nouvelle opportunité d’étudier les voies biologiques qui contrôlent la régénération et la différenciation des cellules endométriales. Des systèmes organoïdes de l’endomètre de souris et d’homme ont été développés à partir d’épithélium endométrial pur encapsulé dans diverses matrices4,5, tandis que l’endomètre humain a été cultivé sous forme de co-cultures épithéliales/stromales sans échafaudage6,7, et plus récemment sous forme d’assemblages épithéliaux/stromaux encapsulés dans du collagène8 . Le potentiel de croissance et de régénération des cultures organoïdes épithéliales est soutenu par un cocktail défini de facteurs de croissance et d’inhibiteurs de petites molécules qui ont été déterminés empiriquement pour maximiser la croissance et la régénération des organoïdes 4,5,9. De plus, la capacité de congeler et de décongeler les organoïdes de l’endomètre permet la mise en banque à long terme d’organoïdes endométriaux provenant de souris et d’humains pour des études futures.

Des souris génétiquement modifiées ont révélé les voies de signalisation complexes qui contrôlent la grossesse précoce et la décidualisation, et ont été utilisées comme modèles de perte de grossesse, de cancer de l’endomètre et d’endométriose. Ces études génétiques ont été réalisées en grande partie avec la délétion spécifique à la cellule des allèles flanqués de loxP (« floxed ») en utilisant des recombinases cre qui sont spécifiquement actives dans les tissus reproducteurs femelles. Ces modèles murins comprennent le récepteur de progestérone-cre 10 largement utilisé, qui a une forte activité de recombinase dans les tissus épithéliaux et stromaux de l’endomètre, la lactoferrine i-cre, qui induit la recombinaison épithéliale de l’endomètre chez les souris adultes11, ou Wnt7a-cre, qui déclenche une délétion épithéliale spécifique dans les tissus dérivés de Müller12 . La culture de tissus endométriaux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés en tant qu’organoïdes 3D a fourni une excellente occasion d’étudier la biologie de l’endomètre et de faciliter l’identification des facteurs de croissance et des voies de signalisation qui contrôlent le renouvellement et la différenciation des cellules endométriales13,14. Les méthodes d’isolement et de culture du tissu endométrial de souris sont décrites dans la littérature et rapportent l’utilisation de diverses stratégies enzymatiques pour l’isolement de l’épithélium utérin pour la culture ultérieure d’organoïdes épithéliaux de l’endomètre4. Alors que la littérature précédente fournit un cadre critique pour les protocoles de culture organoïde épithéliale de l’endomètre 4,5,6, cet article fournit une méthode claire et complète pour générer, maintenir, traiter et analyser ces organoïdes. La normalisation de ces techniques est importante pour accélérer les progrès dans le domaine de la biologie de la reproduction des femmes. Ici, nous rapportons une méthodologie détaillée pour la purification enzymatique et mécanique du tissu épithélial de l’endomètre de souris pour la culture ultérieure d’organoïdes de l’endomètre dans un échafaudage à matrice de gel. Nous décrivons également les méthodologies pour les analyses histologiques et moléculaires en aval des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de souris encapsulés dans la matrice de gel.

Protocole

La manipulation de souris et les études expérimentales ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) du Baylor College of Medicine et aux lignes directrices établies par le Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire.

1. Isolement de l’épithélium utérin de souris à l’aide de méthodes enzymatiques et mécaniques

REMARQUE : Cette section décrit les étapes requises pour établir, passer, congeler et décongeler les organoïdes épithéliaux de l’endomètre provenant de souris à l’aide d’un échafaudage à matrice de gel. Des études antérieures ont déterminé que des cultures optimales d’organoïdes endométriaux de souris sont établies à partir de souris pendant la phase4 de l’oestrus, ce qui peut être déterminé par l’examen cytologique d’un écouvillonnage vaginal15. Des souris WT femelles adultes (âgées de 6 à 8 semaines, hybrides C57BL/6J et 129S5/SvEvBrd) ont été utilisées pour toutes les expériences. Les souris ont été euthanasiées sans cruauté selon les directives approuvées par l’IACUC en utilisant une sédation à l’isoflurane suivie d’une désarticulation cervicale. Une fois les souris euthanasiées, les étapes suivantes doivent être suivies. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les matériaux et les solutions utilisés dans ce protocole.

  1. Laisser la matrice de gel décongeler sur la glace pendant environ 1-2 h avant utilisation.
  2. Pour disséquer la souris, utilisez des ciseaux pour faire une incision médiane sur l’abdomen et décollez doucement la peau pour exposer la couche péritonéale sous-jacente. Utilisez des pinces pour maintenir la couche péritonéale et faites des incisions latérales avec les ciseaux pour exposer le contenu abdominal.
    1. Localisez les cornes utérines en déplaçant doucement les coussinets graisseux abdominaux de côté. Disséquez-les en les tenant d’abord à la jonction cervicale et en utilisant des ciseaux pour couper le long de la graisse mésentérique. Après la dissection de l’utérus de souris, retirez soigneusement le tissu adipeux de la corne utérine avec de petits ciseaux.
      REMARQUE: Maintenir la stérilité pendant l’isolement cellulaire en stérilisant tous les outils chirurgicaux avant utilisation, pulvériser l’abdomen de la souris avec de l’éthanol à 70% et effectuer toutes les étapes suivant la dissection sous une capuche de culture tissulaire stérile.
  3. Coupez chaque corne utérine en petits fragments, chacun mesurant environ 4-5 mm.
  4. Placez tous les fragments utérins d’un utérus dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant 0,5 mL de trypsine à 1%. Permettre à la solution enzymatique de pénétrer dans la lumière utérine, provoquant une séparation enzymatique de l’épithélium endométrial du stroma sous-jacent.
  5. Incuber la plaque de 24 puits dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 °C pendant environ 1 h.
  6. Après 1 h d’incubation, transférer les fragments utérins dans une plaque de culture tissulaire de 35 mm contenant 1 mL de solution tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco.
  7. Au microscope à dissection, utiliser une pince fine et une pipette de 1 mL pour séparer mécaniquement l’épithélium utérin de la trompe utérine. Tout en maintenant enfoncée une extrémité d’un fragment utérin avec la pince, passez doucement l’embout de la pipette longitudinalement sur le fragment, en pressant l’épithélium hors de l’autre extrémité de la trompe utérine. Observez les feuillets épithéliaux séparés du fragment utérin au microscope à dissection.
  8. Utilisez la pipette de 1 mL pour recueillir et transférer délicatement les feuillets épithéliaux dans un tube de 1,5 mL.
  9. Répétez le processus pour les fragments utérins restants, en transférant toutes les feuilles épithéliales dans le même tube de collecte.
  10. Enduire les feuillets épithéliaux dissociés par centrifugation pendant 5 min à 375 × g.
  11. Retirez délicatement le surnageant pour éviter de déranger la pastille de cellule.
  12. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 0,5 mL de collagénase à 2,5 mg/mL + 2 mg/mL de solution de DNase. Pipeter de haut en bas environ 10x, ou jusqu’à ce qu’une suspension unicellulaire soit obtenue.
  13. Ajouter 0,5 mL de DMEM/F12 + 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) + antibiotiques, et centrifuger les cellules pendant 5 min à 375 × g.
    REMARQUE : Pour obtenir de plus amples renseignements sur l’antibiotique à large spectre utilisé pour la culture cellulaire, veuillez consulter le tableau des matériaux.
  14. Retirez délicatement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 1 mL de DMEM/F12 + 10 % FBS + antibiotiques. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 375 × g.

2. Traitement du compartiment stromal

REMARQUE: Cette section décrit les protocoles nécessaires pour isoler le compartiment stromal de l’endomètre de souris. Compte tenu de l’intérêt croissant pour les expériences de co-culture épithéliale/stromale, il est important de pouvoir traiter les populations de cellules stromales en plus des cellules épithéliales qui généreront des organoïdes.

  1. Une fois que tout l’épithélium a été séparé enzymatiquement et mécaniquement des fragments utérins, les structures restantes en forme de trompe sont les compartiments « stromaux / myométrial ». Recueillir ce tissu dans une collagénase de 2,5 mg/mL + 2 mg/mL de DNase dans une solution HBSS.
  2. Incuber l’échantillon stromal/myométrial sur un agitateur à 37 °C pendant 15 min.
  3. Après l’incubation, ajouter 500 μL de DMEM/F12 + 10 % FBS + antibiotiques par souris et filtrer les fragments non dissociés à travers un filtre cellulaire de 40 μm.
  4. Enduire les cellules par centrifugation pendant 5 min à 375 × g.
  5. Retirez délicatement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de DMEM/F12 + 10 % FBS + antibiotiques. Ajouter le mélange goutte à goutte à 10 mL de DMEM/F12 + 10% FBS + antibiotiques dans une plaque de culture cellulaire de 10 cm. Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié.
  6. Pour générer des co-cultures de cellules épithéliales et stromales de l’endomètre de souris, suivre les méthodes décrites pour les organoïdes de l’endomètre humain utilisant des systèmes matriciels sans échafaudage ou de collagène 6,8.
    NOTE: Bien que ces techniques n’aient pas encore été publiées pour les souris, elles peuvent être adaptées en fonction des protocoles publiés avec l’endomètre humain.

3. Encapsulation de l’épithélium utérin dans une matrice de gel pour établir des organoïdes

REMARQUE: Gardez la matrice de gel sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.

  1. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans un volume de matrice de gel 20 fois celui de la pastille de cellule (c.-à-d. si la pastille de cellule est de 20 μL, remettre les cellules en suspension avec 400 μL de matrice de gel). Remettez soigneusement le granulé en suspension pour éviter d’introduire des bulles.
  2. Laisser la suspension de la matrice/cellule de gel se déposer à température ambiante pendant ~10 min.
  3. Une fois que la suspension de matrice/cellule de gel devient un gel semi-solide, utilisez une micropipette P200 avec une pointe de 200 μL de large alésage pour aspirer doucement 25 μL de la suspension de matrice/cellule de gel. Distribuer trois dômes distincts de 25 μL par puits d’une plaque de 12 puits et laisser durcir la matrice de gel pendant 15 minutes dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 °C.
  4. Une fois que la matrice de gel a durci, ajouter 750 μL de milieu organoïde à chaque puits contenant des dômes de matrice de gel. Incuber à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire humidifié.
    REMARQUE : La formulation des milieux organoïdes est indiquée dans le tableau des matériaux. Les organoïdes se forment généralement dans les 4 jours suivant la culture initiale.

4. Analyse de l’expression génique des organoïdes de l’endomètre après un traitement à l’œstradiol

REMARQUE : Cette section décrit les méthodes utilisées pour établir le profil de l’expression génique des organoïdes épithéliaux de l’endomètre à l’aide de la qPCR en temps réel après un traitement à l’œstradiol (E2; voir le tableau 1). Parce que l’endomètre est sous le contrôle cyclique de l’hormone ovarienne E2, tester la réactivité des organoïdes à E2 est une mesure importante de la fonction physiologique. Nous avons obtenu un ARN de haute qualité et généré suffisamment d’ARNm pour profiler l’expression génique en utilisant la qPCR et / ou le séquençage de l’ARN de nos organoïdes épithéliaux de l’endomètre. Cette section décrit comment collecter des organoïdes et les traiter pour l’analyse en aval de l’expression génique. Le milieu de traitement choisi reflète celui utilisé pour traiter les cellules endométriales en culture. Cependant, il convient de noter que ce milieu de traitement peut être optimisé en conséquence, comme pour le traitement des cultures 3D de l’endomètre humain avec des hormones 8,16,17.

  1. Culture des organoïdes de l’endomètre comme décrit ci-dessus.
  2. Retirer le milieu organoïde et le remplacer par 750 μL de milieu de famine quatre jours après l’ensemencement. Incuber pendant la nuit.
  3. Le lendemain matin, retirez le milieu de famine. Ajouter 750 μL de milieu de traitement contenant soit du véhicule, soit 10 nM d’E2. Incuber pendant 48 h.
  4. Procéder à l’isolement de l’ARN en suivant le protocole du fabricant du kit.

5. Analyse histologique des organoïdes endométriaux

REMARQUE: L’imagerie des caractéristiques morphologiques des organoïdes de l’endomètre est essentielle pour évaluer l’effet cellulaire des facteurs de croissance, des manipulations génétiques ou des inhibiteurs de petites molécules. Cette section décrit les techniques utilisées pour fixer, traiter et imager les organoïdes épithéliaux de l’endomètre à l’aide de colorations histologiques et de coloration immunofluorescente par anticorps.

  1. Préparer des tubes microcentrifuges de 1,5 mL contenant 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans 1x PBS. Placez-les sur de la glace.
  2. Aspirer le milieu des puits de la plaque de 12 puits contenant les organoïdes.
  3. À l’aide d’un embout de pipette de 1 mL avec un embout coupé, transférer 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits et détacher délicatement les dômes de la matrice de gel du fond de la plaque.
  4. Aspirer doucement les dômes entiers de la matrice de gel dans l’embout de la pipette et transférer dans le tube microcentrifuge de 1,5 mL.
  5. Fixez les organoïdes en les plaçant sur un rotateur à 4 °C pendant une nuit.
  6. Le lendemain matin, centrifuger le tube à 600 × g pendant 5 min pour enduire les organoïdes. Retirer délicatement la solution de paraformaldéhyde à 4 % à l’aide d’une pipette et jeter. Lavez les organoïdes 2x avec de l’éthanol à 70%.
  7. Après le dernier lavage, retirez tout sauf 50-100 μL d’éthanol du tube. Mettez le tube de côté.
  8. Placez un tube de gel de traitement des échantillons dans un bain-marie et micro-ondes pendant ~30 s pour faire fondre le gel. Assurez-vous que le gel de traitement de l’échantillon ne déborde pas en surveillant la consistance du gel.
    REMARQUE: Une fois que le gel de traitement de l’échantillon est fondu, mais pas bouillant, travaillez rapidement pour encapsuler les organoïdes.
  9. Transférer suffisamment de gel de traitement d’échantillon pour couvrir toute la surface du moule (environ 250 μL).
  10. Pendant que le gel de traitement de l’échantillon est encore fondu, transférer rapidement la solution d’éthanol à 50 μL à 70 % contenant les organoïdes. Assurez-vous que les organoïdes sont enfoncés ou poussés vers la partie inférieure du moule.
  11. Placez le moule histologique sur un seau de glace et laissez le gel de traitement de l’échantillon refroidir et se solidifier.
  12. Une fois que le gel de traitement de l’échantillon est complètement sec, transférez soigneusement le carré de gel de traitement de l’échantillon dans un sac à échantillons, en gardant une trace du plan où se trouvent les organoïdes.
  13. Placer le sac dans une cassette histologique et procéder en utilisant des méthodes standard utilisées pour la fixation du formol et l’incorporation de paraffine dans les tissus18.
  14. Après fixation et encastrement dans la paraffine, couper en sections de 5 μm à l’aide d’un microtome19. Procéder aux procédures standard de coloration ou d’immunomarquage à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E), comme indiqué ci-dessous.

6. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine

  1. Déparaffiner les sections comme suit : xylène, 2 x 10 min; 100% éthanol, 2 x 3 min; 80% d’éthanol, 3 min; 60% d’éthanol, 3 min; dH2O, 2 x 3 min; 1 min dans l’hématoxyline; eau du robinet (3 x 5 s); 1 min en éosine.
  2. Déshydrater les sections comme suit: 60% d’éthanol, 3 min; 80% d’éthanol, 3 min; 95% d’éthanol, 3 min; 100% éthanol, 2 x 3 min; xylène, 2 x 15 min.
  3. Montage à l’aide d’un support de montage.

7. Coloration par immunofluorescence

  1. Déparaffinisez les sections comme décrit à l’étape 6.1.
  2. Effectuer la récupération de l’antigène
    1. Immergez les lames dans une solution de récupération d’antigène dans un récipient allant au micro-ondes.
    2. Micro-ondes à feu vif pendant 20 min, en utilisant des intervalles de 5 minutes pour s’assurer que la solution ne déborde pas.
  3. Une fois l’étape de récupération de l’antigène de 20 minutes terminée, laissez les lames refroidir sur la glace pendant 40 minutes tout en étant immergées dans un tampon de récupération de l’antigène.
  4. Lavez les lames avec 1x TBST pendant 3 min
  5. Bloquer les lames en incubant dans 3% BSA dans TBST pendant 1 h à température ambiante.
  6. Incubation d’anticorps primaires
    1. Diluer l’anticorps dans 3% BSA dans TBST (1:50-1:1 000, selon Ab).
    2. Incuber pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
    3. Laver 3 x 5 min avec TBST.
  7. Incubation d’anticorps secondaires
    1. Diluer l’anticorps dans 3% BSA (dans TBST) (1:250), ou dans 5% de sérum d’âne normal.
    2. Incuber pendant 1 h à température ambiante (RT) dans l’obscurité, car l’anticorps est conjugué à un fluorophore.
  8. Coloration nucléaire
    1. Diluer le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) 1:1 000 dans le TBST.
    2. Incuber pendant 5 min à TA.
    3. Lavez 2 x 5 min avec TBST.
  9. Montage
    1. Utilisez une goutte de support de montage pour monter la lame.
    2. Scellez le couvercle à l’aide de vernis à ongles le lendemain.

Résultats

Images à contraste de phase d’organoïdes endométriaux de souris
Nous avons établi des organoïdes à partir de l’épithélium de l’endomètre de souris WT, comme décrit dans le protocole ci-joint (voir schéma de la figure 1). Après la dissociation enzymatique de l’épithélium de l’endomètre de souris, les feuillets épithéliaux ont été séparés mécaniquement des cellules stromales utérines et dissociés avec la collagénase pour générer une susp...

Discussion

Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des organoïdes épithéliaux de l’endomètre de l’endomètre de souris et les protocoles couramment utilisés pour leur analyse en aval. Les organoïdes de l’endomètre sont un outil puissant pour étudier les mécanismes qui contrôlent les maladies liées à l’endomètre, telles que l’endométriose, le cancer de l’endomètre et l’échec de l’implantation. Des études marquantes publiées en 2017 ont rapporté les conditions de culture à long terme et r...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions la Dre Stephanie Pangas et le Dr Martin M. Matzuk (M.M.M.) pour la lecture critique et la révision de notre manuscrit. Les études ont été soutenues par les subventions R00-HD00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.M.) et R01-HD110038 (M.M.M.), et par la subvention de soutien du centre de cancérologie NCI-P30 (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. est titulaire d’un prix Next Gen Pregnancy du Burroughs Wellcome Fund.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Organoid Media Formulation
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-freeCorning354230100%
Trypsin from Bovine PancreasSigma AldrichT1426-1G1%
Advanced DMEM/F12Life Technologies126340101X
N2 supplementLife Technologies175020481X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin ALife Technologies125870101X
PrimocinInvivogenant-pm-1100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165-5G1.25 mM
L-glutamineLife Technologies250300242 mM
NicotinamideSigma AldrichN0636-100G10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01Tocris2939500 nM
Recombinant human EGFPeprotechAF-100-1550 ng/mL
Recombinant human NogginPeprotech120-10C100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1Peprotech120-38500 ng/mL
Recombinant human FGF-10Peprotech100-26100 ng/mL
Recombinant human HGFPeprotech100-3950 ng/mL
WNT3aR&D systems5036-WN200 ng/mL
Other supplies and reagents
NameCompanyCatalog NumberFinal concentration
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma AldrichC0130-1G5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma AldrichDN25-100MG2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesiumThermoFisher14190-2501X
HBSS, no calcium, no magnesiumThermoFisher141701121X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well)Fisher Scientific#08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well)Fisher Scientific#0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µmFisher Scientific#08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg)Genesee Scientific11-331
Trizol reagentInvitrogen15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol redThermoFisher11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal strippedSigma AldrichF6765-500ML2%
Estratiol (E2)Sigma AldrichE1024-1G10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM GradeVWR157104%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue CassettesFisher Scientific1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base MoldsFisher Scientific64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%)Fisher Scientific22-032-601 
HistoclearFisher Scientific50-899-90147
Permount Mounting MediumFisher Scientific50-277-97
Epredia Nylon Biopsy BagsFisher Scientific6774010
HistoGel Specimen Processing GelVWR83009-992
Hematoxylin solution PremiumVWR95057-844
Eosin Y (yellowish) solution PremiumVWR95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4GenDEPORTT80541X
TBST (10X), pH 7.4GenDEPORTT80561X
Citric acid Sigma AldrichC0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrateSigma AldrichS4641-500G
Tween20Fisher ScientificBP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-100G3%
DAPI Solution (1 mg/mL)ThermoFisher622481:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LabsH-1000-10
Clear Nail PolishFisher ScientificNC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific22037246
VWR Micro Cover GlassesVWR48393-106
SuperScript VILO Master MixThermoFisher11755050
SYBR Green PCR Master MixThermoFisher4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I) DSHBTROMA-I 1:50 dilution
Vimentin AntobodyCell Signaling5741S1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		ThermoFisherA-212091:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		ThermoFisherA-212061:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo MicroscopeZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital cameraZEISS
Primer SequenceForward (5'-3')Reverse (5'-3')_
Lipocalin 2 (Lcn2)GCAGGTGGTACGTTGTGGGCTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf)TGAGGCCCTTGGACTCTGTACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr)CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTCTAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh)CAATGTGTCCGTCGTGGATCTGCCTGCTTCACCACCTTCTT

Références

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
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  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
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