JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم عزل الخلايا preadipocytes من الجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البنية بين الكتفين من الفئران حديثي الولادة ومتمايزة إلى خلايا تتراكم قطرات الدهون ، وتعبر عن العلامات الجزيئية ، وتظهر مورفولوجيا الميتوكوندريا للخلايا الشحمية البنية الناضجة. يتم تحليل هذه الخلايا بشكل أكبر عن طريق المجهر المناعي والمجهر الإلكتروني النافذ.

Abstract

الأنسجة الدهنية البنية (BAT) موجودة فقط في الثدييات ولها وظيفة حرارية. تتميز الخلايا الشحمية البنية بسيتوبلازم متعدد العينين مع قطرات دهنية متعددة ، ونواة مركزية ، ومحتوى عالي من الميتوكوندريا ، وتعبير عن فصل البروتين 1 (UCP1). تم اقتراح BAT كهدف علاجي محتمل للسمنة والاضطرابات الأيضية المرتبطة بها بسبب قدرتها على تبديد الطاقة الأيضية كحرارة. للتحقيق في وظيفة BAT وتنظيمها ، لا غنى عن زراعة الخلايا الشحمية البنية. يعمل البروتوكول الحالي على تحسين معالجة الأنسجة وتمايز الخلايا لزراعة الخلايا الشحمية البنية من الفئران حديثي الولادة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض إجراءات تصوير الخلايا الشحمية المتمايزة مع كل من التألق المناعي متحد البؤر والمجهر الإلكتروني النافذ. في الخلايا الشحمية البنية المتباينة مع التقنيات الموصوفة هنا ، يتم الحفاظ على السمات المميزة الرئيسية ل BAT الكلاسيكية ، بما في ذلك مستويات UCP1 العالية ، وزيادة كتلة الميتوكوندريا ، والاتصال الجسدي الوثيق جدا بين قطرات الدهون والميتوكوندريا ، مما يجعل هذه الطريقة أداة قيمة لدراسات BAT.

Introduction

تختلف الأنسجة الدهنية البيضاء والبنية في موقعها التشريحي وأصلها الخلوي ووظيفتها ومورفولوجيتها وكتلتها الكلية. الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) هي خزان الطاقة الفسيولوجية الرئيسي للجسم وتخزن كميات كبيرة من ثلاثي الجلسرين (TAG) في خلايا عالية التخصص تحتوي على قطرة دهنية عملاقة واحدة تحتل معظم حجمها الخلوي1. يطلق تحلل الدهون TAG الأحماض الدهنية الحرة ، التي تدخل الدورة الدموية الجهازية لتلبية متطلبات الطاقة أثناء الصيام أو حالات أخرى من توازن الطاقة السلبي. بالإضافة إلى ذلك ، يفرز WAT منتجات البروتين والدهون ، تسمى adipokines و lipokines ، على التوالي ، والتي لها وظائف تنظيمية أيضية ومناعية وتناسلية ، مما يجعل WAT أكبر نسيج للغدد الصماء في الجسم2.

الأنسجة الدهنية البنية (BAT) هي عضو أصغر بكثير وظيفته الفسيولوجية الرئيسية هي توليد الحرارة غير المرتعش لمنع انخفاض حرارة الجسم. في الفئران والبشر حديثي الولادة ، BAT هو عضو محدد جيدا يقع في الفضاء بين الكتفين. يفتقر البشر البالغون إلى BAT بين الكتفين (iBAT) ؛ ومع ذلك ، فإنهم يطورون مجموعات من الخلايا الشبيهة بالخلايا الشحمية البنية المدمجة في المستودعات التي تتكون في الغالب من WAT. تشترك هذه الخلايا الشحمية "ذات اللون البني في الأبيض" (brite) في السمات المورفولوجية والجزيئية مع الخلايا الشحمية iBAT الكلاسيكية ، ولكن لها أصل خلوي مختلف 3,4.

على عكس الخلايا الشحمية البيضاء ، تحتوي الخلايا الشحمية البنية على قطرات دهنية صغيرة متعددة وميتوكوندرياوفيرة 5. يتم التعبير عن فصل البروتين 1 (UCP1 ، المعروف أيضا باسم thermogenin) بشكل فريد بواسطة الخلايا الشحمية البنية والبرايت ويتوسط تسرب البروتون في غشاء الميتوكوندريا الداخلي (IMM) ، وبالتالي فصل نقل الإلكترون عن تخليق ATP وتوليد الحرارة. يتم تنشيط توليد الحرارة غير المرتعش في BAT بواسطة بافراز (NE) ، والذي يتم إطلاقه من المحطات الودية في BAT استجابة للتحفيز البارد6. يرتبط NE بمستقبلات بيتا الأدرينالية (معظمها بيتا 3) على سطح الخلايا الشحمية البنية ويؤدي إلى سلسلة إشارات بوساطة cAMP داخل الخلايا. ينتج عن هذا تحلل الدهون TAG ، وأكسدة بيتا لأحماض الميتوكوندريا الدهنية ، وتوليد الحرارة عند تنشيط UCP13. العلاقة الوظيفية الوثيقة بين قطرات الدهون والميتوكوندريا في الخلايا الشحمية البنية لها أوجه تشابه هيكلية ، مثل التفاعل بين هذه العضيات في المناطق الكبيرة ولها اتصال جسدي ضيق للغاية 7,8.

يحتوي iBAT على أوعية دموية وفيرة ومحطات متعاطفة9. هذه الهياكل ، جنبا إلى جنب مع الخلايا preadipocytes ، والخلايا المناعية ، والخلايا الليفية ، وجزيئات المصفوفة خارج الخلية ، تشكل الجزء الوعائي اللحمي الدهني (SVF) 10. تم الإبلاغ عن العديد من البروتوكولات لتوليد الخلايا الشحمية الناضجة من الخلايا preadipocytes11،12،13،14،15 (الجدول التكميلي 1) ؛ ومع ذلك ، فإنها تظهر اختلافات شديدة في معالجة الأنسجة وتكوين وسائط ثقافة التمايز. يسمح البروتوكول الموصوف هنا بالتمايز الفعال والقابل للتكرار للخلايا الشحمية البنية التي (1) تعبر عن عوامل النسخ الشحمية الرئيسية غاما مستقبلات التكاثر بيروكسيسوم المنشط (PPARγ) وبروتين ألفا المرتبط ب CCAAT / المحسن (C / EBPα) ، (2) التعبير عن علامات الخلايا الشحمية الناضجة perilipin1 (PLIN1) ، ومحدد الكتلة 36 (CD36) ، (3) تتراكم قطرات الدهون الوفيرة ، (4) لديها كتلة ميتوكوندريا عالية ووفرة عالية من مجمعات OXPHOS ، (5) لديها إمكانات حرارية ، على النحو الذي تحدده المستويات العالية من UCP1 ، و (6) لديها تغيرات مورفولوجية في الميتوكوندريا مرتبطة بالنمط الظاهري للخلايا الشحمية البنية الناضجة. تستخدم هذه المنهجية لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء الحثل الشحمي المعمم15،16،17.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في الجامعة البابوية الكاثوليكية في تشيلي. تم استخدام الفئران حديثي الولادة P0.5 من كلا الجنسين ، المشتقة من خلفية مختلطة من سلالات C57BL / 6J و 129J ، لهذه الدراسة.

1. استخراج الأنسجة

  1. قم بتنظيف وتطهير طاولة العمل بمحلول إيثانول بنسبة 70٪ ، واستخدم مواد جراحية معقمة.
  2. القتل الرحيم P0.5 الجراء حديثي الولادة عن طريق قطع الرأس بمقص جراحي وفقا للبروتوكول المعتمد مؤسسيا.
  3. ضع الماوس في وضع الانبطاح (متجها لأسفل) ، وقم بعمل شق بطول 1 سم في الجلد في منتصف المستوى من ظهر باستخدام مقص حاد. إزالة الجلد بعناية.
    ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة لأنه إذا لم تتم إزالة الجلد جيدا ، فقد يؤدي ذلك إلى تمزق وتلف iBAT ويحول دون التحضير الأمثل ل SVF.
  4. افصل iBAT جراحيا عن الذبيحة باستخدام مقص صغير.
    ملاحظة: يتم تصور iBAT على شكل فصيصين دهنيين يمكن إزالتهما بشكل مستقل.
  5. احصد كلا فصوص iBAT باستخدام كماشة منحنية لإزالة الفصوص بشكل مستقل.
  6. ضع الفصين في أنبوب بلاستيكي مع 1.5 مل من برنامج تلفزيوني معقم في درجة حرارة الغرفة. الحفاظ على الأنسجة في أنابيبها الفردية حتى يتم الانتهاء من استخراج الأنسجة لجميع الجراء المطلوبة.

2. هضم الأنسجة

  1. القسمة 300 ميكرولتر من الكولاجيناز من النوع الثاني محلول الهضم (0.2٪ كولاجيناز من النوع الثاني في المخزن المؤقت [25 مللي مول KHCO3 ، 1.2 مللي مول MgSO4 ، 120 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 5 مللي مول جلوكوز ، 12 مللي مول KH2PO4 ، 4.8 مللي مول KCl ، 1.2 مللي مول CaCl2 ، 2.5٪ BSA ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، عند درجة حموضة 7.4]) (الجدول 1) في أنابيب 1.5 مل في خزانة السلامة الحيوية.
    ملاحظة: قم بإعداد أنابيب كافية لعدد الأنسجة الفردية المراد استخراجها. في الدراسة الحالية ، تم استخدام سبعة أنابيب ، تقابل فضلات من سبعة جراء.
  2. انتقل إلى المقعد ، وضع فصوص iBAT في محلول هضم كولاجيناز من النوع الثاني لتحلل المصفوفة خارج الخلية.
  3. احتضان مناديل iBAT لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الهز اللطيف المستمر عند 800 دورة في الدقيقة (الشكل 1).

3. معالجة الأنسجة

ملاحظة: بعد عملية الهضم ، قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية في غطاء زراعة أنسجة التدفق الصفحي من الفئة الثانية.

  1. قم بإعداد وتسمية مجموعتين من الأنابيب البلاستيكية سعة 1.5 مل لكل عينة على حدة.
  2. قم بتعطيل تعليق الأنسجة ميكانيكيا في محلول الهضم من النوع الثاني من الكولاجين عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1,000 الدقيقة والأطراف المفلترة. استخدم نصيحة جديدة لكل عينة.
    ملاحظة: هذه خطوة حاسمة. تأكد من تفكيك الأنسجة ميكانيكيا مع الطرف والماصة لأعلى ولأسفل حتى يكتمل التجانس العياني.
  3. مرر الأنسجة المصنفة من خلال مصافي خلايا فردية 100 ميكرومتر (انظر جدول المواد) إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل.
  4. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت ACK (انظر جدول المواد) إلى عينات الأنسجة المفلترة ، واقلب الأنابيب 4-5 مرات ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق.
    ملاحظة: لا تتجاوز وقت الحضانة ، لأن ذلك قد يتلف الخلايا محل الاهتمام.
  5. أجهزة الطرد المركزي عينات الأنسجة في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب الأنبوب ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط الاستزراع (DMEM-F12 مع 10٪ FBS ، 1٪ مضاد حيوي مضاد حيوي ، درجة الحموضة 7.2) (انظر جدول المواد).
  7. مرر المعلقات من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل باستخدام ماصة P1,000 الدقيقة والأطراف المفلترة.
  8. أجهزة الطرد المركزي العينات في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تتوافق الحبيبات مع SVF المحتوي على الخلايا preadipocyte.
  9. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب الأنبوب ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط الاستزراع عن طريق الماصة.
  10. قم بإعداد أنبوب واحد سعة 15 مل لكل عينة بإضافة 5 مل من وسط الاستزراع.
  11. أضف كل حبيبات معلقة إلى أنبوب 15 مل المقابل الذي يحتوي على 5 مل من وسط الاستزراع. اقلب الأنبوب 4-5 مرات لخلط محتوى الخلية.
  12. قم بزرع كل عينة في ستة آبار من صفيحة استزراع مكونة من 24 بئرا بإضافة 1 مل من المعلق إلى كل بئر (الشكل 1).

4. ثقافة الكسر الوعائي اللحمي (SVF)

  1. قم بتغيير وسط الاستزراع كل يوم حتى تصل الخلايا إلى التقاء 100٪.
    ملاحظة: خلال هذه الفترة ، تتم إزالة الخلايا اللاصقة غير البلاستيكية ، مما يؤدي إلى مزرعة أولية غنية ب SVF المحتوي على preadipocyte.
  2. عندما تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 100٪ ، قم بإزالة وسط الثقافة ، واغسل الخلايا ب 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم.
  3. أضف 150 ميكرولتر من 0.25٪ تربسين-EDTA (انظر جدول المواد) إلى كل بئر ، وضع لوحة الاستزراع لمدة 3 دقائق في الحاضنة لفصل الخلايا.
    ملاحظة: تحقق من فصل الخلايا باستخدام مجهر ضوء تباين الطور.
  4. قم بتعطيل التربسين بإضافة 850 ميكرولتر من وسط الاستزراع إلى كل بئر.
  5. اجمع الخلايا من الآبار الستة المصنفة في الخطوة 3.12 ، وانقلها إلى أنبوب سعة 15 مل.
  6. اجعل الحجم الإجمالي يصل إلى 12 مل بإضافة 6 مل من وسط الثقافة. اقلب الأنبوب 4-5 مرات لخلط المحتوى.
  7. بذر 1 مل من العينة في كل بئر من صفيحة 12 بئرا. قم بتغيير وسط الاستزراع كل يوم حتى تصل الخلايا إلى نقطة التقاء.
  8. عندما تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 100٪ ، افصلها ب 150 ميكرولتر من 0.25٪ trypsin-EDTA باتباع نفس ظروف الحضانة كما في الخطوة 4.3 ، وقم بزرعها وفقا لمساحة سطح البئر المطلوبة للتجربة.
  9. قم بإجراء تصوير عالي الدقة بعد إصلاح الخلايا باتباع الخطوة 8.
    ملاحظة: يوصى بكثافة 35000 خلية / سم² لمزيد من التجارب (استخراج البروتين وإجمالي الحمض النووي الريبي ، 330000 خلية [بئر واحد من صفيحة 6 آبار] ؛ التألق المناعي [IF] ، 10500 خلية [بئر واحد من صفيحة 96 بئرا]).

5. التمايز الأديبوجيني

  1. احتضان الخلايا بوسط تحريضي (DMEM-F12 مع 10٪ FBS ، 1٪ مضاد حيوي مضاد حيوي ، درجة الحموضة 7.2 ، مكمل ب 500 نانومتر ديكساميثازون ، 125 نانومتر إندوميتاسين ، 0.5 مللي متر 3-إيزوبوتيل -1-ميثيل زانثين [IBMX] ، 5 ميكرومتر روزيجليتازون ، 1 نانومتر T3 ، و 20 نانومتر الأنسولين) (الجدول 1) لمدة 72 ساعة (اليوم 0 إلى اليوم 2) (الشكل 2).
    ملاحظة: يجب تغيير وسيط الثقافة كل يوم. وبالتالي ، يجب أن يحدث التغيير الوسيط الأول في اليوم 2 بعد الحث الأولي.
  2. التغيير إلى وسط الصيانة (DMEM-F12 مع 10٪ FBS ، 1٪ مضاد حيوي مضاد حيوي ، درجة الحموضة 7.2 ، مكمل ب 5 ميكرومتر روزيجليتازون ، 1 نانومتر T3 ، و 20 نانومتر أنسولين) (الجدول 1) في اليوم الثالث ، والحفاظ على وسط الصيانة هذا حتى اليوم 7 (الشكل 2).
    ملاحظة: يجب تغيير وسيط الصيانة في اليوم 5 واليوم 7. يمكن تصور قطرات الدهون الصغيرة عن طريق الفحص المجهري لتباين الطور من اليوم 3 من التمايز. قطرات الدهون الكبيرة واضحة في اليوم 7 من التمايز. تؤدي إجراءات التمايز التي تزيد مدتها عن 7 أيام إلى فقدان الخلايا عن طريق الانفصال ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى الطفو العالي للخلايا المحملة بالدهون.

6. إعداد التجانس الخلوي

  1. قم بإزالة وسط الثقافة في اليوم 0 واليوم 7 من التمايز ، واغسل الخلايا 3 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني معقم.
  2. بعد التنظيف الأخير ، أضف 1.3 مل من برنامج تلفزيوني معقم لكل بئر.
    ملاحظة: حافظ على الخلايا في الثلج حتى تنظيف اللوحة الأخيرة.
  3. احصد الخلايا ميكانيكيا من بئر واحد من صفيحة 6 آبار (~ 330,000 خلية) باستخدام مكشطة خلية ، وضع التعليق الخلوي في أنبوب سعة 1.5 مل.
  4. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 2800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بإزالة PBS باستخدام micropipette ، وحافظ على الأنابيب على الجليد.
  6. أعد تعليق الحبيبات الخلوية في محلول RIPA باستخدام مثبطات الأنزيم البروتيني والفوسفاتيز (انظر جدول المواد) ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    ملاحظة: لتحليل الحبيبات الخلوية ، يكفي 70-80 ميكرولتر.
  7. أجهزة الطرد المركزي العينات عند 21000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  8. قم بإزالة المادة الطافية بعناية إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، وتخلص من الحبيبات.
    ملاحظة: يمثل العنصر الطافي التجانس الخلوي.
  9. تحديد تركيز البروتين للتجانس الخلوي باستخدام حمض bicinchoninic (BCA) للكشف اللوني والقياس الكمي للبروتينالكلي 18,19.

7. النشاف الغربي

  1. قم بإعداد 30 ميكروغرام من التجانس الخلوي (من الخطوة 6.8) وإضافة مخزن مؤقت لتحميل عينة SDS-PAGE متاح تجاريا (انظر جدول المواد).
  2. حل في هلام بولي أكريلاميد الكهربائي SDS20 (PAGE-SDS) وفقا للوزن الجزيئي لكل بروتين.
    ملاحظة: استخدم 10٪ PAGE-SDS ل PPARγ و C / EBPα و PLIN1 و CD36 و UCP1 و 12٪ PAGE-SDS ل OXPHOS و 15٪ PAGE-SDS ل TOM20 (انظر جدول المواد).
  3. نقل البروتينات كهربائيا إلى غشاء PVDF (انظر جدول المواد) عند 350 مللي أمبير لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: يجب تغيير حاوية الثلج بعد 1 ساعة. خلال العملية برمتها ، والحفاظ على الغرفة على الجليد.
  4. سد الأغشية بنسبة 5٪ BSA أو الحليب الخالي من الدسم في محلول ملحي مخزن من Tris (TBS) 0.1٪ Tween 20 (TBS-T) لمدة ساعتين باتباع التوصيات الواردة في أوراق بيانات الأجسام المضادة.
  5. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة مفصلة في جدول المواد) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تم تخفيف جميع الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة إلى 1: 1000 في محلول الحظر.
  6. اغسل الأغشية 3 مرات بنسبة 0.1٪ TBS-T ، واحتضانها بالجسم المضاد الثانوي المترافق (HRP) (انظر جدول المواد) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  7. اغسل الأغشية 3 مرات بنسبة 0.1٪. تي بي إس-تي. قم بغسلة أخيرة باستخدام 1x TBS. قم بتخزين الأغشية في 1x TBS حتى التصور. يوصى بالتخزين لمدة أقصاها 1 ساعة.
  8. تصور الأغشية عن طريق التلألؤالكيميائي 20 أو أي طريقة أخرى مفضلة.

8. تصوير عالي الدقة

  1. قم بإجراء مقايسة التألق المناعي باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بزرع وتمييز الثقافات الأولية للخلايا البنية من الفئران حديثي الولادة P0.5 (باتباع الخطوة 4.8) في 96 لوحة بئر ذات قاع بصري (انظر جدول المواد).
    2. إصلاح الخلايا في اليوم 0 واليوم 7 من التمايز مع 4 ٪ PFA لمدة 20 دقيقة ، وغسل 3 مرات مع PBS معقمة.
    3. قم بتخلل الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton X-100 لمدة 15 دقيقة ، وقم بحظرها بنسبة 3٪ من جيلاتين السمك (انظر جدول المواد) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    4. اغسل 3 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني معقم ، واحتضنه بجسم مضاد PLIN1 (1: 400 ، انظر جدول المواد) في 1٪ BSA / PBS طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
    5. اغسل 3 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني معقم ، واحتضن بجسم مضاد ثانوي مقترن بالفلوروفور عند 1: 1000 (1٪ BSA / PBS) (انظر جدول المواد) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    6. قم بتلطيخ النوى ب 1 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 وقطرات الدهون ب 1 ميكروغرام / مل BODIPY لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: تم الحصول على صور التألق باستخدام نظام تصوير خلوي (انظر جدول المواد). بشكل عام ، تم الحصول على 9 أو 16 صورة لكل بئر مع قناتين إلى ثلاث قنوات بتكبير 20x.
  2. قم بإجراء الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال باتباع الخطوات أدناه.
    1. تنمو وتميز الخلايا البنية في أطباق زراعة الخلايا 35 مم × 10 مم.
    2. في اليوم 0 واليوم 7 من التمايز ، قم بإزالة الوسط ، وقم بإصلاح الخلايا لمدة 1 ساعة مع 2.5٪ جلوتارالدهيد في 0.1 متر كاكوديلات الصوديوم العازلة ، درجة الحموضة 7.0 (انظر جدول المواد).
    3. اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام 0.05 M من محلول كاكوديلات الصوديوم لمدة 10 دقائق ، وعالجها ب 1٪ من رابع أكسيد الأوزميوم المائي (انظر جدول المواد) لمدة 15 دقيقة.
    4. اغسل الخلايا 3 مرات بالماء المقطر لمدة 5 دقائق ، وعالجها بأسيتات اليورانيل المائية بنسبة 1٪ (انظر جدول المواد) لمدة 15 دقيقة.
    5. قم بتجفيف الخلايا بتدرج الإيثانول بنسبة 30٪ و 50٪ و 70٪ و 95٪ و 100٪ لمدة 5 دقائق في كل مرة.
    6. قم بتضمين الخلايا مسبقا في 1: 1 epon / ethanol لمدة 30 دقيقة ثم في epon لمدة 1 ساعة (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يتم إدراج الخلايا مباشرة في الطبق عن طريق إضافة epon طازج لتغطية الطبقة الأحادية لزراعة الخلايا بالكامل. دع الإيبون يتبلمر في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    7. اغمر طبق زراعة الخلايا في النيتروجين السائل لمدة 2 دقيقة ، ثم كسره باستخدام كماشة لتخفيف الشوائب البلاستيكية.
    8. قم بلصق شرائح التضمين بالخلايا على كتلة من الراتنج للحصول على قطع دقيقة (80 نانومتر) موازية للسطح في ميكروتوم فائق (انظر جدول المواد).
    9. قم بتلطيخ الجروح ب 1٪ من أسيتات اليورانيل المائية لمدة 4 دقائق وسترات الرصاص لمدة 5 دقائق ، وفقا لرينولدز وآخرون 21.
    10. تصور الشبكات في المجهر الإلكتروني (انظر جدول المواد).

النتائج

يتم تنظيم تكوين الدهون من خلال شبكة من عوامل النسخ المسؤولة عن كل من التعبير عن البروتينات الرئيسية التي تحفز تكوين الخلايا الشحمية البنية وعملها22 ، بما في ذلك المنظمات الدهنية الكلاسيكية مثل PPARγ و C / EBPα23،24،25 ، بالإضافة إلى ...

Discussion

البروتوكول الحالي هو إجراء تمايز بسيط وقابل للتكرار على مرحلتين (الشكل 2) لتوليد خلايا ذات خصائص جزيئية ومورفولوجية للخلايا الشحمية البنية الناضجة. الحصاد الجراحي ل iBAT هو الخطوة الأولى الحاسمة لأن تمزق الأنسجة يحد بشدة من صلاحية المواد الأولية. تعد معالجة الأنسجة أمرا أسا...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم توفير التمويل من قبل FONDECYT (1181214 و 1221146) و Anillos (ACT210039) إلى VC ومنح الدكتوراه ANID 21171743 إلى AMF و ANID 21150665 إلى FS. نشكر أليخاندرو مونيزاغا على المساعدة في معالجة العينات والمشورة الفنية للمجهر الإلكتروني النافذ. تم إنتاج الرسوم التوضيحية باستخدام BioRender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Tris/Glycine BufferBioRad1610734
16% Paraformaldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences15710
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture DishFalcon353001
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Calbiochem410957
40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1BioRad1610148
6-well plate SPL Life Science -
96 well optical black w/lid cell culture sterileThermo Scientific165305
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder Maestrogen02102-250
ACK lysing buffer GibcoA10492-01
Ammonium Persulfate BioRad1610700
Antibiotic-antimycoticGibco 15240062
Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling7076
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody  Cell Signaling7074
Blotting-grade blocker BioRad170-6404
BODIPY 493/503 InvitrogenD3922
BSASigmaA1470
C/EBPα antibodyCell Signaling2295
CaCl2Calbiochem 208291
CD36 antibodyInvitrogenPA1-16813
Cell Strainer 100 µm, nylonFalcon352360
Cell Strainer 40 µm, nylonFalcon352340
Collagenase type IIGibco17101-015
Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderBiotek
Dexamethasone SigmaD4902
DMEM/F-12, powderGibco12500062
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)Electron Microscopy Sciences14120
Ethanol absoluteMerck 100983 
Fetal bovine serum Gibco16000-044
Gelatin from cold water fish skinSigmaG7041
GlucoseGibco 15023-021
Glutaraldehyde 25% Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences16210
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11012
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X Thermo Scientific78427
Halt Protease Inhibitor Cocktail 100X Thermo Scientific78429
Hoechst 33258InvitrogenH1398
Immun-Blot PVDF Membrane BioRad1620177
Indomethacin Sigma I7378 
Insulin SigmaI3536
KClCalbiochem 529552
KH2PO4Calbiochem529568
KHCO3Sigma60339
Lane Marker Reducing Sample Buffer Thermo Scientific39000
MgSO4SigmaM2643
MilliQ water sterile --
Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB antibody CocktailAbcam MS604
NaClMerck 1064041000
OmniPur 10x PBS Liquid ConcentrateCalbiochem6505-OP
Osmium Tetroxide Electron Microscopy Sciences19100
Perilipin 1 antibodyCell Signaling9349
PPARγ (81B8) antibodyCell Signaling2443
RIPA buffer lysis Thermo Scientific89901
RosiglitazoneMerck557366
Sodium bicarbonate SigmaS5761
Sodium CacpdylateElectron Microscopy Sciences12300
Sodium Dodecyl Sulfate BioRad1610301
T3SigmaT6397
Talos F200C G2Thermo Scientific
TEMED BioRad1610800
TOM20 antibodyCell Signaling42406
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Cell Signaling12498
Triton X-100 Sigma93443
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200056
Tween 20, Molecular Biology GradePromega H5152
UCP1 antibodyCell Signaling14670
Ultracut RLeica 
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400
Westar Sun CyanagenXLS063
Westar Supernova CyanagenXLS3

References

  1. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
  2. Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 320 (3), 488-495 (2021).
  3. Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Frontiers in Bioscience. 16, 1233-1260 (2011).
  4. Rosenwald, M., Wolfrum, C. The origin and definition of brite versus white and classical brown adipocytes. Adipocyte. 3 (1), 4-9 (2014).
  5. Smorlesi, A., Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. The adipose organ: White-brown adipocyte plasticity and metabolic inflammation. Obesity Reviews. 13, 83-96 (2012).
  6. Townsend, K., Tseng, Y. -. H. Brown adipose tissue: Recent insights into development, metabolic function and therapeutic potential. Adipocyte. 1 (1), 13-24 (2012).
  7. Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
  8. Benador, I. Y., Veliova, M., Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondria bound to lipid droplets: Where mitochondrial dynamics regulate lipid storage and utilization. Cell Metabolism. 29 (4), 827-835 (2019).
  9. Lee, P., Swarbrick, M. M., Ho, K. K. Brown adipose tissue in adult humans: A metabolic renaissance. Endocrine Reviews. 34 (3), 413-438 (2013).
  10. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  11. Klein, J., et al. Beta(3)-adrenergic stimulation differentially inhibits insulin signaling and decreases insulin-induced glucose uptake in brown adipocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (3), 34795-34802 (1999).
  12. Gaom, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
  13. Rocha, A. L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. A Method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes. Bio-protocol. 11 (24), 4265 (2021).
  14. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
  15. Tapia, P. J., et al. Absence of AGPAT2 impairs brown adipogenesis, increases IFN stimulated gene expression and alters mitochondrial morphology. Metabolism. 111, 154341 (2020).
  16. González-Hódar, L., et al. Decreased caveolae in AGPAT2 lacking adipocytes is independent of changes in cholesterol or sphingolipid levels: A whole cell and plasma membrane lipidomic analysis of adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (9), 166167 (2021).
  17. Fernández-Galilea, M., Tapia, P., Cautivo, K., Morselli, E., Cortés, V. A. AGPAT2 deficiency impairs adipogenic differentiation in primary cultured preadipocytes in a non-autophagy or apoptosis dependent mechanism. Biochemical and Biophysical Research Communications. 467 (1), 39-45 (2015).
  18. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-15 (2009).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  20. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  21. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
  22. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
  23. Ambele, M. A., Dhanraj, P., Giles, R., Pepper, M. S. Adipogenesis: A complex interplay of multiple molecular determinants and pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4283 (2020).
  24. Lefterova, M. I., et al. PPARγ and C/EBP factors orchestrate adipocyte biology via adjacent binding on a genome-wide scale. Genes & Development. 22 (21), 2941-2952 (2008).
  25. Ntambi, J. M., Young-Cheul, K. Adipocyte differentiation and gene expression. The Journal of Nutrition. 130 (12), (2000).
  26. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16, 83 (2017).
  27. Christiaens, V., Van Hul, M., Lijnen, H. R., Scroyen, I. CD36 promotes adipocyte differentiation and adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1820 (7), 949-956 (2012).
  28. Carobbio, S., Rosen, B., Vidal-Puig, A. Adipogenesis: New insights into brown adipose tissue differentiation. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (3), 75-85 (2013).
  29. Ricquier, D. Uncoupling protein 1 of brown adipocytes, the only uncoupler: A historical perspective. Frontiers in Endocrinology. 2, 85-91 (2011).
  30. Cui, L., Mirza, A. H., Zhang, S., Liang, B., Liu, P. Lipid droplets and mitochondria are anchored during brown adipocyte differentiation. Protein & Cell. 10 (12), 921-926 (2019).
  31. Hao, L., et al. Indomethacin enhances brown fat activity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 365 (3), 467-475 (2018).
  32. Lehmann, J. M., Lenhard, J. M., Oliver, B. B., Ringold, G. M., Kliewer, S. A. Peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma are activated by indomethacin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3406-3410 (1997).
  33. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  34. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1281-1289 (2004).
  35. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  36. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARgamma agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell Metabolism. 15 (3), 395-404 (2012).
  37. Merlin, J., et al. Rosiglitazone and a β3-adrenoceptor agonist are both required for functional browning of white adipocytes in culture. Frontiers in Endocrinology. 9, 249 (2018).
  38. Fayyad, A. M., et al. Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).
  39. Zennaro, M. -. C., et al. Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action. The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).
  40. Klaus, S., et al. Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression. Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).
  41. Guennoun, A., et al. Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype. Journal of Translational Medicine. 13, 135 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192 1 UCP1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved