Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

요약

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

초록

갈색 지방 조직(BAT)은 포유류에만 존재하며 발열 기능이 있습니다. 갈색 지방세포는 여러 개의 지질 방울이 있는 다엽 세포질, 중심핵, 높은 미토콘드리아 함량 및 결합 해제 단백질 1(UCP1)의 발현을 특징으로 합니다. BAT는 대사 에너지를 열로 발산하는 능력으로 인해 비만 및 관련 대사 장애에 대한 잠재적인 치료 대상으로 제안되었습니다. BAT 기능 및 조절을 연구하기 위해서는 갈색 지방세포 배양이 필수적입니다. 본 프로토콜은 신생아 마우스에서 갈색 지방 세포를 배양하기 위해 조직 처리 및 세포 분화를 최적화합니다. 또한 confocal immunofluorescence 및 transmission electron microscopy를 사용하여 분화된 지방세포를 이미징하는 절차를 보여줍니다. 본 명세서에 기술된 기법으로 분화된 갈색 지방세포에서는 높은 UCP1 수준, 미토콘드리아 질량 증가, 지질 방울과 미토콘드리아 사이의 매우 밀접한 물리적 접촉을 포함하여 기존 BAT의 주요 특징이 보존되어 이 방법을 BAT 연구에 유용한 도구로 만듭니다.

서문

백색과 갈색 지방 조직은 해부학적 위치, 세포 기원, 기능, 형태 및 총 질량이 다릅니다. 백색 지방 조직(WAT)은 신체의 주요 생리적 에너지 저장소이며, 세포 부피의 대부분을 차지하는 단일 거대 지질 방울이 있는 고도로 전문화된 세포에 다량의 트리아실글리세롤(TAG)을 저장합니다¹. TAG 지방 분해는 유리 지방산을 방출하여 단식 또는 기타 음의 에너지 균형 상태에서 에너지 수요를 충족시키기 위해 전신 순환에 들어갑니다. 또한 WAT는 대사, 면역 및 생식 조절 기능을 가진 아디포카인과 리포카인이라고 하는 단백질 및 지질 제품을 각각 분비하므로 WAT는 신체에서 가장 큰 내분비 조직입니다².

갈색 지방 조직(BAT)은 저체온증을 예방하기 위해 떨리지 않는 열발생을 주요 생리적 기능으로 하는 훨씬 작은 장기입니다. 생쥐와 신생아에서 BAT는 견갑간 공간에 위치한 잘 정의된 장기입니다. 성인은 견갑간 BAT(iBAT)가 없습니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 대부분 WAT를 구성하는 저장소에 통합된 갈색 지방세포와 같은 세포의 클러스터를 발달시킵니다. 이러한 "갈색-백색"(brite) 지방세포는 기존의 iBAT 지방세포와 형태학적 및 분자적 특징을 공유하지만 ....

프로토콜

동물 시술은 Pontificia Universidad Católica de Chile의 Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인했습니다. C57BL/6J 및 129J 균주의 혼합 배경에서 파생된 남녀 모두의 P0.5 신생아 마우스가 이 연구에 사용되었습니다.

1. 조직 추출

1. 70% 에탄올 용액으로 작업대를 청소 및 소독하고 멸균 수술 재료를 사용하십시오.
2. P0.5 갓 태어난 새끼를 기관적으로 승인된 프로토콜에 따라 수술용 가위로 참수하여 안락사시킵니다.
3. 마우스를 엎드린 자세(아래를 향함)에 놓고 날카로운 가위를 사용하여 동물의 등 중간 수준 피부를 1cm 길이로 절개합니다. 피부를 조심스럽게 제거하십시오.
   알림: 피부가 잘 제거되지 않으면 iBAT가 찢어지고 손상되어 SVF의 최적 준비를 방해할 수 있기 때문에 이 단계가 중요합니다.
4. 작은 가위를 사용하여 사체에서 iBAT를 외과적으로 분리합니다.
   참고: iBAT는 독립적으로 제거할 수 있는 두 개의 지방소엽으로 시각화됩니다.
5. 곡선형 팁 플라이어를 사용하여 두 iBAT 로브를 모두 수확하여 로브를 독립적으로 제거합니다.....

결과

지방 형성은 갈색 지방 세포 형성을 유도하고 기능하는 주요 단백질의 발현을 담당하는 전사 인자 네트워크에 의해 조절됩니다²² PPARγ 및 C/EBPα 23,24,25와 같은 고전적인 지방 생성 조절제와 성숙한 지방 세포의 마커를 포함합니다 ^26,27. 열발생 갈색 지방 표현형의 ?.......

토론

본 프로토콜은 성숙한 갈색 지방세포의 분자 및 형태학적 특성을 가진 세포를 생성하기 위한 간단하고 복제 가능한 2상 분화 절차(그림 2)입니다. 조직 파괴는 시작 물질의 생존력을 심각하게 제한하기 때문에 iBAT의 외과적 채취는 첫 번째 중요한 단계입니다. 조직 처리도 중요한데, 이물질이 없는 균질한 세포 현탁액은 배양할 수 있는 SVF의 양을 크게 증가시키기 때문입니다.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Tris/Glycine Buffer	BioRad	1610734
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	15710
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish	Falcon	353001
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Calbiochem	410957
40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	1610148
6-well plate	SPL Life Science	-
96 well optical black w/lid cell culture sterile	Thermo Scientific	165305
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Ammonium Persulfate	BioRad	1610700
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7076
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074
Blotting-grade blocker	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
BSA	Sigma	A1470
C/EBPα antibody	Cell Signaling	2295
CaCl2	Calbiochem	208291
CD36 antibody	Invitrogen	PA1-16813
Cell Strainer 100 µm, nylon	Falcon	352360
Cell Strainer 40 µm, nylon	Falcon	352340
Collagenase type II	Gibco	17101-015
Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Biotek
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Ethanol absolute	Merck	100983
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7041
Glucose	Gibco	15023-021
Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16210
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11012
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78427
Halt Protease Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78429
Hoechst 33258	Invitrogen	H1398
Immun-Blot PVDF Membrane	BioRad	1620177
Indomethacin	Sigma	I7378
Insulin	Sigma	I3536
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO3	Sigma	60339
Lane Marker Reducing Sample Buffer	Thermo Scientific	39000
MgSO4	Sigma	M2643
MilliQ water sterile	-	-
Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB antibody Cocktail	Abcam	MS604
NaCl	Merck	1064041000
OmniPur 10x PBS Liquid Concentrate	Calbiochem	6505-OP
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19100
Perilipin 1 antibody	Cell Signaling	9349
PPARγ (81B8) antibody	Cell Signaling	2443
RIPA buffer lysis	Thermo Scientific	89901
Rosiglitazone	Merck	557366
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Cacpdylate	Electron Microscopy Sciences	12300
Sodium Dodecyl Sulfate	BioRad	1610301
T3	Sigma	T6397
Talos F200C G2	Thermo Scientific
TEMED	BioRad	1610800
TOM20 antibody	Cell Signaling	42406
Tris Buffered Saline (TBS-10X)	Cell Signaling	12498
Triton X-100	Sigma	93443
Trypsin-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056
Tween 20, Molecular Biology Grade	Promega	H5152
UCP1 antibody	Cell Signaling	14670
Ultracut R	Leica
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Westar Sun	Cyanagen	XLS063
Westar Supernova	Cyanagen	XLS3