JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרדיפוציטים מבודדים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן החום הבין-סקפולרי מעכברים שזה עתה נולדו ומתמיינים לתאים שצוברים טיפות שומנים, מבטאים סמנים מולקולריים ומראים את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של אדיפוציטים חומים בוגרים. תאים אלה מנותחים עוד יותר על ידי immunofluorescence ומיקרוסקופ אלקטרונים הולכה.

Abstract

רקמת שומן חומה (BAT) קיימת רק ביונקים ויש לה תפקיד תרמוגני. אדיפוציטים חומים מאופיינים בציטופלסמה רב-לוקולרית עם טיפות שומנים מרובות, גרעין מרכזי, תכולת מיטוכונדריה גבוהה, וביטוי של חלבון uncoupling 1 (UCP1). BAT הוצע כיעד טיפולי פוטנציאלי להשמנת יתר ולהפרעות מטבוליות הקשורות אליה בשל יכולתו לפזר אנרגיה מטבולית כחום. כדי לחקור את הפונקציה והרגולציה של BAT, גידול אדיפוציט חום הוא הכרחי. הפרוטוקול הנוכחי מייעל את עיבוד הרקמות ואת התמיינות התאים לגידול אדיפוציטים חומים מעכברים שזה עתה נולדו. בנוסף, מוצגים נהלים להדמיית אדיפוציטים מובחנים עם אימונופלואורסנציה קונפוקלית ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. באדיפוציטים החומים המובחנים בטכניקות המתוארות כאן, נשמרים המאפיינים המגדירים העיקריים של BAT קלאסי, כולל רמות UCP1 גבוהות, מסה מיטוכונדריאלית מוגברת ומגע פיזי קרוב מאוד בין טיפות השומנים למיטוכונדריה, מה שהופך שיטה זו לכלי רב ערך למחקרי BAT.

Introduction

רקמת השומן הלבנה והחומה נבדלות זו מזו במיקומה האנטומי, במוצא התאי, בתפקודן, במורפולוגיה ובמסה הכוללת שלהן. רקמת השומן הלבן (WAT) היא מאגר האנרגיה הפיזיולוגי העיקרי של הגוף והיא מאחסנת כמויות גדולות של טריאצילגליצרול (TAG) בתאים מתמחים מאוד שיש להם טיפת שומנים ענקית אחת שתופסת את רוב נפח התא שלהם1. ליפוליזה TAG משחררת חומצות שומן חופשיות, אשר נכנסות למחזור הדם המערכתי כדי לעמוד בדרישות האנרגיה במהלך צום או מצבים אחרים של מאזן אנרגיה שלילי. בנוסף, ה-WAT מפריש חלבונים ומוצרי שומנים, הנקראים אדיפוקינים וליפוקינים, בהתאמה, שיש להם פונקציות מטבוליות, חיסוניות ורבייה, מה שהופך את ה-WAT לרקמה האנדוקרינית הגדולה ביותר בגוף2.

רקמת שומן חום (BAT) היא איבר קטן בהרבה שתפקידו הפיזיולוגי העיקרי הוא תרמוגנזה שאינה רועדת למניעת היפותרמיה. בעכברים ובבני אדם שזה עתה נולדו, BAT הוא איבר מוגדר היטב הממוקם בחלל הבין-סקפולרי. לבני אדם בוגרים חסר עטלף בין-סקפולרי (iBAT); עם זאת, הם מפתחים אשכולות של תאים דמויי אדיפוציט חום המשולבים במחסנים שאחרת מרכיבים בעיקר WAT. אדיפוציטים "חומים-בלבן" (בריט) אלה חולקים תכונות מורפולוגיות ומולקולריות עם אדיפוציטים iBAT קלאסיים, אך יש להם מקור תאי שונה 3,4.

בניגוד לאדיפוציטים לבנים, לאדיפוציטים חומים יש מספר טיפות שומנים קטנות ומיטוכונדריה5 בשפע. פירוק צימוד חלבון 1 (UCP1, הידוע גם בשם תרמוגנין) מבוטא באופן ייחודי על ידי אדיפוציטים חומים ובריט ומתווך דליפת פרוטונים בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי (IMM), ובכך משחרר את העברת האלקטרונים מסינתזה של ATP ויוצר חום. תרמוגנזה שאינה רועדת ב- BAT מופעלת על ידי נוראפינפרין (NE), אשר משתחרר מהטרמינלים הסימפתטיים ב- BAT בתגובה לגירוי קר6. NE נקשר לבטא-אדרנוצפטורים (בעיקר בטא 3) על פני השטח של אדיפוציטים חומים ומפעיל מפל איתות בתיווך cAMP תוך-תאי. התוצאה היא ליפוליזה של TAG, חמצון בטא של חומצות שומן מיטוכונדריאליות, ויצירת חום עם הפעלת UCP13. לקשר הפונקציונלי ההדוק בין טיפות שומנים למיטוכונדריה באדיפוציטים חומים יש מקבילות מבניות, כגון האינטראקציה בין אברונים אלה באזורים גדולים שיש להם מגע פיזי הדוק מאוד 7,8.

ל- iBAT יש כלי דם בשפע וטרמינלים סימפתטיים9. מבנים אלה, יחד עם הקדם-אדיפוציטים, תאי מערכת החיסון, הפיברובלסטים ומולקולות המטריקס החוץ-תאיות, מרכיבים את מקטע כלי הדם של סטרומה השומן (SVF)10. פרוטוקולים רבים דווחו כמייצרים אדיפוציטים בוגרים מפראדיפוציטים 11,12,13,14,15 (טבלה משלימה 1); עם זאת, הם מציגים וריאציות קיצוניות בעיבוד רקמות ובהרכב אמצעי תרבות הבידול. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר התמיינות יעילה וניתנת לשחזור של אדיפוציטים חומים אשר (1) מבטאים את גורמי השעתוק האדיפוגניים העיקריים peroxisome proliferator-activated receptor-activated gamma (PPARγ) ו- CCAAT/enhancer-binding protein alpha (C/EBPα), (2) מבטאים את סמני האדיפוציט הבוגרים perilipin1 (PLIN1), ודטרמיננטה אשכול 36 (CD36), (3) צוברים טיפות שומנים בשפע, (4) בעלי מסה מיטוכונדריאלית גבוהה ושפע גבוה של קומפלקסים של OXPHOS, (5) יש להם פוטנציאל תרמוגני, כפי שנקבע על ידי רמות גבוהות של UCP1, ו-(6) יש להם שינויים מורפולוגיים מיטוכונדריאליים הקשורים לפנוטיפ של אדיפוציטים חומים בוגרים. מתודולוגיה זו משמשת לחקר המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ליפודיסטרופיה כללית 15,16,17.

Protocol

נהלי בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים ב- Pontificia Universidad Católica de Chile. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי P0.5 שזה עתה נולדו משני המינים, שמקורם ברקע מעורב של הזנים C57BL/6J ו-129J.

1. מיצוי רקמות

  1. נקו וחיטאו את שולחן העבודה בתמיסת אתנול 70%, והשתמשו בחומר כירורגי סטרילי.
  2. הרדימו גורים שזה עתה נולדו P0.5 על ידי עריפת ראשים עם מספריים כירורגיים בהתאם לפרוטוקול שאושר במוסד.
  3. הניחו את העכבר במצב נוטה (עם הפנים כלפי מטה), ובצעו חתך באורך 1 ס"מ בעור בגובה האמצע של גב החיה באמצעות מספריים חדים. יש להסיר את העור בזהירות.
    הערה: שלב זה הוא קריטי מכיוון שאם העור אינו מוסר היטב, הוא עלול לקרוע ולפגוע ב- iBAT ולמנוע הכנה אופטימלית של SVF.
  4. נתקו בניתוח את ה- iBAT מהפגר באמצעות מספריים קטנים.
    הערה: iBAT מוצג כשתי אונות שומניות שניתן להסיר באופן עצמאי.
  5. קצרו את שתי אונות ה-iBAT באמצעות צבת בעלת קצה מעוקל כדי להסיר את האונות באופן עצמאי.
  6. מניחים את שתי האונות בצינור פלסטיק עם 1.5 מ"ל של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר. שמור על הרקמות בצינורות האישיים שלהן עד להשלמת מיצוי הרקמה עבור כל הגורים הדרושים.

2. עיכול רקמות

  1. Aliquot 300 μL של חיץ עיכול collagenase סוג II (0.2% סוג II collagenase בחיץ [25 mM KHCO3, 1.2 mM MgSO4, 120 mM NaCl, 5 mM גלוקוז, 12 mM KH2PO4, 4.8 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, 2.5% BSA, ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין, ב pH 7.4]) (טבלה 1) בצינורות 1.5 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית.
    הערה: הכינו מספיק צינורות למספר הרקמות הבודדות שיש לחלץ. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בשבעה צינורות, המתאימים להמלטה של שבעה גורים.
  2. עברו לספסל ומקמו את אונות ה-iBAT במאגר העיכול מסוג collagenase מסוג II כדי לפרק את המטריצה החוץ תאית.
  3. דגור על רקמות iBAT במשך 45 דקות ב-37°C עם רעידות עדינות מתמשכות ב-800 סל"ד (איור 1).

3. עיבוד רקמות

הערה: לאחר העיכול, בצע את כל השלבים הבאים בתרבית רקמת זרימה למינרית סוג II.

  1. הכינו ותייגו שתי ערכות של שפופרות פלסטיק בנפח 1.5 מ"ל עבור כל דגימה בנפרד.
  2. משבש מכנית את תרחיף הרקמה במאגר העיכול של collagenase type II על ידי פיפטציה למעלה ולמטה באמצעות מיקרופיפטה P1,000 וקצוות מסוננים. השתמש בעצה חדשה עבור כל דוגמה.
    הערה: זהו שלב קריטי. הקפד לפרק באופן מכני את הרקמה עם הקצה והפיפטה למעלה ולמטה עד להשלמת הומוגניזציה מקרוסקופית.
  3. העבירו את הרקמות המפורקות דרך מסננות בודדות של תאים בגודל 100 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) לצינורות חדשים של 1.5 מ"ל.
  4. הוסיפו 500 μL של חיץ ACK (ראו טבלת חומרים) לדגימות הרקמה המסוננת, הפכו את הצינורות 4-5 פעמים ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 4 דקות.
    הערה: אין לחרוג מזמן הדגירה, מכיוון שהדבר עלול לפגוע בתאי העניין.
  5. צנטריפוגה את דגימות הרקמה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. השליכו את הסופרנאטנט על ידי היפוך הצינור, והשהו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום תרבית (DMEM-F12 עם 10% FBS, 1% אנטיביוטי אנטי-מיקוטי, pH 7.2) (ראו טבלת חומרים).
  7. העבירו את המתלים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינורות חדשים של 1.5 מ"ל באמצעות מיקרופיפטה P1,000 וקצוות מסוננים.
  8. צנטריפוגה את הדגימות ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: הגלולה מתאימה ל-SVF המכיל קדם-אדיפוציט.
  9. יש להשליך את הסופרנאטנט על ידי היפוך הצינור, ולהשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום תרבית על ידי פיפטציה.
  10. הכינו צינור אחד של 15 מ"ל לכל דגימה על ידי הוספת 5 מ"ל של מדיום תרבית.
  11. הוסף כל גלולה תלויה לצינור המתאים לה 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום תרבית. הפוך את הצינור 4-5 פעמים כדי לערבב את תוכן התא.
  12. זרעו כל דגימה בשש בארות של צלחת תרבית בת 24 בארות על-ידי הוספת 1 מ"ל של תרחיף לכל באר (איור 1).

4. תרבית מקטע כלי דם סטרומה (SVF)

  1. שנה את מדיום התרבית כל יומיים עד שהתאים מגיעים למפגש של 100%.
    הערה: במהלך תקופה זו, תאים דבקים שאינם פלסטיק מוסרים, וכתוצאה מכך תרבית ראשונית מועשרת ב- SVF המכיל קדם-אדיפוציט.
  2. כאשר התאים הופכים 100% נפגשים, להסיר את מדיום התרבית, ולשטוף את התאים עם 800 μL של PBS סטרילי.
  3. הוסיפו 150 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין-EDTA (ראו טבלת חומרים) לכל באר, והניחו את צלחת התרבית למשך 3 דקות באינקובטור לניתוק התאים.
    הערה: ודא שהתאים מנותקים באמצעות מיקרוסקופ אור ניגודיות פאזה.
  4. נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 850 μL של מדיום תרבית לכל באר.
  5. אספו את התאים משש הבארות שנזרעו בשלב 3.12, והעבירו אותם לצינור של 15 מ"ל.
  6. הפוך את הנפח הכולל עד 12 מ"ל על ידי הוספת 6 מ"ל של מדיום תרבות. הפוך את הצינור 4-5 פעמים כדי לערבב את התוכן.
  7. זרע 1 מ"ל של הדגימה לתוך כל באר של צלחת 12 בארות. שנה את מדיום התרבית כל יומיים עד שהתאים מגיעים למפגש.
  8. כאשר התאים הופכים ל-100% נפגשים, נתקו אותם עם 150 μL של 0.25% טריפסין-EDTA בעקבות אותם תנאי דגירה כמו בשלב 4.3, וזרעו אותם בהתאם לשטח הפנים של הבאר הנדרשת לניסוי.
  9. בצע הדמיה ברזולוציה גבוהה לאחר קיבוע התאים לאחר שלב 8.
    הערה: צפיפות של 35,000 תאים לסמ"ר מומלצת לניסויים נוספים (מיצוי חלבון ורנ"א כולל, 330,000 תאים [באר אחת של צלחת בעלת 6 בארות]; אימונופלואורסנציה [IF], 10,500 תאים [באר אחת של צלחת בת 96 בארות]).

5. הבחנה אדיפוגנית

  1. לדגור על התאים עם מדיום אינדוקציה (DMEM-F12 עם 10% FBS, 1% אנטי-מיקוטי אנטיביוטי, pH 7.2, בתוספת 500 ננומטר דקסמתזון, 125 ננומטר אינדומתצין, 0.5 מילימטר 3-איזובוטיל-1-מתילקסנטין [IBMX], 5 מיקרומטר רוזיגליטזון, 1 ננומטר T3 ו-20 ננומטר אינסולין) (טבלה 1) במשך 72 שעות (יום 0 עד יום 2) (איור 2).
    הערה: יש לשנות את מדיום התרבות כל יומיים; לכן, השינוי הבינוני הראשון חייב להתרחש ביום 2 לאחר הזירוז הראשוני.
  2. יש לעבור למדיום תחזוקה (DMEM-F12 עם 10% FBS, 1% אנטיביוטי אנטי-מיקוטי, pH 7.2, בתוספת 5 מיקרומטר רוזיגליטזון, 1 ננומטר T3 ו-20 ננומטר אינסולין) (טבלה 1) ביום 3, ולשמור על מדיום תחזוקה זה עד יום 7 (איור 2).
    הערה: יש לשנות את אמצעי התחזוקה ביום 5 וביום 7. טיפות שומנים קטנות ניתן לדמיין על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה מהיום השלישי של התמיינות. טיפות שומנים גדולות ניכרות ביום 7 להתמיינות. הליכי התמיינות הנמשכים יותר מ-7 ימים גורמים לאיבוד תאים על ידי ניתוק, ככל הנראה בשל הציפה הגבוהה של תאים עמוסי שומנים.

6. הכנת הומוגנט סלולרי

  1. הסר את מדיום התרבית ביום 0 ויום 7 של התמיינות, ולשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS סטרילי.
  2. לאחר הניקוי האחרון, להוסיף 1.3 מ"ל של PBS סטרילי לכל באר.
    הערה: שמור את התאים בקרח עד לניקוי הצלחת האחרונה.
  3. קצרו את התאים באופן מכני מבאר אחת של צלחת בת 6 בארות (~330,000 תאים) עם מגרד תאים, והכניסו את התרחיף התאי לצינור של 1.5 מ"ל.
  4. צנטריפוגה הדגימות ב 2,800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  5. הסר את PBS עם micropipette, ולשמור את הצינורות על קרח.
  6. יש להשהות מחדש את הגלולה התאית במאגר RIPA עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז (ראו טבלת חומרים), ולדגור במשך 30 דקות על קרח.
    הערה: כדי ליזה את הגלולה התאית, 70-80 μL מספיקים.
  7. צנטריפוגה הדגימות ב 21,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  8. מוציאים בזהירות את הסופרנאטנט לצינור של 1.5 מ"ל, ומשליכים את הכדור.
    הערה: הסופרנאטנט מייצג את ההומוגנט התאי.
  9. לקבוע את ריכוז החלבון של הומוגנט התא באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) עבור זיהוי קולורימטרי וכימות של החלבון הכולל18,19.

7. כתם מערבי

  1. הכינו 30 מיקרוגרם של הומוגנט תאי (משלב 6.8) והוסיפו מאגר טעינת דגימות SDS-PAGE זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים).
  2. פתרון באלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד-SDS20 (PAGE-SDS) בהתאם למשקל המולקולרי של כל חלבון.
    הערה: השתמש ב- 10% PAGE-SDS עבור PPARγ , C/EBPα , PLIN1 , CD36 ו- UCP1, 12% PAGE-SDS עבור OXPHOS ו- 15% PAGE-SDS עבור TOM20 (עיין בטבלת החומרים).
  3. אלקטרו-העברה של החלבונים אל קרום PVDF (ראה טבלת חומרים) ב-350 mA למשך שעתיים.
    הערה: יש להחליף את מיכל הקרח לאחר שעה. במהלך התהליך כולו, לשמור את החדר על קרח.
  4. חסום את הקרומים עם 5% BSA או חלב ללא שומן במי מלח חוצצים של טריס (TBS) 0.1% Tween 20 (TBS-T) למשך שעתיים בהתאם להמלצות מגיליונות הנתונים של הנוגדנים.
  5. לדגור עם הנוגדנים הראשוניים (הנוגדנים המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים) לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: כל הנוגדנים ששימשו במחקר זה דוללו ל-1:1,000 בתמיסת חסימה.
  6. שטפו את הקרומים 3 פעמים עם 0.1% TBS-T, ודגרו עליהם עם נוגדן משני מצומד (HRP) של חזרת (ראו טבלת חומרים) במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
  7. לשטוף את הממברנות 3 פעמים עם 0.1%. TBS-T. בצע שטיפה אחרונה עם 1x TBS. אחסן את הממברנות ב- 1x TBS עד לתצוגה חזותית. מומלץ לאחסן למשך שעה לכל היותר.
  8. דמיינו את הממברנות על ידי כימילומינסנציה20 או כל שיטה מועדפת אחרת.

8. הדמיה ברזולוציה גבוהה

  1. בצע את בדיקת immunofluorescence בצע את השלבים הבאים.
    1. זרעו והבדילו את התרביות הראשוניות של קדם-אדיפוציטים חומים מעכברים שזה עתה נולדו P0.5 (לאחר שלב 4.8) בלוחות בעלי 96 בארות עם תחתית אופטית (ראו טבלת חומרים).
    2. תקן את התאים ביום 0 וביום 7 של התמיינות עם 4% PFA במשך 20 דקות, ושטוף 3 פעמים עם PBS סטרילי.
    3. חדרו את התאים עם 0.1% טריטון X-100 למשך 15 דקות, וחסמו אותם עם 3% ג'לטין דגים (ראו טבלת חומרים) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    4. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS סטרילי, ולדגור עם נוגדן PLIN1 (1:400, ראו טבלת חומרים) ב-1% BSA/PBS למשך הלילה ב-4°C בתא לח.
    5. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS סטרילי, ולדגור עם נוגדן משני מצומד פלואורופור בקנ"מ 1:1,000 (1% BSA/PBS) (ראו טבלת חומרים) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    6. צבעו את הגרעינים עם 1 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst 33342 ואת טיפות השומנים עם 1 מיקרוגרם/מ"ל BODIPY למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: התמונות הפלואורסצנטיות נרכשו באמצעות מערכת דימות תאי (ראה טבלת חומרים). בסך הכל, 9 או 16 תמונות לכל באר נרכשו עם שניים עד שלושה ערוצים עם הגדלה של פי 20.
  2. בצע מיקרוסקופ אלקטרונים שידור לפי השלבים הבאים.
    1. לגדל ולהבדיל את הפרדיפוציטים החומים בצלחות תרבית תאים בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ.
    2. ביום 0 וביום 7 להתמיינות, הסר את המדיום, וקבע את התאים למשך שעה אחת עם 2.5% גלוטראלדהיד במאגר נתרן קקודילט 0.1 M, pH 7.0 (ראה טבלת חומרים).
    3. שטפו את התאים 3 פעמים עם חיץ נתרן קקודילט 0.05M במשך 10 דקות, וטפלו בהם עם 1% אוסמיום טטרוקסיד מימי (ראו טבלת חומרים) במשך 15 דקות.
    4. שטפו את התאים 3 פעמים במים מזוקקים במשך 5 דקות, ופנקו אותם באורניל אצטט מימי 1% (ראו טבלת חומרים) למשך 15 דקות.
    5. יש לייבש את התאים עם שיפוע אתנול של 30%, 50%, 70%, 95% ו-100% למשך 5 דקות בכל פעם.
    6. הטמע מראש את התאים באפון / אתנול ביחס של 1:1 למשך 30 דקות ולאחר מכן באפון למשך שעה אחת (ראה טבלת חומרים).
      הערה: הכללת התאים מתבצעת ישירות בצלחת על ידי הוספת אפון טרי כדי לכסות את כל תרבית התא monolayer. תן לאפון להתפלמר בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
    7. טבלו את צלחת תרבית התאים בחנקן נוזלי למשך 2 דקות, ולאחר מכן שברו אותה באמצעות צבת כדי לשחרר את תכלילת הפלסטיק.
    8. הדביקו את מקטעי ההכללה עם התאים לגוש שרף כדי לקבל חתכים עדינים (80 ננומטר) במקביל לפני השטח באולטרה-מיקרוטום (ראו טבלת חומרים).
    9. הכתימו את החתכים באורניל אצטט מימי 1% למשך 4 דקות ועופרת ציטראט למשך 5 דקות, על פי Reynolds et al.21.
    10. דמיינו את הרשתות במיקרוסקופ אלקטרונים (ראו טבלת חומרים).

תוצאות

אדיפוגנזה מווסתת על ידי רשת של גורמי שעתוק האחראים הן לביטוי חלבוני מפתח הגורמים להיווצרות אדיפוציט חום ותפקודו22, כולל רגולטורים אדיפוגניים קלאסיים כגון PPARγ ו- C/EBPα 23,24,25, כמו גם סמנים של אדיפוציטים בוגרים 26,27<...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי הוא הליך התמיינות דו-פאזי פשוט וניתן לשכפול (איור 2) ליצירת תאים בעלי המאפיינים המולקולריים והמורפולוגיים של אדיפוציטים חומים בוגרים. הקציר הכירורגי של iBAT הוא הצעד הקריטי הראשון מכיוון שקריעות רקמות מגבילות מאוד את הכדאיות של חומר המוצא. עיבוד רקמות הוא ג...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המימון ניתן על ידי FONDECYT (1181214 ו-1221146) ואנילוס (ACT210039) למלגות הון סיכון ודוקטורט ANID 21171743 ל-AMF ו-ANID 21150665 ל-FS. אנו מודים לאלחנדרו מוניזאגה על העזרה בעיבוד הדגימות ועל הייעוץ הטכני למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. האיורים הופקו באמצעות BioRender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Tris/Glycine BufferBioRad1610734
16% Paraformaldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences15710
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture DishFalcon353001
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Calbiochem410957
40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1BioRad1610148
6-well plate SPL Life Science -
96 well optical black w/lid cell culture sterileThermo Scientific165305
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder Maestrogen02102-250
ACK lysing buffer GibcoA10492-01
Ammonium Persulfate BioRad1610700
Antibiotic-antimycoticGibco 15240062
Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling7076
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody  Cell Signaling7074
Blotting-grade blocker BioRad170-6404
BODIPY 493/503 InvitrogenD3922
BSASigmaA1470
C/EBPα antibodyCell Signaling2295
CaCl2Calbiochem 208291
CD36 antibodyInvitrogenPA1-16813
Cell Strainer 100 µm, nylonFalcon352360
Cell Strainer 40 µm, nylonFalcon352340
Collagenase type IIGibco17101-015
Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderBiotek
Dexamethasone SigmaD4902
DMEM/F-12, powderGibco12500062
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)Electron Microscopy Sciences14120
Ethanol absoluteMerck 100983 
Fetal bovine serum Gibco16000-044
Gelatin from cold water fish skinSigmaG7041
GlucoseGibco 15023-021
Glutaraldehyde 25% Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences16210
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11012
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X Thermo Scientific78427
Halt Protease Inhibitor Cocktail 100X Thermo Scientific78429
Hoechst 33258InvitrogenH1398
Immun-Blot PVDF Membrane BioRad1620177
Indomethacin Sigma I7378 
Insulin SigmaI3536
KClCalbiochem 529552
KH2PO4Calbiochem529568
KHCO3Sigma60339
Lane Marker Reducing Sample Buffer Thermo Scientific39000
MgSO4SigmaM2643
MilliQ water sterile --
Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB antibody CocktailAbcam MS604
NaClMerck 1064041000
OmniPur 10x PBS Liquid ConcentrateCalbiochem6505-OP
Osmium Tetroxide Electron Microscopy Sciences19100
Perilipin 1 antibodyCell Signaling9349
PPARγ (81B8) antibodyCell Signaling2443
RIPA buffer lysis Thermo Scientific89901
RosiglitazoneMerck557366
Sodium bicarbonate SigmaS5761
Sodium CacpdylateElectron Microscopy Sciences12300
Sodium Dodecyl Sulfate BioRad1610301
T3SigmaT6397
Talos F200C G2Thermo Scientific
TEMED BioRad1610800
TOM20 antibodyCell Signaling42406
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Cell Signaling12498
Triton X-100 Sigma93443
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200056
Tween 20, Molecular Biology GradePromega H5152
UCP1 antibodyCell Signaling14670
Ultracut RLeica 
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400
Westar Sun CyanagenXLS063
Westar Supernova CyanagenXLS3

References

  1. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
  2. Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 320 (3), 488-495 (2021).
  3. Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Frontiers in Bioscience. 16, 1233-1260 (2011).
  4. Rosenwald, M., Wolfrum, C. The origin and definition of brite versus white and classical brown adipocytes. Adipocyte. 3 (1), 4-9 (2014).
  5. Smorlesi, A., Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. The adipose organ: White-brown adipocyte plasticity and metabolic inflammation. Obesity Reviews. 13, 83-96 (2012).
  6. Townsend, K., Tseng, Y. -. H. Brown adipose tissue: Recent insights into development, metabolic function and therapeutic potential. Adipocyte. 1 (1), 13-24 (2012).
  7. Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
  8. Benador, I. Y., Veliova, M., Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondria bound to lipid droplets: Where mitochondrial dynamics regulate lipid storage and utilization. Cell Metabolism. 29 (4), 827-835 (2019).
  9. Lee, P., Swarbrick, M. M., Ho, K. K. Brown adipose tissue in adult humans: A metabolic renaissance. Endocrine Reviews. 34 (3), 413-438 (2013).
  10. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  11. Klein, J., et al. Beta(3)-adrenergic stimulation differentially inhibits insulin signaling and decreases insulin-induced glucose uptake in brown adipocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (3), 34795-34802 (1999).
  12. Gaom, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
  13. Rocha, A. L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. A Method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes. Bio-protocol. 11 (24), 4265 (2021).
  14. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
  15. Tapia, P. J., et al. Absence of AGPAT2 impairs brown adipogenesis, increases IFN stimulated gene expression and alters mitochondrial morphology. Metabolism. 111, 154341 (2020).
  16. González-Hódar, L., et al. Decreased caveolae in AGPAT2 lacking adipocytes is independent of changes in cholesterol or sphingolipid levels: A whole cell and plasma membrane lipidomic analysis of adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1867 (9), 166167 (2021).
  17. Fernández-Galilea, M., Tapia, P., Cautivo, K., Morselli, E., Cortés, V. A. AGPAT2 deficiency impairs adipogenic differentiation in primary cultured preadipocytes in a non-autophagy or apoptosis dependent mechanism. Biochemical and Biophysical Research Communications. 467 (1), 39-45 (2015).
  18. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-15 (2009).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  20. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  21. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
  22. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
  23. Ambele, M. A., Dhanraj, P., Giles, R., Pepper, M. S. Adipogenesis: A complex interplay of multiple molecular determinants and pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4283 (2020).
  24. Lefterova, M. I., et al. PPARγ and C/EBP factors orchestrate adipocyte biology via adjacent binding on a genome-wide scale. Genes & Development. 22 (21), 2941-2952 (2008).
  25. Ntambi, J. M., Young-Cheul, K. Adipocyte differentiation and gene expression. The Journal of Nutrition. 130 (12), (2000).
  26. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16, 83 (2017).
  27. Christiaens, V., Van Hul, M., Lijnen, H. R., Scroyen, I. CD36 promotes adipocyte differentiation and adipogenesis. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1820 (7), 949-956 (2012).
  28. Carobbio, S., Rosen, B., Vidal-Puig, A. Adipogenesis: New insights into brown adipose tissue differentiation. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (3), 75-85 (2013).
  29. Ricquier, D. Uncoupling protein 1 of brown adipocytes, the only uncoupler: A historical perspective. Frontiers in Endocrinology. 2, 85-91 (2011).
  30. Cui, L., Mirza, A. H., Zhang, S., Liang, B., Liu, P. Lipid droplets and mitochondria are anchored during brown adipocyte differentiation. Protein & Cell. 10 (12), 921-926 (2019).
  31. Hao, L., et al. Indomethacin enhances brown fat activity. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 365 (3), 467-475 (2018).
  32. Lehmann, J. M., Lenhard, J. M., Oliver, B. B., Ringold, G. M., Kliewer, S. A. Peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma are activated by indomethacin and other non-steroidal anti-inflammatory drugs. Journal of Biological Chemistry. 272 (6), 3406-3410 (1997).
  33. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  34. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1281-1289 (2004).
  35. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  36. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARgamma agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell Metabolism. 15 (3), 395-404 (2012).
  37. Merlin, J., et al. Rosiglitazone and a β3-adrenoceptor agonist are both required for functional browning of white adipocytes in culture. Frontiers in Endocrinology. 9, 249 (2018).
  38. Fayyad, A. M., et al. Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).
  39. Zennaro, M. -. C., et al. Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action. The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).
  40. Klaus, S., et al. Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression. Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).
  41. Guennoun, A., et al. Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype. Journal of Translational Medicine. 13, 135 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192uncoupling 1UCP1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved