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要約

新生仔マウスの肩甲間褐色脂肪組織の間質血管分画から前駆脂肪細胞を単離し、脂肪滴を蓄積する細胞に分化し、分子マーカーを発現し、成熟した褐色脂肪細胞のミトコンドリア形態を示します。これらの細胞は、免疫蛍光法および透過型電子顕微鏡法によってさらに分析されます。

要約

褐色脂肪組織(BAT)は哺乳類にのみ存在し、熱発生機能を持っています。褐色脂肪細胞は、複数の脂肪滴を持つ多房性細胞質、中心核、高いミトコンドリア含有量、およびアンカップリングタンパク質1(UCP1)の発現によって特徴付けられます。BATは、代謝エネルギーを熱として放散する能力があるため、肥満およびそれに関連する代謝障害の潜在的な治療標的として提案されています。BATの機能や制御を調べるためには、褐色脂肪細胞の培養が不可欠です。本プロトコールは、新生マウスからの褐色脂肪細胞を培養するための組織プロセシングおよび細胞分化を最適化する。さらに、共焦点免疫蛍光法と透過型電子顕微鏡法の両方を用いて分化した脂肪細胞をイメージングする手順が示されています。本明細書に記載の技術で分化した褐色脂肪細胞では、高いUCP1レベル、ミトコンドリア質量の増加、脂質液滴とミトコンドリアとの間の非常に密接な物理的接触など、古典的なBATの主要な特徴が保持されているため、この方法はBAT研究のための貴重なツールとなっています。

概要

白脂肪組織と褐色脂肪組織は、解剖学的位置、細胞起源、機能、形態、および総質量が異なります。白色脂肪組織(WAT)は、体の主要な生理学的エネルギー貯蔵庫であり、細胞体積のほとんどを占める単一の巨大な脂質液滴を持つ高度に特殊化された細胞に大量のトリアシルグリセロール(TAG)を貯蔵します1。TAG脂肪分解は遊離脂肪酸を放出し、空腹時やその他のエネルギーバランスがマイナスの状態にあるときにエネルギー需要を満たすために体循環に入ります。さらに、WATは、代謝、免疫、および生殖調節機能を持つアディポカインとリポカインと呼ばれるタンパク質と脂質産物をそれぞれ分泌するため、WATは体内で最大の内分泌組織になります2。

褐色脂肪組織(BAT)は、低体温症を予防するための非震え熱発生を主な生理学的機能とする、はるかに小さな臓器です。マウスや新生児では、BATは肩甲骨間腔に位置する明確な器官です。成人は肩甲骨間BAT(iBAT)を欠いています。それにもかかわらず、彼らは、そうでなければ主にWATを構成するデポに統合された茶色の脂肪細胞様細胞のクラスターを発達させます。これらの「ブラウンインホワイト」(ブライト)脂肪細胞は、従来のiBAT脂肪細胞と形態学的および分子的特徴を共有していますが、細胞起源は異なります3,4。

白色脂肪細胞とは対照的に、褐色脂肪細胞は複数の小さな脂肪滴と豊富なミトコンドリア5を持っています。アンカップリングタンパク質1(UCP1、別名サーモゲニン)は、褐色脂肪細胞とブライト脂肪細胞によって特異的に発現し、ミトコンドリア内膜(IMM)のプロトン漏れを媒介するため、ATP合成からの電子輸送が切り離され、熱が発生します。BATにおける非震動熱発生は、ノルエピネフリン(NE)によって活性化され、ノルエピネフリンは低温刺激に応答してBATの交感神経終末から放出されます6。NEは、褐色脂肪細胞の表面にあるβ-アドレナリン受容体(主にβ3)に結合し、細胞内cAMPを介したシグナル伝達カスケードをトリガーします。その結果、TAG脂肪分解、ミトコンドリア脂肪酸のベータ酸化、およびUCP1活性化時の発熱が起こります3。褐色脂肪細胞における脂肪滴とミトコンドリアとの間の密接な機能的関係は、大きくて非常に密接な物理的接触を有する領域におけるこれらの細胞小器官間の相互作用など、構造的な類似性を有する7,8。

iBATは血管が豊富で、交感神経末端9.これらの構造は、前駆脂肪細胞、免疫細胞、線維芽細胞、および細胞外マトリックス分子とともに、脂肪間質血管画分(SVF)10を構成します。多くのプロトコルは、前脂肪細胞11,12,13,14,15から成熟脂肪細胞を生成することが報告されています(補足表1);それにもかかわらず、それらは組織処理と分化培地の組成に極端な変動を示します。本明細書に記載のプロトコルは、(1)主要な脂肪形成転写因子ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ(PPARγ)およびCCAAT/エンハンサー結合タンパク質α(C/EBPα)を発現し、(2)成熟脂肪細胞マーカーperilipin1(PLIN1)およびクラスター決定基36(CD36)を発現し、(3)豊富な脂肪滴を蓄積し、(4)高いミトコンドリア質量および高い存在量のOXPHOS複合体を有する褐色脂肪細胞の効率的かつ再現性のある分化を可能にする。 (5)高レベルのUCP1によって決定される熱発生能力を持ち、(6)成熟した褐色脂肪細胞の表現型に関連するミトコンドリアの形態学的変化を有する。この方法論は、全身性脂肪異栄養症の根底にある分子メカニズムの研究に使用されます15,16,17。

プロトコル

動物の手順は、ポンティフィシア・カトリカ・デ・チリ大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。この研究では、C57BL/6J系統と129J系統の混合バックグラウンドに由来する雌雄のP0.5新生児マウスを使用しました。

1.組織抽出

  1. ワークベンチを70%エタノール溶液で洗浄および消毒し、滅菌済みの外科用材料を使用します。
  2. P0.5新生児の子犬を、制度的に承認されたプロトコルに従って手術用ハサミで斬首することにより安楽死させます。
  3. マウスを腹臥位(下向き)に置き、鋭利なハサミを使用して動物の背中の中央レベルの皮膚に1cmの長さの切開を行います。皮膚を慎重に取り除きます。
    注:皮膚を十分に取り除かないと、iBATが裂けて損傷し、SVFの最適な調製が妨げられる可能性があるため、この手順は重要です。
  4. 小さなハサミを使用して、iBATを枝肉から外科的に取り外します。
    注:iBATは、独立して除去できる2つの脂肪小葉として視覚化されます。
  5. 湾曲した先端のペンチを使用して両方のiBATローブを収穫し、ローブを個別に除去します。
  6. 2つのローブを、室温で1.5mLの滅菌PBSを入れたプラスチックチューブに入れます。必要なすべての子犬の組織抽出が完了するまで、組織を個々のチューブに保持します。

2.組織消化

  1. バイオセーフティキャビネット内の1.5 mLチューブに、コラゲナーゼII型消化バッファー(0.2% II型コラゲナーゼ溶液溶液[25 mM KHCO3、1.2 mM MgSO4、120 mM NaCl、5 mMグルコース、12 mM KH2PO4、4.8 mM KCl、1.2 mM CaCl2、2.5% BSA、および1%ペニシリン/ストレプトマイシン、pH 7.4])300 μLをアリコート(表1)に入れます。
    注:抽出する個々の組織の数に対して十分なチューブを準備します。本研究では、7匹の子犬の同腹仔に対応する7本のチューブを使用しました。
  2. ベンチに移動し、iBATローブをコラゲナーゼII型消化バッファーに入れて、細胞外マトリックスを分解します。
  3. iBAT組織を37°Cで45分間インキュベートし、800rpmで穏やかに振とうを続けて行います(図1)。

3. ティッシュ加工

注:消化後、クラスII層流組織培養フードで以下のすべてのステップを実行します。

  1. 個々のサンプルごとに2セットの1.5 mLプラスチックチューブを調製し、標識します。
  2. コラゲナーゼII型消化バッファー中の組織懸濁液を機械的に破壊するには、P1,000マイクロピペットとフィルターチップを使用してピペッティングします。サンプルごとに新しいチップを使用します。
    注: これは重要なステップです。巨視的な均質化が完了するまで、チップとピペットで組織を機械的に分解し、上下にしてください。
  3. 細集した組織を個々の100 μmセルストレーナー( 材料表を参照)に通し、新しい1.5 mLチューブに入れます。
  4. ろ過した組織サンプルに500 μLのACKバッファー( 材料表を参照)を加え、チューブを4〜5回反転させ、室温で4分間インキュベートします。
    注:インキュベーション時間を超えないようにしてください、なぜならこれは目的の細胞を損傷する可能性があるためです。
  5. 組織サンプルを300 x g で室温で5分間遠心分離します。
  6. チューブを反転させて上清を捨て、ペレットを1 mLの培地(DMEM-F12と10%FBS、1%抗生物質抗真菌剤、pH 7.2)に再懸濁します( 材料の表を参照)。
  7. 懸濁液を40 μmのセルストレーナーに通し、P1,000マイクロピペットとフィルターチップを使用して新しい1.5 mLチューブに流します。
  8. サンプルを300 x g で室温で5分間遠心分離します。
    注:ペレットは、前駆細胞含有SVFに対応します。
  9. チューブを反転させて上清を捨て、ピペッティングでペレットを1 mLの培地に再懸濁します。
  10. 5 mLの培地を加えて、各サンプルに15 mLのチューブを1本調製します。
  11. 再懸濁した各ペレットを、5 mLの培地が入った対応する15 mLチューブに加えます。チューブを4〜5回反転させて、セル内容物を混合します。
  12. 各ウェルに1 mLの懸濁液を添加することにより、各サンプルを24ウェル培養プレートの6つのウェルに播種します(図1)。

4. 間質血管分画(SVF)培養

  1. 細胞が100%のコンフルエントに達するまで、一日おきに培地を交換してください。
    注:この期間中、非可塑性接着細胞が除去され、前駆細胞含有SVFが豊富な初代培養が行われます。
  2. 細胞が100%コンフルエントになったら、培地を取り出し、800 μLの滅菌PBSで細胞を洗浄します。
  3. 150 μLの0.25%トリプシン-EDTA( 材料表を参照)を各ウェルに加え、培養プレートをインキュベーターに3分間置いて細胞を剥離させます。
    注:位相差光学顕微鏡を使用して細胞が剥離していることを確認します。
  4. 各ウェルに850μLの培地を添加して、トリプシンを不活性化します。
  5. ステップ3.12で播種した6つのウェルから細胞を採取し、15mLチューブに移します。
  6. 6 mLの培地を加えて、総容量を最大12 mLにします。チューブを4〜5回反転させて内容物を混ぜます。
  7. 1 mLのサンプルを12ウェルプレートの各ウェルに播種します。細胞がコンフルエントに達するまで、一日おきに培地を交換してください。
  8. 細胞が100%コンフルエントになったら、ステップ4.3と同じインキュベーション条件に従って150μLの0.25%トリプシン-EDTAで細胞を剥離し、実験に必要なウェルの表面積に応じて播種します。
  9. 手順8に従って細胞を固定した後、高解像度イメージングを行います。
    注:さらなる実験には、35,000細胞/cm²の密度が推奨されます(タンパク質および全RNA抽出、330,000細胞[6ウェルプレートの1ウェル]、免疫蛍光[IF]、10,500細胞[96ウェルプレートの1ウェル])。

5. 脂肪分化

  1. 誘導培地(DMEM-F12と10% FBS、1%抗生物質抗真菌薬、pH 7.2、500 nMデキサメタゾン、125 nMインドメタシン、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン[IBMX]、5 μMロシグリタゾン、1 nM T3、および20 nMインスリン)(表1)で72時間(0日目から2日目)(図2)インキュベートします。
    注:培地は一日おきに交換する必要があります。したがって、最初の培地交換は、最初の導入後 2 日目に行う必要があります。
  2. 3日目に維持培地(DMEM-F12、10%FBS、1%抗生物質抗真菌薬、pH 7.2、5μMロシグリタゾン、1nM T3、および20nMインスリンを補給)(表1)に変更し、この維持培地を7日目(図2)まで維持します。
    注:メンテナンスメディアは、5日目と7日目に交換する必要があります。小さな脂肪滴は、分化の3日目から位相差顕微鏡で視覚化できます。分化の7日目に大きな脂肪滴が明らかになります。7日を超える分化処置は、脂質を含む細胞の高い浮力が原因であると考えられますが、これは分離による細胞の喪失につながります。

6. 細胞ホモジネートの調製

  1. 分化の0日目と7日目に培地を取り出し、滅菌PBSで細胞を3回洗浄します。
  2. 最後の洗浄後、各ウェルに1.3mLの滅菌PBSを加えます。
    注:最後のプレートを洗浄するまで、セルを氷に保持します。
  3. 細胞スクレーパーを使用して、6ウェルプレート(~330,000細胞)の1ウェルから細胞を機械的に回収し、細胞懸濁液を1.5mLチューブに入れます。
  4. サンプルを2,800 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
  5. マイクロピペットでPBSを取り外し、チューブを氷の上に保ちます。
  6. 細胞ペレットをプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤( 材料表を参照)を含むRIPAバッファーに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。
    注:細胞ペレットを溶解するには、70〜80μLで十分です。
  7. サンプルを21,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
  8. 上清を1.5mLのチューブに慎重に取り除き、ペレットを捨てます。
    注:上清は細胞の均質性を表します。
  9. ビシンコニン酸(BCA)を使用して細胞ホモジネートのタンパク質濃度を測定し、全タンパク質18,19の比色検出と定量を行います。

7. ウェスタンブロッティング

  1. 30 μgの細胞ホモジネートを調製し(ステップ6.8から)、市販のSDS-PAGEサンプルローディングバッファーを添加します( 材料表を参照)。
  2. ポリアクリルアミドゲル電気泳動-SDS20 (PAGE-SDS)で、各タンパク質の分子量に応じて分離します。
    注:PPARγ、C/EBPα、PLIN1、CD36、およびUCP1には10%のPAGE-SDS、OXPHOSには12%のPAGE-SDS、TOM20には15%のPAGE-SDSを使用します( 材料表を参照)。
  3. タンパク質をPVDFメンブレン( 材料表を参照)に350mAで2時間電気転写します。
    注意: 氷の容器は1時間後に交換する必要があります。プロセス全体を通して、チャンバーを氷上に維持します。
  4. 抗体のデータシートの推奨に従って、5% BSAまたはトリス緩衝生理食塩水(TBS)0.1%Tween 20(TBS-T)中の無脂肪乳でメンブレンを2時間ブロックします。
  5. 一次抗体(この試験で使用した抗体は 材料表に詳述されています)と4°Cで一晩インキュベートします。
    注:この研究で使用したすべての抗体は、ブロッキング溶液で1:1,000に希釈しました。
  6. メンブレンを0.1% TBS-Tで3回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体( 材料表を参照)と室温で2時間インキュベートします。
  7. メンブレンを0.1%で3回洗浄します。TBSのT。最後に1x TBSで洗浄を行い、メンブレンを1x TBSで可視化するまで保存します。最大1時間保存することをお勧めします。
  8. 化学発光20 または任意の他の好ましい方法により、膜を可視化する。

8. 高解像度イメージング

  1. 以下の手順に従って免疫蛍光アッセイを実施します。
    1. 光学底部を有する96ウェルプレートで、P0.5新生仔マウス(ステップ4.8に続く)から褐色前駆脂肪細胞の初代培養物を播種し、分化します( 材料表を参照)。
    2. 分化の0日目と7日目に細胞を4%PFAで20分間固定し、滅菌PBSで3回洗浄します。
    3. 0.1% Triton X-100で細胞を15分間透過処理し、3%魚ゼラチン( 材料表を参照)で室温で1時間ブロックします。
    4. 滅菌PBSで3回洗浄し、PLIN1抗体(1:400、 材料表を参照)と1% BSA/PBSで湿潤チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。
    5. 滅菌PBSで3回洗浄し、蛍光色素標識二次抗体と1:1,000(1% BSA/PBS)( 材料表参照)で室温で1時間インキュベートします。
    6. 核を1 μg/mL Hoechst 33342で染色し、脂肪滴を1 μg/mL BODIPYで室温で30分間染色します。
      注:蛍光画像は、細胞イメージングシステムを使用して取得しました( 材料の表を参照)。全体として、ウェルあたり9枚または16枚の写真が、20倍の倍率で2〜3チャンネルで取得されました。
  2. 以下の手順で透過型電子顕微鏡を行ってください。
    1. 褐色前駆脂肪細胞を35 mm x 10 mmの細胞培養皿で増殖させ、分化させます。
    2. 分化の0日目と7日目に、培地を取り出し、0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0の2.5%グルタルアルデヒドで細胞を1時間固定します( 材料の表を参照)。
    3. 細胞を0.05 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で10分間3回洗浄し、1%四酸化オスミウム水溶液( 材料表を参照)で15分間処理します。
    4. 細胞を二蒸留水で5分間3回洗浄し、1%酢酸ウラニル水溶液( 材料表を参照)で15分間処理します。
    5. 細胞を30%、50%、70%、95%、100%のエタノールグラジエントで毎回5分間脱水します。
    6. 細胞を1:1 epon/ethanolに30分間、次にeponに1時間事前に埋め込みます( 材料の表を参照)。
      注:細胞の包含は、細胞培養単層全体を覆うために新鮮なエポンを添加することにより、皿内で直接行われます。エポンを60°Cのオーブンで24時間重合させます。
    7. 細胞培養皿を液体窒素に2分間浸し、ペンチで破砕してプラスチック介在物をほぐします。
    8. 細胞を含む介在物セグメントを樹脂のブロックに接着して、ウルトラミクロトームで表面に平行な微細な切り込み(80 nm)を取得します( 材料の表を参照)。
    9. Reynoldsらによると、1%酢酸ウラニル水溶液で4分間、クエン酸鉛で5分間カットを染色します。
    10. 電子顕微鏡でグリッドを視覚化します( 材料の表を参照)。

結果

脂肪形成は、褐色脂肪細胞の形成を誘導する主要なタンパク質の発現と機能の両方に関与する転写因子のネットワークによって制御され、PPARγやC/EBPαなどの古典的な脂肪形成調節因子23,24,25、成熟脂肪細胞のマーカー26,27を含む。.熱発生性褐色脂肪表現型の獲?...

ディスカッション

本プロトコールは、成熟した褐色脂肪細胞の分子的および形態学的特性を有する細胞を生成するための、単純で複製可能な二相分化手順(図2)である。iBATの外科的採取は、組織の裂傷が出発物質の生存率を著しく制限するため、最初の重要なステップです。また、破片のない均質な細胞懸濁液は、培養可能なSVFの量を大幅に増加させるため、組織処理も重要です。現在の...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

資金は、FONDECYT(1181214および1221146)とAnillos(ACT210039)によってVCに提供され、博士奨学金ANIDはAMFにANID 21171743、FSにANID 21150665が提供されました。サンプルの処理に協力し、透過型電子顕微鏡の技術的アドバイスを提供してくださったAlejandro Munizagaに感謝します。イラストはBioRenderを使用して作成されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Tris/Glycine BufferBioRad1610734
16% Paraformaldehyde Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences15710
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture DishFalcon353001
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Calbiochem410957
40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1BioRad1610148
6-well plate SPL Life Science -
96 well optical black w/lid cell culture sterileThermo Scientific165305
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder Maestrogen02102-250
ACK lysing buffer GibcoA10492-01
Ammonium Persulfate BioRad1610700
Antibiotic-antimycoticGibco 15240062
Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling7076
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody  Cell Signaling7074
Blotting-grade blocker BioRad170-6404
BODIPY 493/503 InvitrogenD3922
BSASigmaA1470
C/EBPα antibodyCell Signaling2295
CaCl2Calbiochem 208291
CD36 antibodyInvitrogenPA1-16813
Cell Strainer 100 µm, nylonFalcon352360
Cell Strainer 40 µm, nylonFalcon352340
Collagenase type IIGibco17101-015
Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderBiotek
Dexamethasone SigmaD4902
DMEM/F-12, powderGibco12500062
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)Electron Microscopy Sciences14120
Ethanol absoluteMerck 100983 
Fetal bovine serum Gibco16000-044
Gelatin from cold water fish skinSigmaG7041
GlucoseGibco 15023-021
Glutaraldehyde 25% Aqueous SolutionElectron Microscopy Sciences16210
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11012
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X Thermo Scientific78427
Halt Protease Inhibitor Cocktail 100X Thermo Scientific78429
Hoechst 33258InvitrogenH1398
Immun-Blot PVDF Membrane BioRad1620177
Indomethacin Sigma I7378 
Insulin SigmaI3536
KClCalbiochem 529552
KH2PO4Calbiochem529568
KHCO3Sigma60339
Lane Marker Reducing Sample Buffer Thermo Scientific39000
MgSO4SigmaM2643
MilliQ water sterile --
Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB antibody CocktailAbcam MS604
NaClMerck 1064041000
OmniPur 10x PBS Liquid ConcentrateCalbiochem6505-OP
Osmium Tetroxide Electron Microscopy Sciences19100
Perilipin 1 antibodyCell Signaling9349
PPARγ (81B8) antibodyCell Signaling2443
RIPA buffer lysis Thermo Scientific89901
RosiglitazoneMerck557366
Sodium bicarbonate SigmaS5761
Sodium CacpdylateElectron Microscopy Sciences12300
Sodium Dodecyl Sulfate BioRad1610301
T3SigmaT6397
Talos F200C G2Thermo Scientific
TEMED BioRad1610800
TOM20 antibodyCell Signaling42406
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Cell Signaling12498
Triton X-100 Sigma93443
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200056
Tween 20, Molecular Biology GradePromega H5152
UCP1 antibodyCell Signaling14670
Ultracut RLeica 
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400
Westar Sun CyanagenXLS063
Westar Supernova CyanagenXLS3

参考文献

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