新生小鼠肩胛间脂肪组织基质血管部分棕色脂肪细胞的分化和成像

摘要

前脂肪细胞是从新生小鼠肩胛间棕色脂肪组织的基质血管部分中分离出来的，并分化成积累脂滴、表达分子标记物并显示成熟棕色脂肪细胞线粒体形态的细胞。通过免疫荧光和透射电子显微镜进一步分析这些细胞。

摘要

棕色脂肪组织（BAT）仅存在于哺乳动物中，具有产热功能。棕色脂肪细胞的特征是多房细胞质，具有多个脂滴、中心核、线粒体含量高和解偶联蛋白 1 （UCP1） 的表达。BAT 已被提议作为肥胖及其相关代谢紊乱的潜在治疗靶点，因为它能够将代谢能作为热量耗散。为了研究BAT的功能和调控，棕色脂肪细胞培养是必不可少的。本方案优化了从新生小鼠培养棕色脂肪细胞的组织处理和细胞分化。此外，还显示了使用共聚焦免疫荧光和透射电子显微镜对分化脂肪细胞进行成像的程序。在与本文所述技术分化的棕色脂肪细胞中，保留了经典 BAT 的主要定义特征，包括高 UCP1 水平、增加的线粒体质量以及脂滴和线粒体之间非常紧密的物理接触，使该方法成为 BAT 研究的宝贵工具。

引言

白色和棕色脂肪组织在其解剖位置、细胞起源、功能、形态和总质量方面有所不同。白色脂肪组织 （WAT） 是人体的主要生理能量储存库，将大量三酰基甘油 （TAG） 储存在高度特化的细胞中，这些细胞具有一个占据其大部分细胞体积的巨大脂滴¹。TAG脂肪分解释放游离脂肪酸，游离脂肪酸进入体循环以满足禁食或其他负能量平衡状态期间的能量需求。此外，WAT 分泌蛋白质和脂质产物，分别称为脂肪因子和脂因子，它们具有代谢、免疫和生殖调节功能，从而使 WAT 成为体内最大的内分泌组织²。

棕色脂肪组织 （BAT） 是一个小得多的器官，其主要生理功能是不颤抖产热以防止体温过低。在小鼠和新生儿中，BAT 是位于肩胛间隙的明确器官。成年人缺乏肩胛间 BAT （iBAT）;然而，他们发展出棕色脂肪细胞样细胞簇，这些细胞簇整合在原本主要构成 WAT 的仓库中。这些"棕白"（brite）脂肪细胞与经典的 iBAT 脂肪细胞具有相同的形态和分子特征，但它们具有不同的细胞来源 ^3,4。

与白色脂肪细胞相比，棕色脂肪细胞具有多个小脂滴和丰富的线粒体⁵。解偶联蛋白 1（UCP1，也称为热原蛋白）由棕色和棕色脂肪细胞独特表达，并介导线粒体内膜 （IMM） 中的质子泄漏，从而解开 ATP 合成的电子传递并产生热量。BAT 中的非颤抖产热由去甲肾上腺素 （NE） 激活，去甲肾上腺素在冷刺激下从 BAT 的交感神经末梢释放⁶。NE 与棕色脂肪细胞表面的 β-肾上腺素能受体（主要是 β 3）结合，并触发细胞内 cAMP 介导的信号级联反应。这导致 TAG 脂肪分解、线粒体脂肪酸的 β 氧化以及 UCP1 激活时的热量产生³。棕色脂肪细胞中脂滴和线粒体之间的密切功能关系具有结构上的相似性，例如这些细胞器在大且物理接触非常紧密的区域中的相互作用 ^7,8。

iBAT具有丰富的血管和交感神经^末梢9。这些结构与前脂肪细胞、免疫细胞、成纤维细胞和细胞外基质分子一起组成脂肪基质血管部分 （SVF）¹⁰。据报道，许多方案可从前脂肪细胞^{11、12、13、14、15} 产生成熟的脂肪细胞（补充表 1）;然而，它们在组织处理和分化培养基的组成方面表现出极大的变化。本文描述的方案允许有效和可重复地分化棕色脂肪细胞，这些棕色脂肪细胞（1）表达关键的脂肪生成转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和CCAAT /增强子结合蛋白α（C / EBPα），（2）表达成熟的脂肪细胞标志物perilipin1（PLIN1）和簇决定簇36（CD36），（3）积累丰富的脂滴，（4）具有高线粒体质量和高丰度的OXPHOS复合物， （5） 具有产热潜力，由高水平的 UCP1 确定，以及 （6） 具有与成熟棕色脂肪细胞表型相关的线粒体形态变化。该方法用于研究广泛性脂肪营养不良的分子机制 15,16,17。

研究方案

动物程序得到了智利天主教大学的机构动物护理和使用委员会的批准。本研究采用来源于C57BL/6J和129J品系混合背景的P0.5两性新生小鼠。

1. 组织提取

1. 用70%乙醇溶液清洁和消毒工作台，并使用无菌手术材料。
2. 按照机构批准的方案，用手术剪刀斩首对 P0.5 新生儿幼崽实施安乐死。
3. 将鼠标置于俯卧位（面朝下），并使用锋利的剪刀在动物背部中部的皮肤上切一个 1 厘米长的切口。小心地去除皮肤。
   注意:此步骤至关重要，因为如果皮肤没有很好地去除，它可能会撕裂和损坏 iBAT，并妨碍 SVF 的最佳准备。
4. 使用小剪刀通过手术将 iBAT 从胴体上分离。
   注意:iBAT 被可视化为两个可以独立去除的脂肪小叶。
5. 使用弯尖钳独立移除裂片，收获两个 iBAT 裂片。
6. 在室温下将两个裂片放入装有 1.5 mL 无菌 PBS 的塑料管中。将组织保持在各自的管中，直到完成所有所需幼崽的组织提取。

2. 组织消化

1. 将 300 μL II 型胶原酶消化缓冲液（缓冲液中的 0.2% II 型胶原酶 [25 mM KHCO₃、1.2 mM MgSO₄、120 mM NaCl、5 mM 葡萄糖、12 mM KH₂PO₄、4.8 mM KCl、1.2 mM CaCl₂、2.5% BSA 和 1% 青霉素/链霉素，pH 7.4]）（表 1）放入生物安全柜中的 1.5 mL 管中。
   注意:为要提取的单个组织的数量准备足够的试管。在本研究中，使用了七根管子，对应一窝七只幼崽。
2. 移至工作台上，将iBAT裂片置于II型胶原酶消化缓冲液中，以降解细胞外基质。
3. 将iBAT组织在37°C下孵育45分钟，以800rpm连续轻轻摇动（图1）。

3. 组织处理

注意:消化后，在II类层流组织培养罩中执行以下所有步骤。

1. 为每个单独的样品准备并标记两组 1.5 mL 塑料管。
2. 通过使用P1,000微量移液管和过滤吸头上下移液，机械地破坏II型胶原酶消化缓冲液中的组织悬浮液。为每个样品使用新的吸头。
   注意:这是一个关键步骤。确保用吸头和移液管上下机械地解解组织，直到宏观均质化完成。
3. 将分解的组织通过单独的 100 μm 细胞过滤器（参见 材料表）放入新的 1.5 mL 管中。
4. 向过滤的组织样品中加入 500 μL ACK 缓冲液（参见 材料表），倒置试管 4-5 次，并在室温下孵育 4 分钟。
   注意:不要超过孵育时间，因为这可能会损坏感兴趣的细胞。
5. 在室温下以300× g 离心组织样品5分钟。
6. 通过倒置试管弃去上清液，并将沉淀重悬于 1 mL 培养基（DMEM-F12 与 10% FBS，1% 抗生素抗真菌剂，pH 7.2）中（参见 材料表）。
7. 使用 P1,000 微量移液器和过滤吸头将悬浮液通过 40 μm 细胞过滤器放入新的 1.5 mL 管中。
8. 在室温下以300× g 离心样品5分钟。
   注:该沉淀对应于含有前脂肪细胞的SVF。
9. 通过倒置试管弃去上清液，并通过移液将沉淀重悬于 1 mL 培养基中。
10. 通过加入 5 mL 培养基，为每个样品制备一个 15 mL 管。
11. 将每个重悬的沉淀加入含有 5 mL 培养基的相应 15 mL 管中。将试管倒置 4-5 次以混合细胞内容物。
12. 通过向每个孔中加入 1 mL 悬浮液，将每个样品接种到 24 孔培养板的六个孔中（图 1）。

4. 基质血管分数 （SVF） 培养

1. 每隔一天更换一次培养基，直到细胞达到 100% 汇合。
   注:在此期间，非塑料贴壁细胞被去除，导致原代培养物富含含有前脂肪细胞的 SVF。
2. 当细胞达到 100% 汇合时，取出培养基，并用 800 μL 无菌 PBS 洗涤细胞。
3. 向每个孔中加入 150 μL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（参见 材料表），并将培养板在培养箱中放置 3 分钟以分离细胞。
   注意:使用相差光学显微镜验证细胞是否已分离。
4. 通过向每个孔中加入 850 μL 培养基来灭活胰蛋白酶。
5. 从步骤 3.12 中接种的六个孔中收集细胞，并将它们转移到 15 mL 管中。
6. 通过添加 6 mL 培养基，使总体积达到 12 mL。将试管倒置 4-5 次以混合内容物。
7. 将 1 mL 样品接种到 12 孔板的每个孔中。每隔一天更换一次培养基，直到细胞达到汇合。
8. 当细胞达到 100% 汇合时，按照与步骤 4.3 相同的孵育条件用 150 μL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 分离它们，并根据实验所需的孔的表面积接种它们。
9. 按照步骤 8 固定细胞后进行高分辨率成像。
   注:建议密度为 35,000 个细胞/cm² 用于进一步实验（蛋白质和总 RNA 提取，330,000 个细胞 [6 孔板的一个孔];免疫荧光 [IF]，10,500 个细胞 [96 孔板的一个孔]）。

5. 成脂分化

1. 将细胞与诱导培养基（DMEM-F12，含10%FBS，1%抗生素抗真菌剂，pH 7.2，补充有500nM地塞米松，125nM吲哚美辛，0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤[IBMX]，5μM罗格列酮，1nM T3和20nM胰岛素）（表1）孵育72小时（第0天至第2天）（图2）。
   注意:培养基必须每隔一天更换一次;因此，第一次培养基变化必须发生在初次诱导后的第 2 天。
2. 在第 3 天更换维持培养基（DMEM-F12 含 10% FBS、1% 抗生素抗真菌剂，pH 7.2，补充 5 μM 罗格列酮、1 nM T3 和 20 nM 胰岛素）（表 1），并将该维持培养基维持至第 7 天（图 2）。
   注意: 必须在第 5 天和第 7 天更换维护介质。从分化的第3天开始，可以通过相差显微镜观察小脂滴。大脂滴在分化第 7 天很明显。分化过程超过 7 天会导致细胞脱离损失，这可能是由于富含脂质的细胞的高浮力所致。

6.细胞匀浆制备

1. 在分化的第 0 天和第 7 天去除培养基，并用无菌 PBS 洗涤细胞 3 次。
2. 最后一次清洁后，向每个孔中加入 1.3 mL 无菌 PBS。
   注意:将细胞保持在冰中，直到清洁最后一个板。
3. 用细胞刮刀从 6 孔板（~330,000 个细胞）的一个孔中机械收获细胞，并将细胞悬浮液放入 1.5 mL 管中。
4. 将样品在4°C下以2,800× g 离心5分钟。
5. 用微量移液管取出PBS，并将试管保持在冰上。
6. 将细胞沉淀重悬于含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中（参见 材料表），并在冰上孵育30分钟。
   注:要裂解细胞沉淀，70-80 μL 就足够了。
7. 将样品在4°C下以21,000× g 离心15分钟。
8. 小心地将上清液移至 1.5 mL 管中，然后弃去沉淀。
   注:上清液代表细胞匀浆。
9. 使用二辛可宁酸（BCA）确定细胞匀浆的蛋白质浓度，用于总蛋白质的比色检测和定量^18,19。

7. 蛋白质印迹

1. 制备30μg细胞匀浆（来自步骤6.8）并加入市售的SDS-PAGE样品上样缓冲液（参见 材料表）。
2. 根据每种蛋白质的分子量在聚丙烯酰胺凝胶电泳-SDS²⁰ （PAGE-SDS）中分离。
   注:PPARγ、C/EBPα、PLIN1、CD36 和 UCP1 使用 10% PAGE-SDS，OXPHOS 使用 12% PAGE-SDS，TOM20 使用 15% PAGE-SDS（参见 材料表）。
3. 将蛋白质以 350 mA 电转印到 PVDF 膜（参见 材料表）上 2 小时。
   注意:冰容器必须在 1 小时后更换。在整个过程中，将腔室保持在冰上。
4. 按照抗体数据表中的建议，用5%BSA或Tris缓冲盐水（TBS）0.1%吐温20（TBS-T）中的无脂牛奶封闭膜2小时。
5. 与一抗（本研究中使用的抗体在 材料表中有详细说明）在4°C下孵育过夜。
   注:本研究中使用的所有抗体均在封闭溶液中稀释至 1:1,000。
6. 用 0.1% TBS-T 洗涤膜 3 次，并在室温下将它们与辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联的二抗（参见 材料表）孵育 2 小时。
7. 用 0.1% 洗涤膜 3 次。TBS-T型用 1x TBS 进行最后一次洗涤。 将膜储存在 1x TBS 中直至可视化。建议最多储存 1 小时。
8. 通过化学发光²⁰ 或任何其他优选方法观察膜。

8. 高分辨率成像

1. 按照以下步骤进行免疫荧光测定。
   1. 在具有光学底部的96孔板中，从P0.5新生小鼠（遵循步骤4.8）中接种并分化棕色前脂肪细胞的原代培养物（参见 材料表）。
   2. 在分化的第 0 天和第 7 天用 4% PFA 固定细胞 20 分钟，并用无菌 PBS 洗涤 3 次。
   3. 用0.1%Triton X-100透化细胞15分钟，并在室温下用3%鱼明胶（参见 材料表）封闭它们1小时。
   4. 用无菌 PBS 洗涤 3 次，并在 4 °C 的潮湿室中与 PLIN1 抗体（1:400，参见 材料表）在 1% BSA/PBS 中孵育过夜。
   5. 用无菌 PBS 洗涤 3 次，并在室温下与荧光团偶联的二抗以 1:1,000 （1% BSA/PBS）（参见 材料表）孵育 1 小时。
   6. 在室温下用 1 μg/mL Hoechst 33342 染色细胞核，用 1 μg/mL BODIPY 染色脂滴 30 分钟。
      注:荧光图像是使用细胞成像系统获取的（参见 材料表）。总体而言，每孔使用 2 到 3 个通道采集 9 或 16 张照片，放大倍率为 20 倍。
2. 按照以下步骤进行透射电子显微镜检查。
   1. 在 35 mm x 10 mm 细胞培养皿中培养和分化棕色前脂肪细胞。
   2. 在分化的第 0 天和第 7 天，取出培养基，并用 2.5% 戊二醛在 0.1M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.0）中固定细胞 1 小时（参见 材料表）。
   3. 用 0.05 M 二甲胂酸钠缓冲液洗涤细胞 3 次 10 分钟，并用 1% 四氧化锇水溶液（参见 材料表）处理 15 分钟。
   4. 用双蒸水洗涤细胞 3 次 5 分钟，并用 1% 醋酸铀酰水溶液（参见 材料表）处理 15 分钟。
   5. 每次用30%，50%，70%，95%和100%的乙醇梯度脱水细胞5分钟。
   6. 将细胞预埋在 1:1 epon/乙醇中 30 分钟，然后在 epon 中 1 小时（参见 材料表）。
      注:通过添加新鲜的 epon 覆盖整个细胞培养单层，直接在培养皿中加入细胞。让epon在60°C的烤箱中聚合24小时。
   7. 将细胞培养皿浸入液氮中2分钟，然后用钳子将其折断以松开塑料夹杂物。
   8. 在超薄切片机中将带有细胞的包涵物片段粘附到树脂块上，以获得平行于表面的精细切割（80nm）（参见 材料表）。
   9. 根据Reynolds等人²¹，用1%醋酸铀酰水溶液染色切口4分钟，用柠檬酸铅染色5分钟。
   10. 在电子显微镜中观察网格（参见 材料表）。

结果

脂肪生成受转录因子网络的调节，这些转录因子负责诱导棕色脂肪细胞形成和功能的关键蛋白的表达²²，包括经典的脂肪生成调节因子，如 PPARγ 和 C/EBPα 23,24,25，^以及成熟脂肪细胞的标志物 ^26,27.通过测试允许获取产热棕色脂肪表型的不同浓度的罗格列酮，本文描述...

讨论

本方案是一种简单且可复制的两阶段分化程序（图2），用于产生具有成熟棕色脂肪细胞分子和形态特征的细胞。手术收获 iBAT 是第一个关键步骤，因为组织撕裂严重限制了起始材料的活力。组织处理也是关键，因为不含碎片的均质细胞悬液会大大增加可培养的 SVF 量。在目前的研究中，使用 100 μm 和 40 μm 细胞过滤器进行两次过滤，而其他方案仅使用 100 μm 细胞过滤器 11,12,1...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Tris/Glycine Buffer	BioRad	1610734
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	15710
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish	Falcon	353001
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Calbiochem	410957
40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	1610148
6-well plate	SPL Life Science	-
96 well optical black w/lid cell culture sterile	Thermo Scientific	165305
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Ammonium Persulfate	BioRad	1610700
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7076
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074
Blotting-grade blocker	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
BSA	Sigma	A1470
C/EBPα antibody	Cell Signaling	2295
CaCl2	Calbiochem	208291
CD36 antibody	Invitrogen	PA1-16813
Cell Strainer 100 µm, nylon	Falcon	352360
Cell Strainer 40 µm, nylon	Falcon	352340
Collagenase type II	Gibco	17101-015
Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Biotek
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Ethanol absolute	Merck	100983
Fetal bovine serum	Gibco	16000-044
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7041
Glucose	Gibco	15023-021
Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16210
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11012
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78427
Halt Protease Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78429
Hoechst 33258	Invitrogen	H1398
Immun-Blot PVDF Membrane	BioRad	1620177
Indomethacin	Sigma	I7378
Insulin	Sigma	I3536
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO3	Sigma	60339
Lane Marker Reducing Sample Buffer	Thermo Scientific	39000
MgSO4	Sigma	M2643
MilliQ water sterile	-	-
Mitoprofile Total OXPHOS Rodent WB antibody Cocktail	Abcam	MS604
NaCl	Merck	1064041000
OmniPur 10x PBS Liquid Concentrate	Calbiochem	6505-OP
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19100
Perilipin 1 antibody	Cell Signaling	9349
PPARγ (81B8) antibody	Cell Signaling	2443
RIPA buffer lysis	Thermo Scientific	89901
Rosiglitazone	Merck	557366
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Cacpdylate	Electron Microscopy Sciences	12300
Sodium Dodecyl Sulfate	BioRad	1610301
T3	Sigma	T6397
Talos F200C G2	Thermo Scientific
TEMED	BioRad	1610800
TOM20 antibody	Cell Signaling	42406
Tris Buffered Saline (TBS-10X)	Cell Signaling	12498
Triton X-100	Sigma	93443
Trypsin-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056
Tween 20, Molecular Biology Grade	Promega	H5152
UCP1 antibody	Cell Signaling	14670
Ultracut R	Leica
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Westar Sun	Cyanagen	XLS063
Westar Supernova	Cyanagen	XLS3