JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

تم إنشاء عدة أنواع من النماذج الحيوانية لالتهاب الغدة الدرقية هاشيموتو ، وكذلك التهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي التلقائي في فأر NOD. الفئران H-2h4 هي نموذج بسيط وموثوق لتحريض HT. توضح هذه المقالة هذا النهج وتقيم العملية المرضية لفهم أفضل لنموذج الفئران SAT.

Abstract

في السنوات الأخيرة ، أصبح التهاب الغدة الدرقية هاشيموتو (HT) أكثر أمراض الغدة الدرقية المناعية الذاتية شيوعا. يتميز بتسلل الخلايا اللمفاوية والكشف عن الأجسام المضادة الذاتية المحددة في الدم. على الرغم من أن الآلية المحتملة لا تزال غير واضحة ، إلا أن خطر الإصابة بالتهاب الغدة الدرقية هاشيموتو مرتبط بعوامل وراثية وبيئية. في الوقت الحاضر ، هناك عدة أنواع من نماذج التهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي ، بما في ذلك التهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي التجريبي (EAT) والتهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي التلقائي (SAT).

EAT في الفئران هو نموذج شائع ل HT ، والذي يتم تحصينه مع عديد السكاريد الدهني (LPS) جنبا إلى جنب مع ثيروجلوبولين (Tg) أو تستكمل مع مساعد فرويند الكامل (CFA). تم تأسيس نموذج الماوس EAT على نطاق واسع في العديد من أنواع الفئران. ومع ذلك ، من المرجح أن يرتبط تطور المرض باستجابة الأجسام المضادة Tg ، والتي قد تختلف في التجارب المختلفة.

يستخدم SAT أيضا على نطاق واسع في دراسة HT في NOD. ماوس H-2H4. الإيماءة. الماوس H2h4 هو سلالة جديدة تم الحصول عليها من صليب فأر السكري غير البدين (NOD) مع B10. A (4R) ، والذي يتم تحريضه بشكل كبير ل HT مع أو بدون تغذية اليود. أثناء الحث ، NOD. يحتوي فأر H-2h4 على مستوى عال من TgAb مصحوبا بتسلل الخلايا الليمفاوية في الأنسجة المسامية الدرقية. ومع ذلك ، بالنسبة لهذا النوع من نماذج الماوس ، هناك عدد قليل من الدراسات لتقييم شامل للعملية المرضية أثناء تحريض اليود.

تم إنشاء نموذج فأر SAT لأبحاث HT في هذه الدراسة ، ويتم تقييم عملية التغيير المرضي بعد فترة طويلة من تحريض اليود. من خلال هذا النموذج ، يمكن للباحثين فهم التطور المرضي ل HT بشكل أفضل وفحص طرق العلاج الجديدة ل HT.

Introduction

تم الإبلاغ عن التهاب الغدة الدرقية هاشيموتو (HT) ، المعروف أيضا باسم التهاب الغدة الدرقية الليمفاوي المزمن أو التهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي ، لأول مرة في عام 19121. يتميز HT بتسلل الخلايا اللمفاوية وتلف الأنسجة المسامية الدرقية. تتجلى الاختبارات المعملية بشكل أساسي في زيادة الأجسام المضادة الخاصة بالغدة الدرقية ، بما في ذلك الأجسام المضادة لهرمون الغدة الدرقية (TgAb) والأجسام المضادة للبيروكسيديز المضاد للغدة الدرقية (TPOAb) 2. يتراوح معدل الإصابة ب HT بين 0.4٪ -1.5٪ ، وهو ما يمثل 20٪ -25٪ من جميع أمراض الغدة الدرقية ، وقد زادت هذه القيمة في السنوات الأخيرة3. بالإضافة إلى ذلك ، أفاد عدد كبير من الدراسات أن HT يرتبط بتكوين الأورام وتكرار سرطان الغدة الدرقية الحليمي (PTC)4,5 ؛ الآليات المحتملة لا تزال مثيرة للجدل. التهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي هو أيضا عامل مهم في العقم عند النساء6. لذلك ، يجب أن يكون التسبب في HT واضحا ، حيث يعد النموذج الحيواني المستقر والبسيط ضروريا.

لدراسة مسببات HT ، تم استخدام نوعين رئيسيين من نماذج الفئران ، بما في ذلك التهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي التجريبي (EAT) والتهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي التلقائي (SAT) في الدراسات الحالية 7,8. تم تحصين الفئران الحساسة بمستضدات الغدة الدرقية المحددة (بما في ذلك الغدة الدرقية الخام ، وثيروجلوبولين المنقى [TG] ، وبيروكسيديز الغدة الدرقية [TPO] ، والمجال الخارجي ل TPO المؤتلف ، وببتيدات TPO المختارة) لإنشاء نموذج الفئران EAT. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا استخدام المواد المساعدة ، بما في ذلك عديد السكاريد الشحمي (LPS) ، ومساعد فرويند الكامل (CFA) ، وغيرها من المواد المساعدة غير العادية ، أثناء التحصين لتحطيم التسامح المناعي9،10،11،12،13،14،15،16،17.

نموذج SAT هو نموذج مهم لدراسة التطور التلقائي لالتهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي ، والذي يعتمد على NOD. الفئران H-2H4. الإيماءة. الماوس H-2h4 هو سلالة جديدة تم الحصول عليها من صليب NOD و B10. الفئران A (4R) ، تليها عدة تهجينات خلفية إلى NOD ، مع جين الحساسية لالتهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي IAk18,19. موافقه. لا تصاب الفئران H-2h4 بمرض السكري ، ولكن لديها نسبة عالية من التهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي ومتلازمة سجوجرن (SS) 19. وقد وجدت الدراسات أن جزيء الالتصاق داخل الخلايا -1 (ICAM-1) يتم التعبير عنه بشكل كبير في أنسجة الغدة الدرقية من NOD. الفئران H-2h4 في 3-4 أسابيع من العمر. علاوة على ذلك ، مع زيادة تناول اليود ، يتم تعزيز مناعة جزيء ثيروجلوبولين ، مما يزيد من تنظيم التعبير عن ICAM-1 ، الذي يلعب دورا مهما في عملية تسلل الوحيدات21. يحاكي هذا النموذج عملية المناعة الذاتية مع التحقق من العلاقة بين جرعة اليود وشدة المرض. الطريقة المعمول بها مستقرة ، مع احتمال كبير للنجاح. تم تطبيق نموذج SAT للحث على التهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي لسنوات عديدة ولا يزال وسيلة فعالة لدراسة التسبب في التهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي. ومع ذلك ، فإن طريقة البناء الحالية لنموذج EAT أكثر تعقيدا وتكلفة. تستخدم المختبرات المختلفة طرق تحصين ومواقع حقن مختلفة. علاوة على ذلك ، فإن الفئران ذات الخلفيات الجينية المختلفة لديها معدلات مختلفة من الحث ، والتي تحتاج إلى مزيد من الدراسة للكشف عن الآلية القوية.

ومع ذلك ، يرتبط تطور التهاب الغدة الدرقية في نموذج SAT بيوديد الصوديوم ، وإزدواج الشكل الجنسي ، وظروف التربية. للكشف عن الإجراء المناسب لالتهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي في نموذج SAT ، وصفت هذه المقالة طريقة تحريض التهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي في ظروف مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يسمح لدراسة التسبب والتقدم المناعي لالتهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي في مراحل مختلفة من هذا المرض.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول الموضح أدناه من خلال إرشادات الرعاية والاستخدام التي وضعتها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان بجامعة سيتشوان.

1. التحضير

  1. إيواء جميع الفئران في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض تحت دورات الضوء والظلام لمدة 12 ساعة (تبدأ في الساعة 07:00 صباحا و 07:00 مساء على التوالي). الحفاظ على درجة حرارة الغرفة عند 22 درجة مئوية. تغيير مواد الفراش كل أسبوع. توفير كميات كافية من تشاو القوارض القياسية والماء.
  2. عند تحضير محلول مخزون NaI في الماء ، قم بوزن 2.5 جم من المركب وقم بإذابته في 50 مل من الماء النقي المعقم تحت الدوامة لإعطاء محلول مخزون بنسبة 5٪. قم بتخزين محلول المرق هذا في مجمد 4 درجات مئوية ، مع تجنب الضوء ، لمدة تصل إلى 8 أسابيع.
  3. لتحضير محلول عملي من NaI ، ارسم 2.5 مل من محلول المرق وقم بإذابته في 250 مل من الماء العادي كمياه شرب يومية ل NOD. الفئران H-2h4 ، لإعطاء حل عملي بنسبة 0.05 ٪.

2. تحريض التهاب الغدة الدرقية

  1. نموذج SAT
    1. تحضير إيماءة. الفئران H-2H4 (8 أسابيع من العمر) للدراسة من خلال إيواء جميع الفئران من جنس واحد (بدون إزدواج الشكل الجنسي) في أقفاص حاجزة (خمسة لكل قفص) مع ظروف التغذية الموضحة في الخطوة 1.1.
    2. للحث على التهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي في NOD. الفئران H-2h4 ، إطعام جميع الفئران مع 0.05 ٪ NaI لمدة 8 أسابيع. قم بتغيير ماء NaI كل أسبوع وقم بتقييم حالة الفئران على أساس أسبوعي ، بما في ذلك المظهر والوزن والشهية والحالة العقلية والحركة.
  2. نموذج أكل
    1. قم بإعداد الفئران BALB / c (8 أسابيع من العمر) للدراسة عن طريق إيواء جميع الفئران من جنس واحد (بدون إزدواج الشكل الجنسي) في أقفاص حاجزة (خمسة لكل قفص) مع ظروف التغذية الموضحة في الخطوة 1.1. إطعام جميع الفئران مع 0.05 ٪ NaI لمدة 8 أسابيع.
    2. خلال أول أسبوعين ، حقن تحت الجلد خليط من CFA و Tg (200 ميكرولتر) مرة واحدة في الأسبوع.
    3. من الأسبوع الثالث فصاعدا ، حقن تحت الجلد خليط من IFA و Tg (200 ميكرولتر) مرة واحدة في الأسبوع لمدة 3 أسابيع.

3. القياسات

  1. تحضير عينات الدم المحيطية
    1. بعد الحث ، قم بتخدير الفئران بحجم 0.01 مل / جرام مخدر عن طريق الحقن داخل الصفاق. تحضير المخدر عن طريق خلط ميدازولام (40 ميكروغرام / 100 ميكرولتر للتخدير) ، ميديتوميدين (7.5 ميكروغرام / 100 ميكرولتر للتخدير) ، وطرطرات بوتورفانول (50 ميكروغرام / 100 ميكرولتر للتسكين) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
      ملاحظة: التركيزات المحددة لكل مكون في خليط التخدير هي: ميدازولام 13.33 ميكروغرام / 100 ميكرولتر ، ميديتوميدين 2.5 ميكروغرام / 100 ميكرولتر ، وبوتورفانول 16.7 ميكروغرام / 100 ميكرولتر. بالنسبة للجرعات المحددة المستخدمة في الفئران ، فإن الجرعات هي: ميدازولام 4 ميكروغرام / جم ، ميديتوميدين 0.75 ميكروغرام / جم ، وبوتورفانول 1.67 ميكروغرام / جم. تم تأكيد عمق التخدير عندما ارتخت عضلات طرف الفأر ، ولم يكن للشعيرات استجابة للمس ، وكان هناك فقدان لمنعكس الدواسة.
    2. بعد تخدير الفئران ، قم بإعداد عينات الدم المحيطية ، عن طريق تثبيت الماوس بيد واحدة والضغط على جلد العين لإبراز مقلة العين. ثم ، أدخل الأنبوب الشعري في الزاوية الداخلية للعين واخترق بزاوية 30-45 درجة إلى مستوى فتحة الأنف. اضغط أثناء تدوير الأنبوب الشعري برفق. سوف يتدفق الدم إلى الأنبوب عن طريق العمل الشعري.
    3. ضع الدم في ثلاجة 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة ثم الطرد المركزي على حرارة 1000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على العينة. لمزيد من التحليل ، قم بتخزين بقية العينة في -80 درجة مئوية.
  2. تحضير عينات أنسجة الغدة الدرقية
    1. القتل الرحيم للحيوان بشكل إنساني وفقا للسياسات المؤسسية. بعد ذلك ، قم بتشريح جدار الصدر لكشف القلب ، وقطع الأذين الأيمن ، وضخ محلول ملحي في البطين الأيسر بواسطة إبرة تسريب في الوريد متصلة بحقنة سعة 20 مل حتى يتحول النسيج إلى اللون الأبيض.
    2. إصلاح الماوس على طاولة تشريح مع دبابيس. تعقيم الرقبة مع 75 ٪ من الإيثانول. قطع جلد الفأر على طول الخط المتوسط للرقبة من أعلى القص إلى الفك السفلي بمقص الأنسجة لفضح أنسجة الرقبة تماما.
    3. راقب زوج الغدد الوردية ، الغدد تحت الفك السفلي ، والتي تحتها عضلة القصبة الهوائية الأمامية. افصل الغدد والعضلات بمقص العيون والملقط لكشف القصبة الهوائية وغضروف الغدة الدرقية.
    4. افصل الأنسجة تحت الغضروف باستخدام ملقط منحني لالتقاط الغضروف والقصبة الهوائية معا. قطع الأطراف البعيدة والقريبة من الغضروف والقصبة الهوائية ، على التوالي ، وإزالة الغدة الدرقية مع القصبة الهوائية.
    5. تزج الغدد في 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 12-24 ساعة. ثم ، نقل الأنسجة إلى 70 ٪ من الإيثانول.
    6. ضع الفصوص الفردية لمواد خزعة الغدة الدرقية في أشرطة المعالجة وقم بتجفيفها من خلال تدرج الكحول التسلسلي التالي: 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 95٪ ، 100٪ ، 100٪ ، إيثانول لمدة 40 دقيقة لكل منهما ؛ 1/2 زيلين + 1/2 إيثانول مطلق لمدة 2 ساعة ؛ 100٪ زيلين لمدة 1.5 ساعة ؛ 100٪ زيلين لمدة 1.5 ساعة ؛ 1/2 زيلين + 1/2 بارافين لمدة 2 ساعة ؛ فرن على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة ؛ البارافين الأول لمدة 30 دقيقة ؛ والبارافين الثاني لمدة 30 دقيقة. قم بتضمينها في كتل شمع البارافين.
    7. قبل التلوين ، قم بإزالة الشمع من أقسام أنسجة الغدة الدرقية بسمك 5 ميكرومتر في الزيلين (على النحو التالي) وإعادة الترطيب من خلال التركيزات المتناقصة التالية من الإيثانول: زيلين I لمدة 10 دقائق ؛ زيلين الثاني لمدة 10 دقائق ؛ زيلين الثالث لمدة 10 دقائق ؛ الإيثانول المطلق الأول لمدة 5 دقائق ؛ الإيثانول المطلق II لمدة 5 دقائق ؛ 90٪ كحول لمدة 5 دقائق ؛ 80 ٪ الكحول لمدة 5 دقائق ؛ 70 ٪ الكحول لمدة 5 دقائق ؛ و 50٪ كحول لمدة 5 دقائق.
    8. تلطيخ الأنسجة مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E). وصمة عار مع الهيماتوكسيلين لمدة 15 دقيقة ، وشطف بماء الصنبور لمدة 15 دقيقة ، إضافة 1 ٪ من الإيثانول حمض الهيدروكلوريك لمدة 10 ثوان ، شطف بالماء الجاري ، ثم مع 50 ٪ ، 70 ٪ ، و 80 ٪ من الإيثانول ، كل لمدة 3 دقائق. أداء 0.5 ٪ يوزين الإيثانول تلطيخ لمدة 2 دقيقة وشطف بالماء الجاري. ضع أقسام البارافين على التوالي في 75٪ إيثانول لمدة 2 دقيقة ، و 85٪ إيثانول لمدة 2 دقيقة ، وإيثانول مطلق لمدة 5 دقائق ، وزيلين لمدة 5 دقائق. إصلاح شرائح مع اللثة محايدة والشرائح الزجاجية.
    9. لتقييم مدى التهاب الغدة الدرقية الليمفاوي ، سجل أقسام الغدة الدرقية على النحو التالي: 0: تسلل الخلايا الليمفاوية قليلا أو معدوما في أنسجة الغدة الدرقية. 1+: يتم تسلل أكثر من 1/8 من الغدة في بؤرة واحدة أو عدة بؤر ؛ 2+: لا يتم تسلل أكثر من 1/4 من الغدة مع الخلايا الليمفاوية. 3+: 1 / 4-1 / 2 من الغدة مخترقة بالخلايا الليمفاوية. 4+: يتم تدمير أكثر من 1/2 من الغدة.
      ملاحظة: يوصى بإزالة غضروف الغدة الدرقية للحفاظ على الهيكل الكامل للغدة الدرقية للفأر ، وهو صغير جدا بحيث لا يمكن إزالته من القصبة الهوائية.
  3. قياس TPOAb
    ملاحظة: تم إنشاء خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) التي تعبر بثبات عن TPO للفأر في مختبرنا. تم استئصال الحمض النووي للفأر TPO بواسطة XbaI و NheI. بعد ذلك ، تم نقل cDNA إلى pcDNA5 / FRT. بعد بناء البلازميد بنجاح ، تم نقله إلى خلايا CHO واختياره باستخدام hygromycin B (100 جم / مل).
    1. بعد بناء خلايا mTPO-CHO ، قم بتخفيف أمصال الماوس من الخطوة 3.1.3 (1:50) واحتضانها بخلايا mTPO-CHO لمدة ساعتين. بعد الحضانة ، استبعد تلطيخ الخلايا باستخدام يوديد البروبيديوم (1 جم / مل) وقم بتحليل العينة عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الفلوريسئين إيزوثيوسيانات المترافق ، الماعز المنقى المتقارب المضاد للفأر IgG. فحص مجموعات الخلايا المفردة الباقية بواسطة قنوات FSC-A و SSC-A وتحديد الخلايا الموسومة ب FITC و PI من مجموعات الخلايا المفردة21.
    2. قم بتضمين مصل الفئران غير المحصنة BALB / c أو C57BL / 6 المرتبطة ب IgG كعنصر تحكم سلبي. قم بتضمين الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للفأر ل TPO22 البشري كعناصر تحكم إيجابية تتعرف على الفأر TPO23. التعبير عن بيانات ربط TPO كوسيلة هندسية.
  4. قياس TgAb
    ملاحظة: استخدم مجموعة ELISA للكشف عن ثايروجلوبولين باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    1. تمييع العينات القياسية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وفقا للتعليمات. أخرج المجموعة من الثلاجة واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    2. قم بتعيين الآبار القياسية والآبار الفارغة وآبار الاختبار. تحصل الآبار الفارغة على المخزن المؤقت فقط ، بينما تحصل الآبار القياسية على حلول قياسية. أضف 10 ميكرولتر من العينات إلى آبار الاختبار. عند إضافة العينات ، حاول ألا تلمس جدران الآبار ، وهز اللوحة برفق لنقل العينات إلى قاع الآبار.
    3. قم بتضمين مصل من الفئران BALB / c المحصنة ب Tg و CFA و IFA24 كعنصر تحكم إيجابي ومصل من NOD البالغ من العمر 8 أسابيع. الفئران H-2h4 على الماء العادي كعنصر تحكم سلبي.
    4. احتضان العينات في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تمييع العازلة الغسيل بالماء المقطر بنسبة 1:30. بعد ذلك ، قم بإزالة فيلم الختم ، وتخلص من السائل الموجود داخل لوحة الإنزيم واتركه حتى يجف على ورق ماص ، وأضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل لمدة 30 ثانية. كرر هذا الإجراء خمس مرات ثم جفف الآبار.
    5. أضف 50 ميكرولتر من كاشف وضع العلامات على الإنزيم إلى كل بئر ، باستثناء الآبار الفارغة ، واحتضانها في حمام مائي 37 درجة لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة فيلم الختم ، وتخلص من السائل الموجود داخل لوحة الإنزيم ، واتركه حتى يجف على ورق ماص.
    6. أضف 50 ميكرولتر من المطور A إلى كل بئر متبوعا ب 50 ميكرولتر من المطور B ورج الآبار برفق لخلطها لمدة 5 دقائق. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإنهاء في كل بئر لمدة 15 دقيقة لإيقاف التفاعل. قم بقياس امتصاص (OD) لكل بئر بطول موجي 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. قدم بيانات TgAb ككثافة ضوئية (OD) عند 490 نانومتر.
  5. قياس T4 والهرمون المنبه للغدة الدرقية (TSH)
    ملاحظة: قم بقياس مستويات T4 و TSH (في حصص 10 ميكرولتر) بواسطة ELISA باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    1. تمييع الإنزيم المترافق إلى 1:11 مع مخفف المقايسة ؛ خفف العينات المراد قياسها (1: 100) باستخدام 0.01 M PBS.
    2. أضف 10 ميكرولتر من المعيار والعينة إلى الآبار المقابلة ، وأضف 100 ميكرولتر من الإنزيم المترافق إلى كل بئر ، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    3. تخلص من السائل في الآبار وقم بتنظيفه باستخدام عازل الغسيل ثلاث مرات.
    4. أضف 100 ميكرولتر من 3،3 '، 5،5'-رباعي ميثيل البنزيدين (TMB) واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    5. أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف واخلطه برفق لمدة 15-20 ثانية.
    6. حدد الامتصاص (OD) باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة بطول موجي 450 نانومتر واحسب تركيز العينة.
    7. استخدم البرامج الإحصائية لإجراء اختبار t أو اختبار مجموع الرتب ورسم النتائج.

النتائج

كانت التغيرات النسيجية مختلفة بشكل لافت للنظر في الإناث والذكور ، ومدة تناول اليود ، وحل NaI. كما هو موضح في الشكل 1 ، ~ 10٪ من NOD. طورت الفئران H-2h4 SAT حتى بدون تحريض اليود في عمر 24 أسبوعا ، وطورت جميع الفئران في النهاية التهاب الغدة الدرقية. عند إعطاء الماء العادي ، لم يكن هناك فرق...

Discussion

يحدث HT بسبب اضطراب في جهاز المناعة الذاتية الناجم عن الخلايا الليمفاوية التي تتسلل إلى الغدة الدرقية ، مما يزيد من ضعف وظيفة الغدة الدرقية ، مع إنتاج أجسام مضادة خاصة بالغدة الدرقية. مستويات مصل TSH و TgAb و TPOAb في مرضى HT مرتفعة بشكل ملحوظ27. في الوقت الحاضر ، يتم استخدام نوعين رئيس?...

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم توفير الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للفأر ل TPO البشري (المستخدمة كضوابط إيجابية) من قبل الدكتور P. Carayon والدكتور J. Ruf (مرسيليا ، فرنسا). يشكر المؤلفون جميع المشاركين في هذه الدراسة وأعضاء فريق البحث لدينا. تم دعم هذا العمل جزئيا بمنح من صندوق دعم ما بعد الدكتوراه لمستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان ، الصين (2020HXBH057) وبرنامج دعم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (رقم المشروع 2021YFS0166)

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Butorphanol tartrateSupelcoL-044 
Dexmedetomidine hydrochloride Sigma-Aldrich145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) wellSigma-AldrichM9410-1CS
Ethanolmacklin64-17-5 
Freund’s Adjuvant, Complete Sigma-AldrichF5881 
Freund’s Adjuvant, Incomplete Sigma-AldrichF5506
Goat anti-Mouse IgG invitrogenSA5-10275 
Midazolam solution SupelcoM-908 
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISACalbiotechDKO045
Paraformaldehydemacklin30525-89-4 
Propidium iodideSigma-AldrichP4864
Sodium IodineSigma-Aldrich 7681-82-5
ThyroglobulinSigma-Aldrich T1126
Thyroglobulin  ELISA KitThermo ScientificEHTGX5
TSH ELISACalbiotechDKO200
Xylenemacklin1330-20-7

References

  1. Ralli, M., et al. Hashimoto's thyroiditis: An update on pathogenic mechanisms, diagnostic protocols, therapeutic strategies, and potential malignant transformation. Autoimmunity Reviews. 19 (10), 102649 (2020).
  2. Zhang, Q. Y., et al. Lymphocyte infiltration and thyrocyte destruction are driven by stromal and immune cell components in Hashimoto's thyroiditis. Nature Communications. 13 (1), 775 (2022).
  3. Ruggeri, R. M., et al. Autoimmune comorbidities in Hashimoto's thyroiditis: different patterns of association in adulthood and childhood/adolescence. European Journal of Endocrinology. 176 (2), 133-141 (2017).
  4. Resende de Paiva, C., Grønhøj, C., Feldt-Rasmussen, U., von Buchwald, C. Association between Hashimoto's thyroiditis and thyroid cancer in 64,628 patients. Frontiers in Oncology. 7, 53 (2017).
  5. Ehlers, M., Schott, M. Hashimoto's thyroiditis and papillary thyroid cancer: are they immunologically linked. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (12), 656-664 (2014).
  6. Medenica, S., et al. The role of cell and gene therapies in the treatment of infertility in patients with thyroid autoimmunity. International Journal of Endocrinology. 2022, 4842316 (2022).
  7. Rose, N. R. The genetics of autoimmune thyroiditis: the first decade. Journal of Autoimmunity. 37 (2), 88-94 (2011).
  8. Kolypetri, P., King, J., Larijani, M., Carayanniotis, G. Genes and environment as predisposing factors in autoimmunity: acceleration of spontaneous thyroiditis by dietary iodide in NOD.H2(h4) mice. International Reviews of Immunology. 34 (6), 542-556 (2015).
  9. Terplan, K. L., Witebsky, E., Rose, N. R., Paine, J. R., Egan, R. W. Experimental thyroiditis in rabbits, guinea pigs and dogs, following immunization with thyroid extracts of their own and of heterologous species. The American Journal of Pathology. 36 (2), 213-239 (1960).
  10. Alexopoulos, H., Dalakas, M. C. The immunobiology of autoimmune encephalitides. Journal of Autoimmunity. 104, 102339 (2019).
  11. Noviello, C. M., Kreye, J., Teng, J., Prüss, H., Hibbs, R. E. Structural mechanisms of GABA receptor autoimmune encephalitis. Cell. 185 (14), 2469-2477 (2022).
  12. Pudifin, D. J., Duursma, J., Brain, P. Experimental autoimmune thyroiditis in the vervet monkey. Clinical and Experimental Immunology. 29 (2), 256-260 (1977).
  13. Esquivel, P. S., Rose, N. R., Kong, Y. C. Induction of autoimmunity in good and poor responder mice with mouse thyroglobulin and lipopolysaccharide. The Journal of Experimental Medicine. 145 (5), 1250-1263 (1977).
  14. Kong, Y. C., et al. HLA-DRB1 polymorphism determines susceptibility to autoimmune thyroiditis in transgenic mice: definitive association with HLA-DRB1*0301 (DR3) gene. The Journal of Experimental Medicine. 184 (3), 1167-1172 (1996).
  15. Kotani, T., Umeki, K., Hirai, K., Ohtakia, S. Experimental murine thyroiditis induced by porcine thyroid peroxidase and its transfer by the antigen-specific T cell line. Clinical and Experimental Immunology. 80 (1), 11-18 (1990).
  16. Ng, H. P., Banga, J. P., Kung, A. W. C. Development of a murine model of autoimmune thyroiditis induced with homologous mouse thyroid peroxidase. Endocrinology. 145 (2), 809-816 (2004).
  17. Ng, H. P., Kung, A. W. C. Induction of autoimmune thyroiditis and hypothyroidism by immunization of immunoactive T cell epitope of thyroid peroxidase. Endocrinology. 147 (6), 3085-3092 (2006).
  18. Ellis, J. S., Braley-Mullen, H. Mechanisms by which B cells and regulatory T Cells influence development of murine organ-specific autoimmune diseases. Journal of Clinical Medicine. 6 (2), 13 (2017).
  19. Fang, Y., Yu, S., Braley-Mullen, H. Contrasting roles of IFN-gamma in murine models of autoimmune thyroid diseases. Thyroid. 17 (10), 989-994 (2007).
  20. Fang, Y., Zhao, L., Yan, F. Chemokines as novel therapeutic targets in autoimmune thyroiditis. Recent Patents on DNA & Gene Sequences. 4 (1), 52-57 (2010).
  21. Chen, C. R., et al. Antibodies to thyroid peroxidase arise spontaneously with age in NOD.H-2h4 mice and appear after thyroglobulin antibodies. Endocrinology. 151 (9), 4583-4593 (2010).
  22. Ruf, J., et al. Relationship between immunological structure and biochemical properties of human thyroid peroxidase. Endocrinology. 125 (3), 1211-1218 (1989).
  23. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., Chong, G., Rapoport, B. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword'. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  24. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., et al. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword’[J]. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  25. Hutchings, P. R., et al. Both CD4(+) T cells and CD8(+) T cells are required for iodine accelerated thyroiditis in NOD mice. Cellular Immunology. 192 (2), 113-121 (1999).
  26. Xue, H., et al. Dynamic changes of CD4+CD25 + regulatory T cells in NOD.H-2h4 mice with iodine-induced autoimmune thyroiditis. Biological Trace Element Research. 143 (1), 292-301 (2011).
  27. Hou, X., et al. Effect of halofuginone on the pathogenesis of autoimmune thyroid disease in different mice models. Endocrine, Metabolic & Immune Disorders Drug Targets. 17 (2), 141-148 (2017).
  28. McLachlan, S. M., et al. Dissociation between iodide-induced thyroiditis and antibody-mediated hyperthyroidism in NOD.H-2h4 mice. Endocrinology. 146 (1), 294-300 (2005).
  29. Danailova, Y., et al. Nutritional management of thyroiditis of hashimoto. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 5144 (2022).
  30. Carayanniotis, G. Molecular parameters linking thyroglobulin iodination with autoimmune thyroiditis. Hormones. 10 (1), 27-35 (2011).
  31. Verginis, P., Li, H. S., Carayanniotis, G. Tolerogenic semimature dendritic cells suppress experimental autoimmune thyroiditis by activation of thyroglobulin-specific CD4+CD25+ T cells. Journal of Immunology. 174 (11), 7433-7439 (2005).
  32. Flynn, J. C., et al. Superiority of thyroid peroxidase DNA over protein immunization in replicating human thyroid autoimmunity in HLA-DRB1*0301 (DR3) transgenic mice. Clinical and Experimental Immunology. 137 (3), 503-512 (2004).
  33. Akeno, N., et al. IFN-α mediates the development of autoimmunity both by direct tissue toxicity and through immune cell recruitment mechanisms. Journal of Immunology. 186 (8), 4693-4706 (2011).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 6/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved