Generierung eines Mausmodells für spontane Autoimmunthyreoiditis

Zusammenfassung

Es wurden mehrere Arten von Tiermodellen der Hashimoto-Thyreoiditis etabliert, ebenso wie die spontane Autoimmunthyreoiditis bei der NOD-Maus. H-2h4-Mäuse sind ein einfaches und zuverlässiges Modell für die HT-Induktion. Dieser Artikel beschreibt diesen Ansatz und bewertet den pathologischen Prozess für ein besseres Verständnis des SAT-Mausmodells.

Zusammenfassung

Die Hashimoto-Thyreoiditis (HT) hat sich in den letzten Jahren zur häufigsten Autoimmunerkrankung der Schilddrüse entwickelt. Sie zeichnet sich durch eine Infiltration von Lymphozyten und den Nachweis spezifischer Serum-Autoantikörper aus. Obwohl der mögliche Mechanismus noch nicht geklärt ist, hängt das Risiko einer Hashimoto-Thyreoiditis mit genetischen und umweltbedingten Faktoren zusammen. Derzeit gibt es verschiedene Arten von Modellen der Autoimmunthyreoiditis, darunter die experimentelle Autoimmunthyreoiditis (EAT) und die spontane Autoimmunthyreoiditis (SAT).

EAT bei Mäusen ist ein häufiges Modell für HT, das mit Lipopolysaccharid (LPS) in Kombination mit Thyreoglobulin (Tg) immunisiert oder mit einem vollständigen Freund-Adjuvans (CFA) ergänzt wird. Das EAT-Mausmodell ist bei vielen Mäusearten weit verbreitet. Der Krankheitsverlauf ist jedoch eher mit der Tg-Antikörperantwort assoziiert, die in verschiedenen Experimenten variieren kann.

SAT wird auch häufig bei der Untersuchung von HT im NOD verwendet. H-2h4 Maus. Das NOD. Die H2h4-Maus ist ein neuer Stamm, der aus der Kreuzung der nicht-adipösen diabetischen Maus (NOD) mit der B10 gewonnen wurde. A(4R), das für HT mit oder ohne Jodzufuhr signifikant induziert ist. Während der Induktion wird die NOD. Die H-2h4-Maus weist einen hohen TgAb-Spiegel auf, der von einer Lymphozyteninfiltration im Schilddrüsenfollikelgewebe begleitet wird. Für diese Art von Mausmodell gibt es jedoch nur wenige Studien, um den pathologischen Prozess bei der Induktion von Jod umfassend zu bewerten.

In dieser Studie wird ein SAT-Mausmodell für die HT-Forschung etabliert und der pathologische Veränderungsprozess nach einer langen Zeit der Jodinduktion evaluiert. Durch dieses Modell können Forscher die pathologische Entwicklung von HT besser verstehen und neue Behandlungsmethoden für HT untersuchen.

Einleitung

Die Hashimoto-Thyreoiditis (HT), auch bekannt als chronische lymphatische Thyreoiditis oder Autoimmunthyreoiditis, wurde erstmals 1912 berichtet¹. HT ist gekennzeichnet durch Lymphozyteninfiltration und Schädigung des Schilddrüsenfollikelgewebes. Labortests manifestieren sich hauptsächlich in einem Anstieg schilddrüsenspezifischer Antikörper, einschließlich Anti-Thyreoglobulin-Antikörper (TgAb) und Anti-Schilddrüsenperoxidase-Antikörper (TPOAb)². Die Inzidenz von HT liegt im Bereich von 0,4 % bis 1,5 % und macht 20 % bis 25 % aller Schilddrüsenerkrankungen aus, und dieser Wert ist in den letzten Jahren gestiegen³. Darüber hinaus wurde in einer Vielzahl von Studien berichtet, dass HT mit der Onkogenese und dem Rezidiv des papillären Schilddrüsenkarzinoms (PTC) assoziiert ^ist4,5; Die möglichen Mechanismen sind noch umstritten. Die Autoimmunthyreoiditis ist auch ein wichtiger Faktor bei der weiblichen Unfruchtbarkeit⁶. Daher muss die Pathogenese der HT klar sein, wofür ein stabiles und einfaches Tiermodell unerlässlich ist.

Um die Ätiologie der HT zu untersuchen, wurden in den vorliegenden Studien zwei Haupttypen von Mausmodellen verwendet, darunter die experimentelle Autoimmunthyreoiditis (EAT) und die spontane Autoimmunthyreoiditis (SAT) ^7,8. Empfängliche Mäuse wurden mit spezifischen Schilddrüsenantigenen (einschließlich der rohen Schilddrüse, des gereinigten Thyreoglobulins [TG], der Schilddrüsenperoxidase [TPO], der rekombinanten TPO-Ektodomäne und ausgewählter TPO-Peptide) immunisiert, um das EAT-Mausmodell zu etablieren. Darüber hinaus werden die Adjuvantien, darunter Lipopolysaccharid (LPS), vollständiges Freund-Adjuvans (CFA) und andere ungewöhnliche Adjuvantien, auch während der Immunisierung verwendet, um die Immuntoleranz 9,10,11,12,13,14,15,16,17 abzubauen.

Das SAT-Modell ist ein wichtiges Modell, um die spontane Entwicklung einer Autoimmunthyreoiditis zu untersuchen, die auf NOD basiert. H-2h4 Mäuse. Das NOD. Die H-2h4-Maus ist ein neuer Stamm, der aus der Kreuzung von NOD und B10 gewonnen wurde. A(4R)-Mäuse, gefolgt von mehrfachen Rückkreuzungen auf NOD, mit dem Autoimmunthyreoiditis-Suszeptibilitätsgen IAk^18,19. NICKEN. H-2h4-Mäuse entwickeln keinen Diabetes, haben aber eine hohe Inzidenz von Autoimmunthyreoiditis und Sjögren-Syndrom (SS)¹⁹. Studien haben gezeigt, dass das intrazelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) im Schilddrüsengewebe von NOD stark exprimiert wird. H-2h4-Mäuse im Alter von 3-4 Wochen. Darüber hinaus wird mit zunehmender Jodzufuhr die Immunogenität des Thyreoglobulinmoleküls erhöht, was die Expression von ICAM-1, das eine wichtige Rolle bei der Infiltration von Monozyten spielt, weiter hochreguliert²¹. Dieses Modell simuliert den Autoimmunprozess und verifiziert gleichzeitig den Zusammenhang zwischen Joddosis und Schwere der Erkrankung. Die etablierte Methode ist stabil und hat eine hohe Erfolgswahrscheinlichkeit. Das SAT-Modell wird seit vielen Jahren zur Induktion einer Autoimmunthyreoiditis eingesetzt und ist nach wie vor eine effektive Methode, um die Pathogenese der Autoimmunthyreoiditis zu untersuchen. Die derzeitige Bauweise des EAT-Modells ist jedoch komplizierter und teurer; Verschiedene Labore verwenden unterschiedliche Immunisierungsmethoden und Injektionsstellen. Darüber hinaus haben Mäuse mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund unterschiedliche Induktionsraten, die weitere Studien erfordern, um den potenten Mechanismus aufzudecken.

Die Entwicklung einer Thyreoiditis im SAT-Modell ist jedoch mit Natriumjodid, Sexualdimorphismus und den Aufzuchtbedingungen verbunden. Um das geeignete Verfahren der Autoimmunthyreoiditis im SAT-Modell aufzuzeigen, wurde in diesem Artikel die Methode zur Induktion der Autoimmunthyreoiditis unter verschiedenen Bedingungen beschrieben. Darüber hinaus ermöglicht es die Untersuchung der Pathogenese und des immunologischen Verlaufs der Autoimmunthyreoiditis in verschiedenen Stadien dieser Erkrankung.

Protokoll

Das unten beschriebene Protokoll wurde von den Pflege- und Verwendungsrichtlinien genehmigt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Sichuan festgelegt wurden.

1. Vorbereitung

1. Unterbringung aller Mäuse unter bestimmten erregerfreien Bedingungen unter 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklen (Beginn um 07:00 Uhr bzw. 19:00 Uhr). Halten Sie die Raumtemperatur bei 22 °C. Wechseln Sie die Einstreumaterialien jede Woche. Stellen Sie ausreichende Mengen an Standard-Nagetierfutter und Wasser zur Verfügung.
2. Bei der Herstellung der Stammlösung von NaI in Wasser werden 2,5 g der Verbindung abgewogen und in 50 ml sterilem, reinem Wasser unter Vortexen aufgelöst, um eine Stammlösung von 5 % zu erhalten. Lagern Sie diese Stammlösung bis zu 8 Wochen in einem Gefrierschrank bei 4 °C unter Vermeidung von Licht.
3. Um eine Arbeitslösung von NaI herzustellen, entnehmen Sie 2,5 ml Stammlösung und lösen Sie sie in 250 ml normalem Wasser als tägliches Trinkwasser für NOD auf. H-2h4-Mäuse, um eine Arbeitslösung von 0,05 % zu erhalten.

2. Induktion einer Schilddrüsenentzündung

1. SAT-Modell
   1. Bereiten Sie das NOD vor. H-2h4-Mäuse (im Alter von 8 Wochen) für die Studie, indem alle Mäuse eines Geschlechts (kein Sexualdimorphismus) in Barrierekäfigen (fünf Tiere pro Käfig) mit den in Schritt 1.1 beschriebenen Fütterungsbedingungen untergebracht wurden.
   2. Zur Induktion einer Autoimmunthyreoiditis bei NOD. H-2h4-Mäuse, füttern Sie alle Mäuse 8 Wochen lang mit 0,05% NaI. Wechseln Sie das NaI-Wasser jede Woche und beurteilen Sie wöchentlich den Status der Mäuse, einschließlich Aussehen, Gewicht, Appetit, mentalem Zustand und Mobilität.
2. EAT-Modell
   1. Bereiten Sie die BALB/c-Mäuse (im Alter von 8 Wochen) auf die Studie vor, indem alle Mäuse eines Geschlechts (kein Sexualdimorphismus) in Barrierekäfigen (fünf Tiere pro Käfig) mit den in Schritt 1.1 beschriebenen Fütterungsbedingungen untergebracht werden. Füttern Sie alle Mäuse 8 Wochen lang mit 0,05% NaI.
   2. Injizieren Sie in den ersten 2 Wochen einmal pro Woche subkutan eine Mischung aus CFA und Tg (200 μl).
   3. Ab der dritten Woche injizieren Sie 3 Wochen lang einmal wöchentlich subkutan eine Mischung aus IFA und Tg (200 μl).

3. Messungen

1. Aufbereitung von peripheren Blutproben
   1. Nach der Induktion werden die Mäuse mit einem Volumen von 0,01 ml/g Anästhetikum durch intraperitoneale Injektion anästhesiert. Bereiten Sie das Anästhetikum vor, indem Sie Midazolam (40 μg/100 μl für die Sedierung), Medetomidin (7,5 μg/100 μl für die Sedierung) und Butorphanoltartrat (50 μg/100 μl für die Analgesie) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mischen.
      Anmerkungen: Die spezifischen Konzentrationen jeder Komponente in der Anästhesiemischung sind: Midazolam 13,33 μg/100 μl, Medetomidin 2,5 μg/100 μl und Butorphanol 16,7 μg/100 μl. Für spezifische Dosierungen, die bei Mäusen verwendet werden, betragen die Dosen: Midazolam 4 μg/g, Medetomidin 0,75 μg/g und Butorphanol 1,67 μg/g. Die Anästhesietiefe wurde bestätigt, wenn sich die Gliedmaßenmuskeln der Maus entspannten, die Schnurrhaare keine Berührungsreaktion zeigten und der Pedalreflex verloren ging.
   2. Nachdem die Mäuse betäubt wurden, bereiten Sie die peripheren Blutproben vor, indem Sie die Maus mit einer Hand fixieren und auf die Augenhaut drücken, um den Augapfel hervorzustehen. Führen Sie dann den Kapillarschlauch in den inneren Augenwinkel ein und dringen Sie in einem Winkel von 30-45 Grad in die Ebene des Nasenlochs ein. Üben Sie Druck aus, während Sie das Kapillarrohr vorsichtig drehen. Das Blut fließt durch Kapillarwirkung in den Schlauch.
   3. Geben Sie das Blut für 2 h in einen 4 °C warmen Kühlschrank und zentrifugieren Sie dann bei 1.000 × g für 10 min bei 4 °C, um die Probe zu erhalten. Zur weiteren Analyse ist die restliche Probe bei -80 °C zu lagern.
2. Aufbereitung von Schilddrüsengewebeproben
   1. Humane Einschläferung des Tieres gemäß den institutionellen Richtlinien. Präparieren Sie dann die Brustwand, um das Herz freizulegen, schneiden Sie den rechten Vorhof auf und infundieren Sie Kochsalzlösung in den linken Ventrikel mit einer intravenösen Infusionsnadel, die an einer 20-ml-Spritze befestigt ist, bis das Gewebe weiß wird.
   2. Befestigen Sie die Maus mit Stecknadeln auf dem Seziertisch. Sterilisieren Sie den Hals mit 75%igem Ethanol. Schneiden Sie die Haut der Maus entlang der Mittellinie des Halses von der Oberseite des Brustbeins bis zum Unterkiefer mit einer Gewebeschere, um das Halsgewebe vollständig freizulegen.
   3. Beobachten Sie das Paar rosafarbener Drüsen, die Unterkieferdrüsen, unter denen sich der vordere Luftröhrenmuskel befindet. Trennen Sie die Drüsen und Muskeln mit einer Augenschere und einer Pinzette, um die Luftröhre und den Schilddrüsenknorpel freizulegen.
   4. Trennen Sie das Gewebe unter dem Knorpel und nehmen Sie Knorpel und Luftröhre mit einer gebogenen Pinzette zusammen auf. Schneiden Sie die distalen und proximalen Enden des Knorpels bzw. der Luftröhre ab und entfernen Sie die Schilddrüse zusammen mit der Luftröhre.
   5. Tauchen Sie die Drüsen für 12-24 Stunden in 4%iges Paraformaldehyd. Übertragen Sie dann das Gewebe auf 70% Ethanol.
   6. Legen Sie die einzelnen Lappen des Schilddrüsenbiopsiematerials in die Verarbeitungskassetten und dehydrieren Sie sie durch den folgenden seriellen Alkoholgradienten: 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 100 %, Ethanol für jeweils 40 Minuten; 1/2 Xylol + 1/2 absolutes Ethanol für 2 h; 100% Xylol für 1,5 h; 100% Xylol für 1,5 h; 1/2 Xylol + 1/2 Paraffin für 2 h; Backofen bei 40 ° C für 40 min; Paraffin I für 30 min; und Paraffin II für 30 min. Betten Sie sie in Paraffinwachsblöcke ein.
   7. Vor der Färbung 5 μm dicke Schilddrüsengewebeschnitte in Xylol entwachsen (wie folgt) und durch folgende abnehmende Ethanolkonzentrationen rehydrieren: Xylol I für 10 min; Xylol II für 10 min; Xylol III für 10 min; absolutes Ethanol I für 5 min; absolutes Ethanol II für 5 min; 90% Alkohol für 5 Minuten; 80% Alkohol für 5 min; 70% Alkohol für 5 Minuten; und 50% Alkohol für 5 min.
   8. Färben Sie das Gewebe mit Hämatoxylin und Eosin (H&E). 15 min mit Hämatoxylin färben, 15 min mit Leitungswasser abspülen, 10 s lang 1 % Salzsäure-Ethanol hinzufügen, unter fließendem Wasser abspülen und dann mit 50 %, 70 % und 80 % Ethanol jeweils 3 min lang abspülen. 2 Minuten lang eine 0,5%ige Eosin-Ethanol-Färbung durchführen und unter fließendem Wasser abspülen. Legen Sie die Paraffinabschnitte nacheinander für 2 min in 75%iges Ethanol, 2 min in 85%iges Ethanol, 5 min in absolutes Ethanol und 5 min in Xylol. Fixieren Sie die Scheiben mit neutralem Gummi und Glasobjektträgern.
   9. Um das Ausmaß der lymphozytären Thyreoiditis zu beurteilen, bewerten Sie die Schilddrüsenschnitte wie folgt: 0: geringe oder keine Lymphozyteninfiltration im Schilddrüsengewebe; 1+: mehr als 1/8 der Drüse ist in einen oder mehrere Herde infiltriert; 2+: nicht mehr als 1/4 der Drüse ist mit Lymphozyten infiltriert; 3+: 1/4-1/2 der Drüse ist mit Lymphozyten infiltriert; 4+: Mehr als 1/2 der Drüse wird zerstört.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, den Schilddrüsenknorpel zu entfernen, um die gesamte Struktur der Mausschilddrüse zu erhalten, die zu klein ist, um sie aus der Luftröhre zu entfernen.
3. Messung von TPOAb
   HINWEIS: Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), die TPO der Maus stabil exprimieren, wurden in unserem Labor etabliert. Die TPO-cDNA der Maus wurde mittels XbaI und NheI exzidiert. Anschließend wurde die cDNA auf pcDNA5/FRT übertragen. Nachdem das Plasmid erfolgreich konstruiert wurde, wurde es in die CHO-Zellen transfiziert und mit Hygromycin B (100 g/ml) selektiert.
   1. Nach dem Aufbau der mTPO-CHO-Zellen werden die Mausseren aus Schritt 3.1.3 (1:50) verdünnt und mit den mTPO-CHO-Zellen 2 h inkubiert. Nach der Inkubation wird eine Zellfärbung mit Propidiumiodid (1 g/ml) ausgeschlossen und die Probe durchflusszytometrisch mit Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertem, affinitätsgereinigtem Ziegen-Anti-Maus-IgG analysiert. Screenen Sie überlebende Einzelzellpopulationen anhand von FSC-A- und SSC-A-Kanälen und wählen Sie FITC- und PI-markierte Zellen aus den Einzelzellpopulationen^{aus 21}.
   2. Als Negativkontrolle ist das Serum von nicht immunisierten BALB/c- oder C57BL/6-Mäusen, die an IgG gebunden sind, einzubeziehen. Monoklonale Mausantikörper gegen humanes TPO²² als Positivkontrollen einschließen, die TPO²³ der Maus erkennen. Drücken Sie TPO-Bindungsdaten als geometrische Mittel aus.
4. Messung von TgAb
   HINWEIS: Verwenden Sie ein ELISA-Kit zum Nachweis von Thyreoglobulin, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen.
   1. Verdünnen Sie die Standardproben im Mikrozentrifugenröhrchen gemäß den Anweisungen. Nehmen Sie das Kit aus dem Kühlschrank und bewahren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf.
   2. Legen Sie die Standard-Wells, Blank-Wells und Test-Wells fest. Leerbohrungen erhalten nur einen Puffer, während Standardbohrungen Standardlösungen erhalten. Geben Sie 10 μl Proben in die Testvertiefungen. Versuchen Sie beim Hinzufügen der Proben, die Wände der Vertiefungen nicht zu berühren, und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Proben auf den Boden der Vertiefungen zu bewegen.
   3. Als Positivkontrolle sollten Serum von BALB/c-Mäusen verwendet werden, die mit Tg, CFA und IFA²⁴ immunisiert wurden, sowie Serum von 8 Wochen altem NOD verwendet werden. H-2h4 Mäuse auf normalem Wasser als Negativkontrolle.
   4. Inkubieren Sie die Proben im 37 °C warmen Wasserbad für 30 min. Verdünnen Sie den Waschpuffer im Verhältnis 1:30 mit destilliertem Wasser. Entfernen Sie dann die Siegelfolie, schütteln Sie die Flüssigkeit in der Enzymplatte ab und tupfen Sie sie auf saugfähigem Papier trocken und fügen Sie 30 s lang 350 μl Waschpuffer hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal und tupfen Sie dann die Vertiefungen trocken.
   5. Geben Sie 50 μl Enzymmarkierungsreagenz in jede Vertiefung, mit Ausnahme der leeren Vertiefungen, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in einem 37 ° -Wasserbad. Entfernen Sie die Siegelfolie, schütteln Sie die Flüssigkeit in der Enzymplatte ab und tupfen Sie sie auf saugfähigem Papier trocken.
   6. Geben Sie 50 μl Entwickler A in jede Vertiefung, gefolgt von 50 μl Entwickler B, und schütteln Sie die Vertiefungen vorsichtig, um sie 5 Minuten lang zu mischen. Geben Sie 50 μl der Terminationslösung für 15 Minuten in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen. Messen Sie die Absorption (OD) jeder Vertiefung bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader. Präsentieren Sie die TgAb-Daten als optische Dichte (OD) bei 490 nm.
5. Messung von T4 und schilddrüsenstimulierendem Hormon (TSH)
   Anmerkungen: Messen Sie die T4- und TSH-Werte (in 10 μl Aliquoten) mit ELISA, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen.
   1. Verdünnen Sie das Enzymkonjugat im Verhältnis 1:11 mit dem Assay-Verdünnungsmittel. Verdünnen Sie die zu messenden Proben (1:100) mit 0,01 M PBS.
   2. Geben Sie 10 μl des Standards und der Probe in die entsprechenden Vertiefungen, geben Sie 100 μl Enzymkonjugat in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur.
   3. Entsorgen Sie die Flüssigkeit in den Vertiefungen und reinigen Sie sie dreimal mit Waschpuffer.
   4. 100 μl 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) zugeben und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   5. Fügen Sie 50 μl Stopplösung hinzu und mischen Sie vorsichtig für 15-20 s.
   6. Bestimmen Sie die Absorption (OD) mit einem Mikroplatten-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm und berechnen Sie die Probenkonzentration.
   7. Verwenden Sie statistische Software, um einen t-Test oder Rangsummentest durchzuführen, und stellen Sie die Ergebnisse dar.

Ergebnisse

Die histologischen Veränderungen unterschieden sich auffallend bei Frauen und Männern, in der Dauer der Jodaufnahme und in der Lösung von NaI. Wie in Abbildung 1 dargestellt, ~10 % von NOD. H-2h4-Mäuse entwickelten SAT auch ohne Jodinduktion im Alter von 24 Wochen, und alle Mäuse entwickelten schließlich eine Thyreoiditis. Bei regelmäßiger Wässerung gab es keinen signifikanten Unterschied in den histologischen Veränderungen zwischen Männchen und Weibchen. Die Zugabe von NaI zum Tr...

Diskussion

HT tritt aufgrund einer Störung des Autoimmunsystems auf, die durch Lymphozyten verursacht wird, die in die Schilddrüse eindringen, die Schilddrüsenfunktion weiter beeinträchtigen und gleichzeitig schilddrüsenspezifische Antikörper produzieren. Die Serum-TSH-, TgAb- und TPOAb-Spiegel bei HT-Patienten sind signifikant erhöht²⁷. Gegenwärtig werden zwei Haupttypen von Mausmodellen verwendet, um die Ätiologie der Autoimmunthyreoiditis zu untersuchen: EAT und SAT²⁹. EAT...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Butorphanol tartrate	Supelco	L-044
Dexmedetomidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well	Sigma-Aldrich	M9410-1CS
Ethanol	macklin	64-17-5
Freund’s Adjuvant, Complete	Sigma-Aldrich	F5881
Freund’s Adjuvant, Incomplete	Sigma-Aldrich	F5506
Goat anti-Mouse IgG	invitrogen	SA5-10275
Midazolam solution	Supelco	M-908
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA	Calbiotech	DKO045
Paraformaldehyde	macklin	30525-89-4
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4864
Sodium Iodine	Sigma-Aldrich	7681-82-5
Thyroglobulin	Sigma-Aldrich	T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit	Thermo Scientific	EHTGX5
TSH ELISA	Calbiotech	DKO200
Xylene	macklin	1330-20-7