Génération d’un modèle de thyroïdite auto-immune spontanée chez la souris

Résumé

Plusieurs types de modèles animaux de la thyroïdite de Hashimoto ont été établis, tout comme la thyroïdite auto-immune spontanée chez la souris NOD. Les souris H-2h4 sont un modèle simple et fiable pour l’induction HT. Cet article décrit cette approche et évalue le processus pathologique pour une meilleure compréhension du modèle murin SAT.

Résumé

Ces dernières années, la thyroïdite de Hashimoto (HT) est devenue la maladie thyroïdienne auto-immune la plus courante. Elle se caractérise par une infiltration lymphocytaire et la détection d’autoanticorps sériques spécifiques. Bien que le mécanisme potentiel ne soit pas encore clair, le risque de thyroïdite de Hashimoto est lié à des facteurs génétiques et environnementaux. À l’heure actuelle, il existe plusieurs types de modèles de thyroïdite auto-immune, y compris la thyroïdite auto-immune expérimentale (EAT) et la thyroïdite auto-immune spontanée (SAT).

L’EAT chez la souris est un modèle courant pour l’HT, qui est immunisée avec un lipopolysaccharide (LPS) combiné à la thyroglobuline (Tg) ou complété par un adjuvant complet de Freund (CFA). Le modèle de souris EAT est largement établi chez de nombreux types de souris. Cependant, la progression de la maladie est plus probablement associée à la réponse des anticorps Tg, qui peut varier selon les expériences.

SAT est également largement utilisé dans l’étude de l’HT dans le NOD. Souris H-2h4. Le hochement de tête. La souris H2h4 est une nouvelle souche obtenue à partir du croisement de la souris diabétique non obèse (NOD) avec la B10. A(4R), qui est significativement induit pour l’HT avec ou sans iode alimentaire. Pendant l’induction, le NOD. La souris H-2h4 a un taux élevé de TgAb accompagné d’une infiltration lymphocytaire dans le tissu folliculaire thyroïdien. Cependant, pour ce type de modèle murin, il existe peu d’études permettant d’évaluer de manière exhaustive le processus pathologique lors de l’induction de l’iode.

Un modèle murin SAT pour la recherche sur l’HT est établi dans cette étude, et le processus de changement pathologique est évalué après une longue période d’induction d’iode. Grâce à ce modèle, les chercheurs peuvent mieux comprendre le développement pathologique de l’HT et examiner de nouvelles méthodes de traitement de l’HT.

Introduction

La thyroïdite de Hashimoto (HT), également connue sous le nom de thyroïdite lymphoïde chronique ou thyroïdite auto-immune, a été signalée pour la première fois en 1912¹. L’HT se caractérise par une infiltration lymphocytaire et des lésions du tissu folliculaire thyroïdien. Les tests de laboratoire se manifestent principalement par une augmentation des anticorps spécifiques de la thyroïde, y compris les anticorps anti-thyroglobuline (TgAb) et les anticorps anti-peroxydase thyroïdienne (TPOAb)². L’incidence de l’HT est comprise entre 0,4% et 1,5%, ce qui représente 20% à 25% de toutes les maladies thyroïdiennes, et cette valeur a augmenté ces dernières années³. De plus, un grand nombre d’études ont rapporté que l’HT est associée à l’oncogenèse et à la récurrence du carcinome papillaire de la thyroïde (CTP)^4,5; Les mécanismes potentiels sont encore controversés. La thyroïdite auto-immune est également un facteur important dans l’infertilité féminine⁶. Par conséquent, la pathogenèse de l’HT doit être claire, pour laquelle un modèle animal stable et simple est essentiel.

Pour étudier l’étiologie de l’HT, deux principaux types de modèles murins ont été utilisés, y compris la thyroïdite auto-immune expérimentale (EAT) et la thyroïdite auto-immune spontanée (SAT) dans les présentes études ^7,8. Les souris sensibles ont été immunisées avec des antigènes thyroïdiens spécifiques (y compris la thyroïde brute, la thyroglobuline purifiée [TG], la peroxydase thyroïdienne [TPO], l’ectodomaine TPO recombinant et certains peptides TPO) pour établir le modèle murin EAT. En outre, les adjuvants, y compris le lipopolysaccharide (LPS), l’adjuvant complet de Freund (CFA) et d’autres adjuvants inhabituels, sont également utilisés pendant la vaccination pour briser la tolérance immunitaire 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Le modèle SAT est un modèle important pour étudier le développement spontané de la thyroïdite auto-immune, qui est basé sur la NOD. Souris H-2h4. Le hochement de tête. La souris H-2h4 est une nouvelle souche obtenue à partir du croisement de NOD et B10. Souris A(4R), suivies de multiples rétrocroisements vers NOD, avec le gène de susceptibilité à la thyroïdite auto-immune IAk^18,19. HOCHER. Les souris H-2h4 ne développent pas de diabète, mais ont une incidence élevée de thyroïdite auto-immune et de syndrome de Sjögren (SS)¹⁹. Des études ont montré que la molécule d’adhésion intracellulaire-1 (ICAM-1) est fortement exprimée dans le tissu thyroïdien de NOD. Souris H-2h4 à l’âge de 3-4 semaines. De plus, avec l’augmentation de l’apport en iode, l’immunogénicité de la molécule de thyroglobuline est renforcée, ce qui régule davantage l’expression de l’ICAM-1, qui joue un rôle important dans le processus d’infiltration des monocytes²¹. Ce modèle simule le processus auto-immun tout en vérifiant la relation entre la dose d’iode et la gravité de la maladie. La méthode établie est stable, avec une forte probabilité de succès. Le modèle SAT a été appliqué pour induire la thyroïdite auto-immune pendant de nombreuses années et continue d’être une méthode efficace pour étudier la pathogenèse de la thyroïdite auto-immune. Cependant, la méthode de construction actuelle du modèle EAT est plus compliquée et coûteuse; Différents laboratoires utilisent différentes méthodes d’immunisation et différents sites d’injection. En outre, les souris ayant des antécédents génétiques différents ont des taux d’induction différents, qui nécessitent une étude plus approfondie pour révéler le mécanisme puissant.

Cependant, le développement de la thyroïdite dans le modèle SAT est associé à l’iodure de sodium, au dimorphisme sexuel et aux conditions d’élevage. Pour révéler la procédure appropriée de thyroïdite auto-immune dans le modèle SAT, cet article a décrit la méthode d’induction de la thyroïdite auto-immune dans différentes conditions. En outre, il permet l’étude de la pathogenèse et du progrès immunologique de la thyroïdite auto-immune à différents stades de cette maladie.

Protocole

Le protocole décrit ci-dessous a été approuvé par les directives de soin et d’utilisation établies par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Sichuan.

1. Préparation

1. Hébergez toutes les souris dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes sous des cycles lumière-obscurité de 12 h (à partir de 07h00 et 19h00, respectivement). Maintenez la température ambiante à 22 °C. Changez les matériaux de literie chaque semaine. Fournir des quantités adéquates de chow et d’eau standard pour rongeurs.
2. Lors de la préparation de la solution mère de NaI dans l’eau, peser 2,5 g du composé et le dissoudre dans 50 ml d’eau pure stérile sous vortex pour obtenir une solution mère de 5%. Conservez cette solution mère dans un congélateur à 4 °C, en évitant la lumière, jusqu’à 8 semaines.
3. Pour préparer une solution de travail de NaI, prélever 2,5 mL de solution mère et la dissoudre dans 250 mL d’eau ordinaire comme eau potable quotidienne pour NOD. Souris H-2h4, pour donner une solution de travail de 0,05%.

2. Induction de la thyroïdite

1. Modèle SAT
   1. Préparez le NOD. Souris H-2h4 (8 semaines) pour l’étude en hébergeant toutes les souris d’un seul sexe (sans dimorphisme sexuel) dans des cages de barrière (cinq animaux par cage) avec les conditions d’alimentation décrites à l’étape 1.1.
   2. Pour induire une thyroïdite auto-immune dans NOD. Souris H-2h4, nourrissez toutes les souris avec 0,05% de NaI pendant 8 semaines. Changez l’eau NaI chaque semaine et évaluez l’état des souris sur une base hebdomadaire, y compris l’apparence, le poids, l’appétit, l’état mental et la mobilité.
2. Modèle EAT
   1. Préparer les souris BALB/c (âgées de 8 semaines) à l’étude en hébergeant toutes les souris d’un seul sexe (sans dimorphisme sexuel) dans des cages de barrière (cinq animaux par cage) avec les conditions d’alimentation décrites à l’étape 1.1. Nourrissez toutes les souris avec 0,05% de NaI pendant 8 semaines.
   2. Pendant les 2 premières semaines, injecter par voie sous-cutanée un mélange de CFA et de Tg (200 μL) une fois par semaine.
   3. À partir de la troisième semaine, injectez par voie sous-cutanée un mélange d’IFA et de Tg (200 μL) une fois par semaine pendant 3 semaines.

3. Mesures

1. Préparation des échantillons de sang périphérique
   1. Après l’induction, anesthésier les souris avec un volume de 0,01 mL/g d’anesthésique par injection intrapéritonéale. Préparer l’anesthésique en mélangeant le midazolam (40 μg/100 μL pour la sédation), la médétomidine (7,5 μg/100 μL pour la sédation) et le tartrate de butorphanol (50 μg/100 μL pour l’analgésie) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      NOTE: Les concentrations spécifiques de chaque composant dans le mélange d’anesthésie sont: midazolam 13,33μg / 100μL, médétomidine 2,5 μg / 100μL et butorphanol 16,7 μg / 100 μL. Pour les doses spécifiques utilisées chez la souris, les doses sont: midazolam 4μg / g, médétomidine 0,75 μg / g et butorphanol 1,67 μg / g. La profondeur de l’anesthésie a été confirmée lorsque les muscles des membres de la souris se sont détendus, que les moustaches n’ont pas eu de réponse au toucher et qu’il y a eu une perte du réflexe de pédale.
   2. Une fois les souris anesthésiées, préparez les échantillons de sang périphérique, en fixant la souris d’une main et en appuyant sur la peau de l’œil pour faire saillie du globe oculaire. Ensuite, insérez le tube capillaire dans le coin interne de l’œil et pénétrez à un angle de 30-45 degrés par rapport au plan de la narine. Appliquez une pression tout en tournant doucement le tube capillaire. Le sang circulera dans le tube par capillarité.
   3. Mettre le sang dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 2 h, puis centrifuger à 1 000 × g pendant 10 min à 4 °C pour obtenir l’échantillon. Pour une analyse plus approfondie, conserver le reste de l’échantillon à -80 °C.
2. Préparation d’échantillons de tissus thyroïdiens
   1. Euthanasier l’animal sans cruauté conformément aux politiques institutionnelles. Ensuite, disséquez la paroi thoracique pour exposer le cœur, ouvrez l’oreillette droite et perfusez une solution saline dans le ventricule gauche à l’aide d’une aiguille de perfusion intraveineuse fixée à une seringue de 20 ml jusqu’à ce que le tissu devienne blanc.
   2. Fixez la souris sur la table de dissection avec des broches. Stérilisez le cou avec de l’éthanol à 75%. Coupez la peau de la souris le long de la ligne médiane du cou, du haut du sternum à la mâchoire inférieure, avec des ciseaux à tissu, pour exposer complètement le tissu du cou.
   3. Observez la paire de glandes roses, les glandes sous-maxillaires, en dessous desquelles se trouve le muscle antérieur de la trachée. Séparez les glandes et les muscles avec des ciseaux ophtalmiques et des forceps pour exposer la trachée et le cartilage thyroïdien.
   4. Séparez le tissu sous le cartilage, à l’aide d’une pince incurvée pour ramasser le cartilage et la trachée ensemble. Coupez les extrémités distales et proximales du cartilage et de la trachée, respectivement, et retirez la glande thyroïde avec la trachée.
   5. Immerger les glandes dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 12-24 h. Ensuite, transférez le tissu à 70% d’éthanol.
   6. Placer les lobes individuels du matériel de biopsie thyroïdienne dans les cassettes de traitement et déshydrater à travers le gradient d’alcool en série suivant: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, éthanol pendant 40 minutes chacun; 1/2 xylène + 1/2 éthanol absolu pendant 2 h; 100% xylène pendant 1,5 h; 100% xylène pendant 1,5 h; 1/2 xylène + 1/2 paraffine pendant 2 h; étuve à 40°C pendant 40 min; paraffine I pendant 30 min; et paraffine II pendant 30 min. Intégrez-les dans des blocs de cire de paraffine.
   7. Avant la coloration, dépaurner des coupes de tissu thyroïdien de 5 μm d’épaisseur dans du xylène (comme suit) et réhydrater en utilisant les concentrations décroissantes d’éthanol suivantes: xylène I pendant 10 min; xylène II pendant 10 min; xylène III pendant 10 min; éthanol absolu I pendant 5 min; éthanol absolu II pendant 5 min; 90% d’alcool pendant 5 min; 80% d’alcool pendant 5 min; 70% d’alcool pendant 5 min; et 50% d’alcool pendant 5 min.
   8. Colorer les tissus avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E). Colorer à l’hématoxyline pendant 15 min, rincer à l’eau du robinet pendant 15 min, ajouter de l’éthanol à 1% d’acide chlorhydrique pendant 10 s, rincer à l’eau courante, puis avec de l’éthanol à 50%, 70% et 80%, chacun pendant 3 min. Colorer à l’éthanol éosine à 0,5% pendant 2 min et rincer à l’eau courante. Placer successivement les sections de paraffine dans de l’éthanol à 75% pendant 2 min, de l’éthanol à 85% pendant 2 min, de l’éthanol absolu pendant 5 min et du xylène pendant 5 min. Fixez les tranches avec de la gomme neutre et des lames de verre.
   9. Pour évaluer l’étendue de la thyroïdite lymphocytaire, notez les sections thyroïdiennes comme suit: 0: peu ou pas d’infiltration lymphocytaire dans le tissu thyroïdien; 1+: plus de 1/8 de la glande est infiltrée dans un ou plusieurs foyers; 2+: pas plus de 1/4 de la glande est infiltrée par les lymphocytes; 3+: 1/4-1/2 de la glande est infiltrée par les lymphocytes; 4+: plus de la moitié de la glande est détruite.
      REMARQUE: Il est recommandé d’enlever le cartilage thyroïdien pour conserver toute la structure de la thyroïde de souris, qui est trop petite pour être retirée de la trachée.
3. Mesure de TPOAb
   REMARQUE: Les cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO) exprimant de manière stable la TPO de souris ont été établies dans notre laboratoire. L’ADNc TPO de souris a été excisé par XbaI et NheI. Ensuite, l’ADNc a été transféré à pcDNA5 / FRT. Une fois le plasmide construit avec succès, il a été transfecté dans les cellules CHO et sélectionné avec de l’hygromycine B (100 g / mL).
   1. Après la construction des cellules mTPO-CHO, diluer les sérums de souris de l’étape 3.1.3 (1:50) et incuber avec les cellules mTPO-CHO pendant 2 h. Après incubation, exclure la coloration cellulaire avec de l’iodure de propidium (1 g/mL) et analyser l’échantillon par cytométrie en flux à l’aide d’IgG anti-souris de chèvre conjuguée à l’isothiocyanate de fluorescéine et purifiée par affinité. Cribler les populations unicellulaires survivantes par canaux FSC-A et SSC-A et sélectionner les cellules marquées FITC et PI dans les populations unicellulaires²¹.
   2. Inclure le sérum de souris BALB/c ou C57BL/6 non immunisées liées aux IgG comme témoin négatif. Inclure les anticorps monoclonaux de souris dirigés contre la TPO²² humaine en tant que témoins positifs qui reconnaissent la TPO²³ chez la souris. Exprimer les données de liaison TPO sous forme de moyens géométriques.
4. Mesure de l’AcAb
   REMARQUE: Utilisez une trousse ELISA pour détecter la thyroglobuline en suivant les instructions du fabricant.
   1. Diluer les échantillons étalons dans le tube de microcentrifugation conformément aux instructions. Sortez le kit du réfrigérateur et conservez-le à température ambiante pendant 30 min.
   2. Réglez les puits standard, les puits vierges et les puits d’essai. Les puits vierges ne reçoivent que des tampons, tandis que les puits standard obtiennent des solutions standard. Ajouter 10 μL d’échantillons dans les puits d’essai. Lors de l’ajout des échantillons, essayez de ne pas toucher les parois des puits et secouez doucement la plaque pour déplacer les échantillons au fond des puits.
   3. Inclure le sérum de souris BALB/c immunisées avec Tg, CFA et IFA²⁴ comme témoin positif et le sérum de NOD âgé de 8 semaines. Souris H-2h4 sur de l’eau ordinaire comme témoin négatif.
   4. Incuber les échantillons dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min. Diluer le tampon de lavage avec de l’eau distillée dans un rapport de 1:30. Ensuite, retirez le film d’étanchéité, secouez le liquide à l’intérieur de la plaque enzymatique et séchez-le tapoter sur du papier absorbant, puis ajoutez 350 μL de tampon de lavage pendant 30 s. Répétez cette procédure cinq fois, puis séchez les puits.
   5. Ajouter 50 μL de réactif de marquage enzymatique à chaque puits, à l’exception des puits blancs, et incuber dans un bain-marie à 37° pendant 30 min. Retirez le film d’étanchéité, secouez le liquide à l’intérieur de la plaque enzymatique et séchez-le en tapotant sur du papier absorbant.
   6. Ajouter 50 μL de révélateur A à chaque puits, suivi de 50 μL de révélateur B et agiter doucement les puits pour mélanger pendant 5 minutes. Ajouter 50 μL de la solution de terminaison dans chaque puits pendant 15 minutes pour arrêter la réaction. Mesurer l’absorbance (OD) de chaque puits à une longueur d’onde de 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Présentez les données TgAb sous forme de densité optique (DO) à 490 nm.
5. Mesure de la T4 et de l’hormone stimulant la thyroïde (TSH)
   NOTA : Mesurer les taux de T4 et de TSH (dans des aliquotes de 10 μL) par ELISA en suivant les instructions du fabricant.
   1. Diluer le conjugué enzymatique à 1:11 avec le diluant de dosage; diluer les échantillons à mesurer (1:100) à l’aide de 0,01 M de PBS.
   2. Ajouter 10 μL de l’étalon et de l’échantillon aux puits correspondants, ajouter 100 μL de conjugué enzymatique à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 1 h.
   3. Jetez le liquide dans les puits et nettoyez-le trois fois avec un tampon de lavage.
   4. Ajouter 100 μL de 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) et incuber à température ambiante pendant 15 min.
   5. Ajouter 50 μL de solution stop et mélanger doucement pendant 15-20 s.
   6. Déterminer l’absorbance (OD) à l’aide d’un lecteur de microplaques à une longueur d’onde de 450 nm et calculer la concentration de l’échantillon.
   7. Utilisez un logiciel statistique pour effectuer le test t ou le test de somme de rang et tracez les résultats.

Résultats

Les changements histologiques étaient remarquablement différents chez les femmes et les hommes, la durée de l’apport en iode et la solution de NaI. Comme le montre la figure 1, ~10% de NOD. Les souris H-2h4 ont développé SAT même sans induction d’iode à l’âge de 24 semaines, et toutes les souris ont finalement développé une thyroïdite. Lorsqu’on leur donnait de l’eau régulière, il n’y avait pas de différence significative dans les changements histologiques entre les...

Discussion

L’HT se produit en raison d’un trouble du système auto-immun causé par des lymphocytes infiltrant la glande thyroïde, altérant davantage la fonction thyroïdienne, tout en produisant des anticorps spécifiques à la thyroïde. Les taux sériques de TSH, de TgAb et de TPOAb chez les patients HT sont significativement élevés²⁷. À l’heure actuelle, deux principaux types de modèles murins sont largement utilisés pour étudier l’étiologie de la thyroïdite auto-immune: EAT et SAT

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Butorphanol tartrate	Supelco	L-044
Dexmedetomidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well	Sigma-Aldrich	M9410-1CS
Ethanol	macklin	64-17-5
Freund’s Adjuvant, Complete	Sigma-Aldrich	F5881
Freund’s Adjuvant, Incomplete	Sigma-Aldrich	F5506
Goat anti-Mouse IgG	invitrogen	SA5-10275
Midazolam solution	Supelco	M-908
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA	Calbiotech	DKO045
Paraformaldehyde	macklin	30525-89-4
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4864
Sodium Iodine	Sigma-Aldrich	7681-82-5
Thyroglobulin	Sigma-Aldrich	T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit	Thermo Scientific	EHTGX5
TSH ELISA	Calbiotech	DKO200
Xylene	macklin	1330-20-7