マウス自然発症自己免疫性甲状腺炎モデルの作製

要約

橋本甲状腺炎のいくつかのタイプの動物モデルが確立されており、NODマウスの自然発生性自己免疫性甲状腺炎も確立されています。H-2h4マウスは、HT誘導のためのシンプルで信頼性の高いモデルです。この記事では、このアプローチについて説明し、SATマウスモデルをよりよく理解するために病理学的プロセスを評価します。

要約

近年、橋本甲状腺炎(HT)が最も一般的な自己免疫性甲状腺疾患となっています。リンパ球の浸潤および特異的血清自己抗体の検出を特徴とする。潜在的なメカニズムはまだ明らかではありませんが、橋本甲状腺炎のリスクは遺伝的および環境的要因に関連しています。現在、実験的自己免疫性甲状腺炎(EAT)や自然自己免疫性甲状腺炎(SAT)など、自己免疫性甲状腺炎のモデルにはいくつかの種類があります。

マウスのEATはHTの一般的なモデルであり、リポ多糖(LPS)とサイログロブリン(Tg)を組み合わせた免疫、または完全なフロイントアジュバント(CFA)を補充します。EATマウスモデルは、多くの種類のマウスで広く確立されています。ただし、疾患の進行はTg抗体応答に関連している可能性が高く、実験によって異なる場合があります。

SATは、NODにおけるHTの研究にも広く使用されています。H-2H4マウス。うなずく。H2h4マウスは、非肥満糖尿病(NOD)マウスとB10との交配から得られた新しい系統である。A(4R)は、ヨウ素の供給の有無にかかわらずHTに対して有意に誘導されます。誘導中、NOD.H-2h4マウスは、甲状腺濾胞組織におけるリンパ球浸潤を伴う高レベルのTgAbを有する。しかし、この種のマウスモデルでは、ヨウ素誘導時の病理学的過程を総合的に評価する研究はほとんどない。

本研究では、HT研究のためのSATマウスモデルを確立し、長期間のヨウ素誘導後に病理学的変化プロセスを評価します。このモデルを通じて、研究者はHTの病理学的発達をよりよく理解し、HTの新しい治療法をスクリーニングすることができます。

概要

慢性リンパ性甲状腺炎または自己免疫性甲状腺炎としても知られる橋本甲状腺炎(HT)は、1912年に最初に報告^{されました1。}HTは、リンパ球の浸潤と甲状腺濾胞組織の損傷を特徴としています。臨床検査は主に、抗サイログロブリン抗体(TgAb)や抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体(TPOAb)^などの甲状腺特異的抗体の増加として現れます2。HTの発生率は0.4%〜1.5%の範囲であり、すべての甲状腺疾患の20%〜25%を占め、この値は近年増加しています³。さらに、HTが甲状腺乳頭癌(PTC)の発癌および再発に関連していることが多くの研究で報告されています^4,5;潜在的なメカニズムはまだ物議を醸しています。自己免疫性甲状腺炎も女性の不妊症の重要な要因です⁶。したがって、HTの病因は明確である必要があり、そのためには安定した単純な動物モデルが不可欠です。

HTの病因を研究するために、実験的自己免疫性甲状腺炎(EAT)と自然自己免疫性甲状腺炎(SAT)を含む2種類のマウスモデルが採用されています^7,8。感受性マウスに特異的甲状腺抗原(粗甲状腺、精製サイログロブリン[TG]、甲状腺ペルオキシダーゼ[TPO]、組換えTPOエクトドメイン、および選択されたTPOペプチドを含む)で免疫して、EATマウスモデルを確立しました。さらに、リポ多糖(LPS)、完全フロイントアジュバント(CFA)、および他の珍しいアジュバントを含むアジュバントも、免疫寛容を分解するために免疫中に使用される⁹、10、^11、12、13、14、15、^16、17。

SATモデルは、NODに基づく自己免疫性甲状腺炎の自然発生を研究するための重要なモデルです。H-2H4マウス。うなずく。H-2h4マウスは、NODとB10の交配から得られた新規系統である。A(4R)マウスは、続いてNODへの複数のバッククロスを行い、自己免疫性甲状腺炎感受性遺伝子IAk18^、19を用いた。頷く。H-2h4マウスは糖尿病を発症しませんが、自己免疫性甲状腺炎とシェーグレン症候群(SS)の発生率が高い¹⁹。研究により、細胞内接着分子-1(ICAM-1)がNODの甲状腺組織で高度に発現していることがわかっています。3〜4週齢のH−2h4マウス。さらに、ヨウ素摂取量の増加に伴い、チログロブリン分子の免疫原性が増強され、単球浸潤の過程において重要な役割を果たすICAM-1の発現がさらにアップレギュレートされる²¹。このモデルは、ヨウ素の投与量と病気の重症度との関係を検証しながら、自己免疫プロセスをシミュレートします。確立された方法は安定しており、成功の可能性が高いです。SATモデルは、長年にわたって自己免疫性甲状腺炎の誘発に適用されており、自己免疫性甲状腺炎の病因を研究するための効果的な方法であり続けています。ただし、EATモデルの現在の構築方法はより複雑で高価です。異なる検査室は異なる免疫方法と注射部位を使用します。さらに、遺伝的背景が異なるマウスは誘導率が異なるため、強力なメカニズムを明らかにするにはさらなる研究が必要です。

ただし、SATモデルにおける甲状腺炎の発症は、ヨウ化ナトリウム、性的二形性、および飼育条件に関連しています。SATモデルにおける自己免疫性甲状腺炎の適切な手順を明らかにするために、この記事では、さまざまな条件での自己免疫性甲状腺炎の誘発方法について説明しました。さらに、それは、この疾患の異なる段階における自己免疫性甲状腺炎の病因および免疫学的進行の研究を可能にする。

プロトコル

以下に説明するプロトコルは、四川大学の施設動物管理使用委員会によって確立された管理および使用ガイドラインによって承認されました。

1. 事前準備

1. すべてのマウスを特定の病原体のない状態で12時間の明暗サイクル(それぞれ07:00 a.m.と07:00 p.m.に開始)で飼育します。室温を22°Cに保ちます。 寝具の素材は毎週交換してください。十分な量の標準的なげっ歯類のチャウチャウと水を提供します。
2. NaIの原液を水中で調製する場合は、化合物2.5 gを秤量し、ボルテックス下で滅菌純水50 mLに溶解して、5%の原液を得る。この原液は、光を避けて4°Cの冷凍庫に最大8週間保管してください。
3. NaIの作業溶液を調製するには、2.5 mLの原液を採取し、NODの毎日の飲料水として250 mLの通常の水に溶解します。H-2h4マウスは、0.05%の作業溶液を得た。

2.甲状腺炎の誘発

1. SATモデル
   1. NODを準備します。H−2h4マウス(8週齢)を、ステップ1.1に記載される摂食条件でバリアケージ(ケージあたり5匹)に単一性(性的二形性なし)の全てのマウスを収容することによる研究のための。
   2. NODで自己免疫性甲状腺炎を誘発する。H-2h4マウスに、全てのマウスに0.05%NaIを8週間給餌した。NaI水を毎週交換し、外観、体重、食欲、精神状態、可動性など、マウスの状態を毎週評価します。
2. 食べるモデル
   1. BALB / cマウス(8週齢)を、ステップ1.1で説明されている給餌条件でバリアケージ(ケージあたり5匹)にバリアケージ(性的二形性なし)のすべてのマウスを収容することにより、研究用に準備します。すべてのマウスに0.05%NaIを8週間給餌します。
   2. 最初の2週間は、CFAとTg(200μL)の混合物を週に1回皮下注射します。
   3. 3週目以降は、IFAとTg(200μL)の混合物を週に1回、3週間皮下注射する。

3. 測定

1. 末梢血サンプルの調製
   1. 導入後、腹腔内注射により0.01 mL/gの麻酔薬でマウスに麻酔をかけます。ミダゾラム(鎮静用に40 μg/100 μL)、メデトミジン(鎮静用に7.5 μg/100 μL)、酒石酸ブトルファノール(鎮痛用に50 μg/100 μL)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に混合して麻酔薬を準備します。
      注:麻酔混合物中の各成分の特定の濃度は、ミダゾラム13.33μg / 100μL、メデトミジン2.5μg / 100μL、およびブトルファノール16.7μg / 100μLです。.マウスで使用される特定の投与量については、用量は、ミダゾラム4μg / g、メデトミジン0.75μg / g、およびブトルファノール1.67μg / gです。マウスの四肢の筋肉が弛緩し、ひげがタッチ反応がなく、ペダル反射が失われたときに麻酔の深さが確認されました。
   2. マウスを麻酔した後、片手でマウスを固定し、眼球を突き出すように眼の皮膚を押すことにより、末梢血サンプルを調製する。次に、毛細管を目の内側の角に挿入し、鼻孔の平面に対して30〜45度の角度で貫通します。キャピラリーチューブを静かに回転させながら圧力をかけます。血液は毛細管現象を介してチューブに流れ込みます。
   3. 血液を4°Cの冷蔵庫に2時間入れた後、1,000 × g で4°Cで10分間遠心分離してサンプルを採取します。さらに分析するには、残りのサンプルを-80°Cで保存します。
2. 甲状腺組織サンプルの調製
   1. 制度的方針に従って動物を人道的に安楽死させる。その後、胸壁を切開して心臓を露出させ、右心房を切り開き、20mL注射器に取り付けた静脈注入針で生理食塩水を左心室に白くなるまで注入します。
   2. ピンで解剖台にマウスを固定します。75%エタノールで首を滅菌します。胸骨の上部から下顎までの首の正中線に沿ってマウスの皮膚をティッシュハサミで切断し、首の組織を完全に露出させます。
   3. ピンク色の腺のペア、顎下腺を観察し、その下には前気管筋があります。眼科用ハサミと鉗子で腺と筋肉を分離し、気管と甲状軟骨を露出させます。
   4. 湾曲した鉗子を使用して軟骨と気管を一緒に拾い上げ、軟骨の下の組織を分離します。軟骨と気管の遠位端と近位端をそれぞれ切断し、気管と一緒に甲状腺を取り除きます。
   5. 腺を4%パラホルムアルデヒドに12〜24時間浸します。次に、組織を70%エタノールに移します。
   6. 甲状腺生検材料の個々の葉を処理カセットに入れ、次の連続アルコール勾配を通して脱水します:70%、80%、90%、95%、100%、100%、エタノールをそれぞれ40分間。1/2キシレン+ 1/2無水エタノールを2時間;100%キシレンを1.5時間;100%キシレンを1.5時間;1/2キシレン+ 1/2パラフィンを2時間;40°Cで40分間オーブン。パラフィンIを30分間;パラフィンIIを30分間投与した。それらをパラフィンワックスブロックに埋め込みます。
   7. 染色の前に、厚さ5μmの甲状腺組織切片をキシレン(以下のように)で脱ワックスし、以下の濃度のエタノールで再水和します:キシレンIを10分間;キシレンII.を10分間。キシレンIIIを10分間;無水エタノールを5分間;無水エタノールIIを5分間;90%アルコールで5分間。5分間80%アルコール。70%アルコールで5分間。50%アルコールを5分間。
   8. ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で組織を染色します。ヘマトキシリンで15分間染色し、水道水で15分間すすぎ、1%塩酸エタノールを10秒間加え、流水ですすぎ、次に50%、70%、および80%エタノールでそれぞれ3分間、0.5%エオジンエタノール染色を2分間行い、流水ですすいでください。パラフィン切片を75%エタノールに2分間、85%エタノールに2分間、無水エタノールに5分間、キシレンに5分間連続して配置します。中性ガムとスライドガラスでスライスを固定します。
   9. リンパ球性甲状腺炎の程度を評価するには、甲状腺切片を次のようにスコアリングします:0:甲状腺組織へのリンパ球浸潤がほとんどまたはまったくない。1+:腺の1/8以上が1つまたは複数の病巣に浸潤している。2+:腺の1/4以下がリンパ球に浸潤している。3+:腺の1/4-1/2にリンパ球が浸潤している。4+:腺の1/2以上が破壊されている。
      注:気管から除去するには小さすぎるマウス甲状腺の全体的な構造を維持するために、甲状腺軟骨を除去することをお勧めします。
3. TPOAbの測定
   注:マウスTPOを安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が私たちの研究室で確立されました。マウスTPO cDNAをXbaIおよびNheIにより摘出した。その後、cDNAをpcDNA5/FRTに転写した。プラスミドの構築に成功した後、CHO細胞にトランスフェクトし、ハイグロマイシンB(100 g/mL)で選択しました。
   1. mTPO-CHO細胞の構築後、ステップ3.1.3(1:50)のマウス血清を希釈し、mTPO-CHO細胞と2時間インキュベートします。インキュベーション後、ヨウ化プロピジウム(1 g/mL)による細胞染色を除外し、フルオレセインイソチオシアネート結合アフィニティー精製ヤギ抗マウスIgGを用いたフローサイトメトリーでサンプルを分析します。生き残った単一細胞集団をFSC−AおよびSSC−Aチャネルによってスクリーニングし、単一細胞集団²¹からFITC−およびPIタグ付き細胞を選択する。
   2. 陰性対照として、IgGに結合した未免疫のBALB/cまたはC57BL/6マウスの血清を含めます。マウスTPO23を認識するポジティブコントロールとしてヒト^TPO22に対するマウスモノクローナル抗体が挙げられる。TPOバインディングデータを幾何学的手段として表現します。
4. TgAbの測定
   注意: ELISAキットを使用して、製造元の指示に従ってサイログロブリンを検出します。
   1. 指示に従って、微量遠心チューブ内の標準サンプルを希釈します。キットを冷蔵庫から取り出し、室温で30分間保管します。
   2. 標準ウェル、ブランクウェル、およびテストウェルを設定します。ブランクウェルはバッファーのみを取得しますが、標準ウェルは標準溶液を取得します。10 μLのサンプルをテストウェルに追加します。サンプルを追加するときは、ウェルの壁に触れないようにし、プレートを軽く振ってサンプルをウェルの底に移動します。
   3. 陽性対照としてTg、CFA、およびIFA²⁴ で免疫したBALB/cマウスの血清と、8週齢のNODの血清を含めます。陰性対照として通常の水上でH-2h4マウス。
   4. サンプルを37°Cの水浴中で30分間インキュベートします。洗浄バッファーを蒸留水で1:30の割合で希釈します。次に、シールフィルムをはがし、酵素プレート内の液体を振り落とし、吸収紙上で軽くたたいて乾かし、350μLの洗浄バッファーを30秒間加えます。この手順を5回繰り返してから、ウェルを軽くたたいて乾かします。
   5. ブランクウェルを除く各ウェルに50 μLの酵素標識試薬を加え、37°ウォーターバス中で30分間インキュベートします。シールフィルムをはがし、酵素プレート内の液を振り落とし、吸収紙で軽くたたいて乾かします。
   6. 各ウェルに50 μLの現像液Aを加え、続いて50 μLの現像液Bを加え、ウェルを静かに振って5分間混合します。50 μLの終結溶液を各ウェルに15分間加え、反応を停止します。マイクロプレートリーダーを用いて波長450 nmにおける各ウェルの吸光度(OD)を測定します。TgAbデータを490nmでの光学濃度(OD)として提示します。
5. T4および甲状腺刺激ホルモン(TSH)の測定
   注意: 製造元の指示に従って、ELISAによってT4およびTSHレベル(10 μLアリコート)を測定します。
   1. アッセイ希釈液で酵素コンジュゲートを1:11に希釈します。測定するサンプルを0.01 M PBSで希釈(1:100)します。
   2. 10 μLの標準物質とサンプルを対応するウェルに加え、100 μLの酵素コンジュゲートを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートします。
   3. ウェル内の液体を捨て、洗浄バッファーで3回洗浄します。
   4. 100 μLの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)を添加し、室温で15分間インキュベートします。
   5. 50 μLの停止溶液を加え、15〜20秒間穏やかに混合します。
   6. マイクロプレートリーダーを用いて波長450nmの吸光度(OD)を測定し、サンプル濃度を算出します。
   7. 統計ソフトウェアを使用して t検定または順位和検定を実行し、結果をプロットします。

結果

組織学的変化は、女性と男性、ヨウ素摂取期間、およびNaIの溶液で著しく異なっていました。 図1に示すように、NODの~10%。H-2h4マウスは24週齢でヨウ素誘導がなくてもSATを発症し、最終的にすべてのマウスが甲状腺炎を発症しました。通常の水を与えた場合、男性と女性の間で組織学的変化に有意差はありませんでした。飲料水にNaIを添加すると、甲状腺炎の発症が加速...

ディスカッション

HTは、リンパ球が甲状腺に浸潤し、甲状腺機能をさらに損ない、甲状腺特異的抗体を産生することによって引き起こされる自己免疫系障害が原因で発生します。HT患者の血清TSH、TgAb、およびTPOAbレベルは有意に上昇しています²⁷。現在、自己免疫性甲状腺炎の病因を研究するために、EATとSAT²⁹の2種類のマウスモデルが広く使用されています。EATマウスは、主?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Butorphanol tartrate	Supelco	L-044
Dexmedetomidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well	Sigma-Aldrich	M9410-1CS
Ethanol	macklin	64-17-5
Freund’s Adjuvant, Complete	Sigma-Aldrich	F5881
Freund’s Adjuvant, Incomplete	Sigma-Aldrich	F5506
Goat anti-Mouse IgG	invitrogen	SA5-10275
Midazolam solution	Supelco	M-908
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA	Calbiotech	DKO045
Paraformaldehyde	macklin	30525-89-4
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4864
Sodium Iodine	Sigma-Aldrich	7681-82-5
Thyroglobulin	Sigma-Aldrich	T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit	Thermo Scientific	EHTGX5
TSH ELISA	Calbiotech	DKO200
Xylene	macklin	1330-20-7