مقايسة بقعة الفراغ في الوقت الحقيقي

Marianela G. Dalghi; Nicolas Montalbetti; Travis B. Wheeler; Gerard Apodaca; Marcelo D. Carattino

doi:10.3791/64621

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

توضح هذه المقالة طريقة جديدة لدراسة سلوك إفراغ الماوس من خلال دمج مراقبة الفيديو في مقايسة بقعة الفراغ التقليدية. يوفر هذا النهج معلومات زمنية ومكانية وحجمية حول أحداث الإفراغ وتفاصيل سلوك الماوس خلال المراحل المضيئة والمظلمة من اليوم.

Abstract

سلوك الإفراغ الطبيعي هو نتيجة الوظيفة المنسقة للمثانة والإحليل والعضلة العاصرة للإحليل تحت السيطرة المناسبة للجهاز العصبي. لدراسة سلوك الإفراغ الطوعي في نماذج الفئران ، طور الباحثون مقايسة بقعة الفراغ (VSA) ، وهي طريقة تقيس عدد ومساحة بقع البول المودعة على ورقة ترشيح تبطن أرضية قفص الحيوان. على الرغم من أن هذا الفحص بسيط تقنيا وغير مكلف ، إلا أن له قيودا عند استخدامه كاختبار لنقطة النهاية ، بما في ذلك عدم وجود دقة زمنية لأحداث الإفراغ وصعوبات تحديد بقع البول المتداخلة. للتغلب على هذه القيود ، قمنا بتطوير VSA مراقب بالفيديو ، والذي نسميه VSA (RT-VSA) في الوقت الفعلي) ، والذي يسمح لنا بتحديد تردد الإفراغ ، وتقييم حجم الفراغ وأنماط الإفراغ ، وإجراء قياسات على مدى 6 ساعات من النوافذ الزمنية خلال كل من المرحلتين المظلمة والخفيفة من اليوم. يمكن تطبيق الطريقة الموضحة في هذا التقرير على مجموعة واسعة من الدراسات القائمة على الفئران التي تستكشف الجوانب الفسيولوجية والسلوكية العصبية للتبول الطوعي في حالات الصحة والمرض.

Introduction

يتم تنسيق تخزين البول والتبول بواسطة دائرة مركزية (الجهاز العصبي المركزي) تتلقى معلومات حول حالة ملء المثانة من خلال أعصاب الحوض وتحت المعدة. تشكل الظهارة البولية، وهي الظهارة التي تبطن المسالك البولية من الحوض الكلوي إلى مجرى البول القريب، حاجزا محكما أمام الفضلات الأيضية ومسببات الأمراض الموجودة في البول. إنه جزء لا يتجزأ من الشبكة الحسية ، التي تستشعر وتنقل حالة ملء المثانة إلى الأنسجة الكامنة والأعصاب الواردة ^1,2. يمكن أن يؤدي اضطراب حاجز الظهارة البولية ، أو التغيرات في مسارات النقل الميكانيكي للظهارة البولية ، إلى خلل وظيفي في الإفراغ إلى جانب انخفاض أعراض المسالك البولية مثل التردد والإلحاح والتبول الليلي وسلس البول³،⁴،⁵،⁶^،⁷. وبالمثل ، من المعروف أن الشيخوخة والسكري والتهابات المسالك البولية السفلية والتهاب المثانة الخلالي وعمليات المرض الأخرى التي تؤثر على المثانة البولية ، أو الدوائر المرتبطة بها التي تتحكم في وظيفتها ، تسبب اختلال وظيفي في المثانة⁸،⁹،^10،11،12،13،¹⁴،15،¹⁶،¹⁷ ^،^18,19. يعتمد الفهم الأفضل لسلوك الإفراغ الطبيعي وغير الطبيعي على تطوير طرق يمكنها التمييز بشكل موثوق بين أنماط التبول المختلفة.

تقليديا ، تمت دراسة سلوك الإفراغ الطوعي للفئران باستخدام مقايسة بقعة الفراغ (VSA) ، التي طورها Desjardins وزملاؤه²⁰ ، وتم اعتمادها على نطاق واسع بسبب بساطتها وتكلفتها المنخفضة ونهجها^{غير الجراحي 8}،21،22،²³^،²⁴. عادة ما يتم إجراء هذا الفحص كاختبار نقطة النهاية ، حيث يقضي الماوس قدرا محددا من الوقت في قفص مبطن بورق ترشيح ، والذي يتم تحليله لاحقا عن طريق حساب العدد وتقييم حجم بقع البول عند وضع ورق الترشيح تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (تتألق بقع البول في ظل هذه الظروف)²⁰. على الرغم من هذه المزايا العديدة ، فإن VSA التقليدي يقدم بعض القيود الرئيسية. نظرا لأن الفئران غالبا ما تتبول في نفس المناطق ، يتعين على الباحثين تقييد مدة الفحص لفترة زمنية قصيرة نسبيا (≤4 ساعات)²⁵. حتى عندما يتم إجراء VSA على مدى فترات زمنية أقصر ، يكاد يكون من المستحيل حل البقع الفارغة الصغيرة (SVSs) التي تقع فوق بقع فراغ كبيرة أو التمييز بين SVSs وترحيل البول الملتصق بالذيول أو الكفوف. كما أنه من الصعب جدا التمييز بين ما إذا كانت SVSs نتيجة لأحداث إفراغ متكررة ولكن فردية (نمط ظاهري يتم ملاحظته غالبا استجابة لالتهاب المثانة⁴،²⁶) ^، أو بسبب التنقيط بعد التبول (النمط الظاهري المرتبط بانسداد مخرج المثانة²⁷). علاوة على ذلك ، فإن الرغبة في إكمال الفحص خلال ساعات العمل ، إلى جانب صعوبات الوصول إلى مرافق الإسكان عند إطفاء الأنوار ، غالبا ما تحد من هذه المقايسات إلى فترة الإضاءة لدورة الساعة البيولوجية 24 ساعة. وبالتالي ، فإن هذه القيود الزمنية تمنع تقييم سلوك إفراغ الفئران خلال مرحلتها الليلية النشطة ، مما يقلل من القدرة على تحليل جينات أو علاجات معينة تحكمها إيقاعات الساعة البيولوجية.

للتغلب على بعض هذه القيود ، طور الباحثون طرقا بديلة لتقييم سلوك الإفراغ في الوقت الفعلي²⁶،^28،29،30،³¹^،³². تتضمن بعض هذه الأساليب استخدام معدات باهظة الثمن مثل أقفاص التمثيل الغذائي²⁶،²⁸،²⁹ ^، أو استخدام الكاميرات الحرارية³⁰ ؛ ومع ذلك ، هذه أيضا لها قيود. على سبيل المثال ، في الأقفاص الأيضية ، يميل البول إلى الالتصاق بأسلاك الأرضية الشبكية وجدران القمع ، مما يقلل من كمية البول التي يتم جمعها وقياسها. وبالتالي ، قد يكون من الصعب جمع البيانات بدقة حول الفراغات الصغيرة. علاوة على ذلك ، لا توفر الأقفاص الأيضية معلومات حول التوزيع المكاني لأحداث الإفراغ (أي التبول في الزوايا مقابل مركز الغرفة). بالنظر إلى أن الأشعة تحت الحمراء ذات الطول الموجي الطويل التي تستخدمها الكاميرات الحرارية لا تخترق المواد الصلبة ، يجب إجراء نشاط الإفراغ الذي يتم تقييمه بواسطة التصوير الحراري بالفيديو في نظام مفتوح ، والذي يمكن أن يكون صعبا مع الفئران النشطة ، حيث يمكنها القفز عدة بوصات في الهواء. نظام آخر هو نهج الصبغة المفرغة الآلية على الورق (aVSOP)³³ ، والذي يتكون من ورق ترشيح ملفوف ينتهي بسرعة ثابتة أسفل أرضية الشبكة السلكية لقفص الفأر. يمنع هذا النهج تلف الورق وتداخل بقع البول التي تحدث في VSA الكلاسيكي ، ويسمح تنفيذه للمحقق بإجراء تجارب على مدار عدة أيام. ومع ذلك ، فإنه لا يوفر للمحقق توقيتا دقيقا لأحداث الإفراغ ، ولا توجد قدرة على فحص السلوك وكيفية ارتباطه بالإكتشاف. للحصول على هذه المعلومات ، قام الباحثون بدمج المراقبة بالفيديو لمقايسات الإفراغ ، وهو نهج يسمح بالتقييم المتزامن لنشاط الفئران وأحداث التبول^31,32. يتمثل أحد الأساليب في وضع صمام ثنائي باعث للضوء الأزرق (LED) وكاميرا فيديو مزودة بمرشح بروتين مضان أخضر تحت القفص التجريبي لتصور أحداث الإفراغ ، ومصباح LED يعمل بالأشعة تحت الحمراء وكاميرا فيديو فوق القفص لالتقاط موضع الماوس³². تم استخدام هذا الإعداد لمراقبة سلوك الإفراغ أثناء إجراء القياس الضوئي للألياف. ومع ذلك ، فإن البيئة المضاءة بشكل مشرق لهذا النظام تتطلب من الباحثين علاج الفئران بعامل مدر للبول لتحفيز الإفراغ. في تصميم تجريبي آخر ، تم وضع كاميرات واسعة الزاوية أعلى وأسفل القفص التجريبي لتصور النشاط الحركي للفأر وأحداث التبول ، على التوالي. في هذه الحالة ، تم الكشف عن بقع البول المودعة على ورق ترشيح يبطن أرضية القفص عن طريق إضاءة ورق الترشيح بأضواء الأشعة فوق البنفسجية الموضوعة تحت القفص³¹. تم استخدام هذا الإعداد في فحوصات قصيرة ، مدتها 4 دقائق ، خلال مرحلة الضوء من اليوم لدراسة الخلايا العصبية في جذع الدماغ المشاركة في سلوك الإفراغ الطوعي³¹. لم يتم الإبلاغ عن مدى ملاءمة هذا النظام لاستخدامه خلال المرحلة المظلمة أو لفترات زمنية >4 دقيقة.

في هذه المقالة ، يتم وصف طريقة تعزز VSA التقليدي من خلال السماح بمراقبة الفيديو على المدى الطويل لسلوك إفراغ الماوس. يوفر هذا النهج الفعال من حيث التكلفة معلومات زمنية ومكانية وحجمية حول أحداث الإفراغ لفترات طويلة من الوقت خلال مراحل الضوء والظلام من اليوم ، إلى جانب التفاصيل المتعلقة بسلوك الماوس³^،⁴^،³⁴. يتم توفير معلومات مفصلة لبناء غرف التفريغ ، وتنفيذ VSA (RT-VSA) في الوقت الفعلي ، وتحليل البيانات. يعد RT-VSA ذا قيمة للباحثين الذين يسعون إلى فهم الآليات الفسيولوجية التي تتحكم في وظيفة الجهاز البولي ، وتطوير الأساليب الدوائية للتحكم في التبول ، وتحديد الأساس الجزيئي لعمليات المرض التي تؤثر على المسالك البولية السفلية.

Protocol

Piezo1/2 الفئران بالضربة القاضية المزدوجة (Pz1 / 2-KO ، النمط الوراثي: Piezo1 fl^{/ fl}; بيزو 2^{فلوريدا / فلوريدا} ؛ Upk2^CRE+/-) والضوابط (Pz1/2-C، النمط الجيني: Piezo1 fl^/fl; بيزو 2^{فلوريدا / فلوريدا} ؛ تم إنشاء Upk2^CRE-/-) داخليا من سلالات الوالدين التي تم الحصول عليها من مختبرات Jax (سلالة Piezo1 fl^{/ fl} # 029213; سلالة بيزو 2 فلوريدا^{/ فلوريدا} # 027720 ؛ Upk2^{CRE +/-} سلالة # 029281). تم استخدام كل من الفئران الإناث (1.5-3 أشهر ووزنها 17-20 جم) والذكور (2-4 أشهر ووزنها 23-29 جم) في التجارب. بالنسبة لتجارب التهاب المثانة الناجم عن سيكلوفوسفاميد ، تم استخدام الإناث من النوع البري C57Bl / 6J (3 أشهر من العمر و ~ 20 جم في الوزن) (مختبرات جاكسون ، سلالة # 000664). تم إيواء الحيوانات وأجريت التجارب في مرفق رعاية الحيوان بجامعة بيتسبرغ بموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة بيتسبرغ. أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة لسياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر وقانون رعاية الحيوان.

1. تجميع الأقفاص لمقايسة بقعة الفراغ في الوقت الفعلي (RT-VSA)

يتكون جهاز RT-VSA من حامل للأشعة فوق البنفسجية يحمل مصباحين للأشعة فوق البنفسجية وكاميرتين واسعتي الزاوية (كاميرات سفلية) ، والتي تستخدم لتسجيل نشاط الإفراغ خلال مرحلة الضوء من اليوم. رتب غرفتي ماوس للراحة على الحامل. قم بتوصيل كاميرات بزاوية عريضة (كاميرات علوية) بغطاء كل غرفة ماوس ، تستخدم لتسجيل نشاط الإفراغ خلال المرحلة المظلمة من اليوم (الشكل 1أ).
قم ببناء إطار حامل الأشعة فوق البنفسجية وغرف الماوس من 1 بوصة × 1 في مقاطع الألمنيوم المشقوقة على شكل حرف T. انظر الجدول 1 للحصول على قائمة بالمكونات المستخدمة لبناء غرفتي فأر وحامل الأشعة فوق البنفسجية والشكل 1ب - د للحصول على مناظر مختلفة للمكونات والأبعاد المجمعة.
قم ببناء كل حجرة ماوس بثمانية مقاطع ألومنيوم مشقوقة على شكل حرف T مقطوعة إلى 10 بوصات وأربعة مقطوعة إلى 14.75 بوصة. ابدأ بتجميع الجزء السفلي من حجرة الماوس واستخدم مثبتات النهاية القياسية (الجدول 1) لتجميع الملامح المشقوقة على شكل حرف T وفقا للشكل 1. قم بتركيب الأكريليك الذي ينقل الأشعة فوق البنفسجية 38.5 سم × 26.5 سم في القناة الداخلية للملفات الشخصية لبناء أرضية غرف الماوس.
ملاحظة: للحصول على معلومات مفصلة حول كيفية تجميع ملفات التعريف المشقوقة على شكل حرف T مع مثبتات النهاية القياسية ، قم بزيارة صفحة ويب الشركة.
بناء جدران غرفة الماوس مع بقية الملامح. قم بتركيب ألواح البولي كربونات المقاومة للتآكل (AR) مقاس 38.5 سم × 21.5 سم و 26.5 سم × 21.5 سم في المقاطع لتجميع الجدران الخارجية لحجرة الماوس. استخدم ألواح البولي كربونات AR مقاس 37.5 سم × 23.9 سم و 24.4 سم × 23.9 سم لبناء الجزء الداخلي من غرفة الماوس.
قم بتأمين ألواح البولي كربونات AR بقفل نهاية قياسي 1/4-20 مداس. راجع الإرشادات الخاصة بكيفية تركيب اللوحات في ملفات التعريف الموجودة على صفحة الويب في ملاحظة الخطوة 1.3. استخدم سد السيليكون التجاري لإغلاق التقاطعات بين الألواح الداخلية.
استخدم اثنين من 12 بوصة واثنين 14.75 في ملفات تعريف مشقوقة على شكل حرف T لتجميع غطاء القفص كما هو موضح في الشكل 1ب. قم بتركيب لوحة AR من البولي كربونات مقاس 38.5 سم × 26.5 سم في القناة الداخلية للمقاطع لإكمال الغطاء.
قم بتركيب دعم ملف تعريف الكاميرا مقاس 12 بوصة بشكل عمودي على المحاور الطويلة لأعلى القفص وقم بتثبيته بانتقالين خفيفين داخل أقواس الزاوية (تم وضع علامة 3 في الشكل 1ب). استخدم لوحة مسطحة مستقيمة (تحمل علامة 2) كدعم لتركيب كاميرا الويب وقم بتركيبها كما هو موضح في الشكل 1ب. قم بتوصيل الكاميرا بالدعم باستخدام برغي تثبيت الكاميرا.
استخدم مجموعة اليد اليمنى لمفصلة الرفع القياسية من السلسلة 10 لتوصيل الغطاء بجسم حجرة الماوس (تم وضع علامة 1 في الشكل 1ب).
قم ببناء حامل الأشعة فوق البنفسجية بأربعة مقاطع جانبية مشقوقة على شكل حرف T مقطوعة إلى 40 بوصة ، وأربعة مقاطع جانبية مشقوقة على شكل حرف T مقطوعة إلى 32 بوصة ، وأربعة مقاطع تعريف مشقوقة على شكل حرف T مقطوعة إلى 10 بوصات ، وفقا للشكل 1C ، D. قم بتركيب لوح مرآة أكريليك مقاس 82.5 سم × 26.5 سم في الملامح لبناء الجزء السفلي من غرفة الأشعة فوق البنفسجية.
استخدم لوح مرآة الأكريليك 82.5 سم × 30.5 سم و 26.5 سم × 30.5 سم لبناء جدار حامل الأشعة فوق البنفسجية.
قم بتوصيل الألواح المسطحة T ذات الخمسة ثقوب من السلسلة 10 (المميزة بعلامة 2 في الشكل 1 C) ، والألواح المسطحة L ذات الخمسة فتحات من السلسلة 10 (المميزة 3 في الشكل 1 C) ، والألواح المسطحة ذات الخمسة ثقوب من السلسلة 10 (المميزة 1 في الشكل 1C) لتأمين حامل الأشعة فوق البنفسجية.
قم بتركيب الكاميرات السفلية في ملف تعريف مشقوق على شكل حرف T مقطوع إلى 32 بوصة وتثبيته في الجزء السفلي من الحامل مع قوسين زاوية انتقاليين خفيفين كما هو موضح في الشكل 1د. استخدم لوحات مسطحة مستقيمة لتوصيل كاميرات الويب بملف تعريف T المشقوق .
قم بتركيب مصابيح الأشعة فوق البنفسجية في الداخل والأمام والخلف ، وقم بتوصيلها بالألواح المسطحة المستقيمة كما هو موضح في الشكل 1د.
قم بتوصيل كاميرات الويب الأربعة بمنافذ USB لجهاز كمبيوتر يقوم بتشغيل برنامج مراقبة بالفيديو.

2. إسكان الحيوانات قبل التجريب

فئران التجارب المنزلية ، إما تم تربيتها لهذا الغرض أو تم الحصول عليها من موقع خارجي ، في مجموعات من أربعة. عندما يكون ذلك ممكنا ، استخدم الفئران الإناث أو الذكور المتطابقة مع العمر لهذه التجارب. إذا تم الحصول على الحيوانات من مصدر خارجي ، اسمح لها بالتأقلم لمدة 7 أيام على الأقل قبل إجراء أي إجراءات تجريبية.
طوال فترة وجودهم في منشأة الحيوانات ، قم بإيواء الحيوانات في أقفاص قياسية تحتوي على فراش وإثراء (على سبيل المثال ، كوخ الإسكيمو البلاستيكي ، والعجلة ، وقطعة من الورق للتمزيق) واحتفظ بها تحت دورة نهارية / ليلية مدتها 12 ساعة ، مع إمكانية الوصول إلى الماء والفأر الجاف chow ad libitum.

3. تسجيلات RT-VSA خلال مراحل الضوء والظلام من اليوم

ملاحظة: يصف البروتوكول أدناه استخدام RT-VSA لتقييم سلوك إفراغ الماوس خلال المراحل المضيئة والمظلمة من اليوم. يتم الاحتفاظ بالحيوانات في دورة مظلمة مدتها 12 ساعة و 12 ساعة مع توقيت Zeitgeber (ZT) = 0 في الساعة 07:00 صباحا. تبدأ التسجيلات بين الساعة 10:30 صباحا و 11:00 صباحا (ZT = 3.5-4.0) لتجارب المرحلة الضوئية وبين الساعة 06:00 مساء و 06:30 مساء (ZT = 11.0-11.5) لتجارب المرحلة المظلمة. عندما يتم اختبار الحيوانات في ظل كلتا الحالتين ، يتم إجراء التجارب عادة في يومين منفصلين ، مع 5 أيام متتالية على الأقل بين اختبارات الضوء والظلام. لا ينبغي إجراء التجارب في الأيام التي يتم فيها تنظيف غرف الحيوانات أو تغيير الأقفاص ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى ضغوط تؤثر على سلوك الإفراغ. يجب تنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف الحد الأدنى من الضغط على الفئران.

نقل التجارب من موقع سكنها إلى غرفة الإجراءات حيث توجد غرف تسجيل RT-VSA.
تحضير غرفة التسجيل RT-VSA
1. ضع قطعة من ورق الترشيح (24,3 سم × 36,3 سم) في الجزء السفلي من كل قفص تسجيل RT-VSA. اعتمادا على الوقت من اليوم ، استخدم ورق ترشيح رقيق (تجارب المرحلة الخفيفة) أو سميك (تجارب المرحلة المظلمة).
  ملاحظة: يتم استخدام ورق الترشيح السميك أثناء المرحلة المظلمة النشطة لأنه أكثر مقاومة للتقطيع من ورق الترشيح الرقيق. تستخدم الكاميرات العلوية لتصور بقع البول المودعة على ورق ترشيح سميك أثناء المرحلة المظلمة. في المقابل ، أثناء مرحلة الضوء ، يتم استخدام الكاميرات السفلية لأن الضوء المحيط يمنع الكاميرات العلوية من اكتشاف بقع البول المودعة على ورق الترشيح. في هذه الحالة ، يتم استخدام ورق ترشيح رقيق. وجدنا أن الكاميرات السفلية غير فعالة في اكتشاف أحداث الإفراغ الصغيرة المودعة على ورق الترشيح السميك.
2. في الجزء العلوي من ورق الترشيح ، ضع العناصر التالية: كوخ الإسكيمو البلاستيكي (الذي يوفر مساحة للنوم) ، وأنبوب طرد مركزي صغير معقم سعة 1.5 مل لأغراض التخصيب ، وطبق بلاستيكي 60 مم × 15 مم يحتوي على قطعتين أو ثلاث قطع من تشاو جاف للفأر و 14-16 جم من الماء على شكل عبوة هلامية (جل ماء غير مبلل ؛ الشكل 2).
  ملاحظة: كان استخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل لأغراض التخصيب خاصا بالعلبة المستخدمة في هذه الدراسة.
3. بمجرد أن تصبح غرف التسجيل جاهزة ، ضع الفئران التجريبية برفق بالداخل عن طريق وضعها برفق على ورق الترشيح. تأكد من أن نقل الحيوانات من قفص السكن إلى أقفاص التسجيل يحدث بأقل قدر من الإجهاد.
4. بمجرد أن تكون جميع التجارب داخل أقفاص التسجيل الخاصة بها ، مع إغلاق أغطيتها ، قم بتغطية الجزء العلوي من الأغطية بلوحة زرقاء ماصة لتقليل انعكاسات الضوء المحيط المباشرة على سطح غطاء زجاج شبكي.
5. قم بتشغيل مصابيح الأشعة فوق البنفسجية في الغرفة السفلية.
  ملاحظة: الحيوانات ليس لها اتصال مباشر مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ضوء الأشعة فوق البنفسجية الموصى به مفصل في قسم المواد.
تسجيلات RT-VSA
1. لتسجيل الفيديو من الكاميرات العلوية والسفلية ، استخدم برنامج تسجيل المراقبة بالفيديو ، والذي يمكن تهيئته للتسجيل من كاميرات ويب متعددة أو كاميرات متصلة بالشبكة في وقت واحد.
2. عند فتح البرنامج ، ابدأ التسجيل بالضغط على Command و R في نافذة البرنامج. إجراء تسجيلات الفيديو بمعدل 1 إطار لكل ثانية.
3. مباشرة بعد بدء التسجيلات ، اخرج من الغرفة ، وأغلق الباب برفق. تأكد من بقاء الغرفة هادئة طوال مدة التجربة.
إنهاء تسجيلات RT-VSA
1. العودة إلى غرفة الإجراءات بعد 7 ساعات (تجارب المرحلة الضوئية) أو في صباح اليوم التالي (تجارب المرحلة المظلمة).
2. أوقف التسجيلات بالضغط على Command و T. أطفئ أضواء الأشعة فوق البنفسجية.
3. بعد إيقاف التسجيل ، يقوم البرنامج تلقائيا بإنشاء ملف فيلم (بتنسيق .m4v) لكل كاميرا وحفظه تحت اسم الكاميرا في مجلد وجهة محدد مسبقا. تحقق من أنه داخل كل مجلد كاميرا، يتم تنظيم التجارب في مجلدات حسب التاريخ.
4. في كل مجلد تاريخ/تجربة، تحقق من وجود ملف .m4v واحد وجميع ملفات .jpeg الفردية التي تتوافق مع كل إطار من إطارات الأفلام.
5. ملاحظة: يمكن استخدام ملفات .jpeg لاسترداد التجربة في حالة تلف ملفات الأفلام.
6. أنشئ مجلدا على سطح المكتب باسم التجربة وتاريخها وانقل جميع ملفات .m4v إلى هذا المجلد. إذا لزم الأمر ، احذف ملفات .jpeg بمجرد حفظ ملفات الأفلام ونسخها احتياطيا.
7. ملاحظة: بالنسبة لتجارب المرحلة الضوئية ، سيقوم البرنامج بإنشاء فيلم واحد لكل كاميرا ، بينما بالنسبة لتجارب المرحلة المظلمة ، سيولد فيلمين لكل كاميرا. وذلك لأنه يتم إنشاء ملف .m4v جديد بعد منتصف الليل عندما يتغير التاريخ.
8. انسخ المجلد الذي يحتوي على الأفلام إلى محرك أقراص محمول لتحليله في كمبيوتر خارجي. يمكن أن تستغرق هذه الخطوة عدة دقائق ويمكن تنفيذها بالتوازي مع الخطوات 3.5.1 إلى 3.5.3.
تنظيف أقفاص التسجيل ونقل فئران التجارب إلى موقع سكنها
1. قم بإزالة الوسادة الزرقاء التي تغطي أغطية الأقفاص. نقل الحيوانات من أقفاص التسجيل إلى قفص السكن الخاص بهم.
2. قم بإزالة الملحقات والمواد الغذائية في غرف التسجيل (مثل الأكواخ البلاستيكية والأنابيب البلاستيكية والطبق مع مساند من الطعام وهلام الماء وورق الترشيح) وتخلص منها في النفايات الخطرة بيولوجيا.
3. نظف الأقفاص باستخدام مكنسة كهربائية يدوية ، وقم بإزالة الكريات البرازية الموجودة في قاع القفص. ثم ، رش الأرضية والجدران الداخلية للقفص بنسبة 70 ٪ من الإيثانول وتنظيف الداخل بقطعة قماش ناعمة. اترك غطاء الأقفاص مفتوحا للسماح لها بالهواء الجاف.
4. ضع قفص السكن مع الحيوانات في حاوية ثانوية وانقل الحيوانات إلى موقع سكنها.

4. توليد منحنيات المعايرة

ملاحظة: هناك حاجة إلى منحنى معايرة لتحويل مناطق بقعة الفراغ إلى أحجام البول. في حالة إجراء تجارب خلال مراحل الضوء والظلام من اليوم ، يجب إنشاء منحنيين للمعايرة ، واحد لكل نوع من ورق الترشيح المستخدم (أوراق الترشيح الرقيقة والسميكة). يتم إنشاء منحنيات المعايرة في نسختين. يتم تشغيل كل نسخة متماثلة على ورق ترشيح موضوع في غرفة تسجيل RT-VSA. نظرا لتكوينه المعقد ، واستثارة الأشعة فوق البنفسجية ، استخدم بول الفأر لعمل منحنيات المعايرة.

جمع البول الفأر
1. خذ قطعة من الفيلم الشفاف المرن (10 سم × 15 سم) وضعها على مقعد.
2. اختر فأرا من ذيله وقفاه. تدليك بهدوء أسفل البطن للحث على التبول. جمع البول على سطح ورقة بلاستيكية فيلم شفاف.
3. حرر الحيوان بلطف داخل قفصه. باستخدام ماصة ، انقل البول من سطح الفيلم الشفاف إلى أنبوب طرد مركزي صغير معقم سعة 1.5 مل. كرر الإجراء مع فئران متعددة حتى يتم جمع ~ 10 مل من بول الفأر ، وتجميع البول ، وتخزينه في -20 درجة مئوية.
  ملاحظة: مطلوب ما مجموعه ~ 10 مل من بول الفأر لإنشاء منحنيات معايرة مكررة لمراحل الضوء والظلام. لتجنب إجهاد فئران التجارب ، لا تستخدم الفئران التي ستخضع لتجارب RT-VSA لجمع البول.
تسجيلات منحنى المعايرة
1. قم بإذابة البول الذي تم جمعه في الخطوة 4.1 واخلطه عن طريق الدوامة بلطف لمدة 10-15 ثانية.
2. ضع قطعة من ورق الترشيح الرفيع (24,3 سم × 36,3 سم) في كل من قفصي التسجيل RT-VSA.
3. ماصة أحجام البول التالية (بالميكرولتر) على كل ورقة من أوراق الترشيح: 2 و 5 و 10 و 25 و 50 و 80 و 100 و 200 و 300 و 400 و 500 و 750. لمنع تداخل البقع نتيجة الانتشار ، قم بتخصيص البقع على مسافة كافية من بعضها البعض.
4. أغلق غطاء الأقفاص وقم بتغطيتها بمنصات.
5. ابدأ التسجيل بالضغط على Command و R ، مع تطبيق نفس معلمات البرنامج المستخدمة لتسجيل التجارب (الخطوة 3.3.).
6. سجل منحنى المعايرة لمدة 1 ساعة للسماح بأقصى انتشار لبقع البول. اضغط على Command وT لإيقاف التسجيل.
7. قم بإنشاء مجلد جديد في سطح المكتب ، ضع ملفات .m4v فيه ، ثم انقل البيانات إلى محرك أقراص محمول لتحليلها لاحقا.
8. قم بإجراء مماثل لإنشاء منحنيات مكررة باستخدام ورق ترشيح سميك. في هذه الحالة ، أضف طبقات إضافية من الوسادات لتغميق المناطق الداخلية ومحاكاة ظروف المرحلة المظلمة.
تحليل تسجيلات منحنى المعايرة
1. افتح ملفات .m4v في برنامج مشغل الأفلام ، مع تكبير النافذة لملء الشاشة. لتحليل منحنيات المعايرة التي يتم إجراؤها على ورق ترشيح سميك ، استخدم الملفات التي تم الحصول عليها باستخدام الكاميرات العلوية (الشكل 3 أ). لتحليل منحنيات المعايرة التي يتم إجراؤها على ورق ترشيح رقيق ، استخدم الملفات التي تم الحصول عليها باستخدام الكاميرات السفلية (الشكل 3ب).
2. قم بتشغيل ملف .m4v ، مع تحريك شريط تمرير الوقت للأمام والخلف للحصول على نظرة عامة على فيلم منحنى المعايرة الكامل لمدة 1 ساعة.
3. حدد النطاق الزمني الذي تكون فيه بقع البول الأصغر (<25 ميكرولتر) ذات كثافة أكبر وتنتشر إلى أقصى حد. التقط لقطة شاشة ضمن هذا النطاق الزمني. قم بتسمية ملف لقطة الشاشة واحفظه كملف .png (الشكل 3أ ، اللوحة العلوية).
  ملاحظة: يتم التقاط لقطات الشاشة بالضغط على المفتاح F6. لإعداد F6 للحصول على لقطة شاشة ، حدد: تفضيلات النظام > اختصارات > لوحة المفاتيح، واكتب F6 في المربع الموجود على يمين خيار حفظ صورة الشاشة كملف .
4. حدد النطاق الزمني الذي يكون فيه لبقع البول المتوسطة والكبيرة (>50 ميكرولتر) مساحة قصوى والتقط لقطة شاشة. من الممكن ألا تكون بعض بقع البول الأصغر مرئية بحلول الوقت الذي تظهر فيه بقع البول الأكبر أقصى انتشار. قم بتسمية الملف واحفظ لقطة الشاشة كملف .png (الشكل 3أ ، اللوحة السفلية).
5. افتح برنامج ImageJ (NIH) ثم اسحب رمز ملف .png الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.3.3 لفتح ملف الصورة (الشكل 4أ).
6. من شريط الأدوات، حدد أيقونة تحديدات المضلع ، وحدد حدود ورقة الترشيح.
7. ثم حدد تحليل من شريط القائمة ، واختر تعيين القياسات من القائمة الموسعة ، ومن النافذة المنبثقة حدد المنطقة. انقر فوق موافق. يسمح هذا بالحصول على قيم المساحة عند تنفيذ الخطوة 4.3.8.
8. بعد ذلك ، حدد تحليل مرة أخرى من شريط القائمة واختر قياس من الخيارات الموسعة. تنبثق نافذة نتائج تحتوي على منطقة عمود تعرض قيم المنطقة بالبكسل² (الشكل 4ب - د).
9. حدد أيقونة التحديدات اليدوية من شريط الأدوات واستخدمها لرسم خط حول محيط بقعة فراغ فردية. قم بقياس المنطقة كما في الخطوة 4.3.8. يقوم البرنامج بتحديث جدول النتائج عند إجراء قياسات جديدة. تظهر مجموعة الأرقام الجديدة أسفل الأرقام السابقة. سجل الرقم الذي يظهر أسفل منطقة العمود في نافذة النتائج لكل بقعة تم تحليلها (الشكل 4E-G).
10. كرر الخطوات من 4.3.5 إلى 4.3.7 لكل نقطة من النقاط المتماثلة.
11. اضبط المساحة الإجمالية لورق الترشيح على أنها 100٪ واحسب النسبة المئوية للمساحة (٪ المساحة) لكل بقعة بول. سيؤدي هذا التطبيع إلى تصحيح الأخطاء التي قد تحدث نتيجة للاختلافات في التكبير / التصغير أو تحديد موضع الكاميرات.
12. قم بإنشاء جدول XY جديد في برنامج رسوم بيانية وأدخل قيم حجم البول (بالميكرولتر) في العمود X والقيم المكررة لمساحة ٪ في العمود Y.
13. ثم حدد تحليل > تحليل > تحليل XY > الانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى). من نافذة المعلمات التي تظهر، حدد نموذج > متعدد الحدود > متعدد الحدود من الدرجة الثانية (تربيعي).
14. ثم، من علامة التبويب أسلوب، انقر لوضع علامة على التحديدات التالية: انحدار المربعات الصغرى، بدون ترجيح، واعتبر كل قيمة Y مكررة كنقطة فردية.
15. من علامة التبويب تقييد، حدد B0 ونوع القيد > ثابت يساوي واكتب 0 ضمن عمود القيمة . انقر فوق موافق.

5. تحليل تسجيلات الفئران التجريبية

افتح ملف فيلم تم جمعه أثناء مرحلة الضوء (الكاميرا السفلية) أو المرحلة المظلمة (الكاميرا العلوية) لتحليلها.
قم بتقييم جودة ملف الفيلم عن طريق تحريك التمرير الزمني للأمام والخلف ، مع التأكد من أن ورق الترشيح يظل سليما (بدون تمزق أو مضغ) خلال النافذة الزمنية 6 ساعات المراد تحليلها. إذا تمزق الورق ، فلا تقم بإجراء مزيد من التحليل ، حيث قد يكون الفأر قد تبول على البلاستيك المكشوف الذي لا يمكن قياسه كميا (الشكل 5).
لتحليل التجارب التي تم جمعها في المراحل الفاتحة أو المظلمة، استخدم أمر التقديم السريع أو شريط تمرير شريط الوقت للانتقال إلى النافذة الزمنية المطلوبة. يتم تسجيل نشاط الإفراغ خلال مرحلة الضوء بين الساعة 11:00 صباحا و 05:00 مساء (ZT = 4.0-10.0) وخلال المرحلة المظلمة بين منتصف الليل إلى 06:00 صباحا (ZT = 17.0-23.0).
قم بتشغيل الفيلم في وضع التقديم السريع بالنقر فوق رمز >> (أو قم بالتمرير يدويا خلال الفيلم) ، بحثا عن دليل على أن الماوس يفرغ. أسهل طريقة لمعرفة حدوث ذلك هي البحث عن الظهور المفاجئ للبقع المضيئة من البول على ورق الترشيح. مؤشر آخر هو البحث عن التغييرات السلوكية بما في ذلك الحركة إلى زوايا القفص وفترة وجيزة من عدم النشاط عندما يكون الماوس فارغا.
ملاحظة: عندما يصبح المرء أفضل في اكتشاف الفراغات ، يمكن للمرء زيادة سرعة التمرير أو التقديم السريع. ومع ذلك ، في الفئران المصابة بالتهاب المثانة البكتيري والكيميائي ، والتي تحتوي على أعداد كبيرة جدا من الفراغات الصغيرة ^4,34 ، يمكن للمرء أن يفوت أحداث الإفراغ إذا تحرك المرء بسرعة كبيرة خلال الفيلم.
سجل الوقت الذي يحدث فيه كل فراغ. كاتفاقية ، يتم تسجيل وقت الفراغ عند أول علامة على اكتشاف البول (الشكل 6أ ، ب).
لإجراء قياسات للفراغ ، استخدم أولا شريط التمرير للتحرك للأمام (أو للخلف) في الوقت المناسب ، بحثا عن النقطة الزمنية التي حدث فيها أقصى انتشار لبقعة البول. أوقف الفيلم مؤقتا في هذه المرحلة ، والتقط لقطة شاشة كما هو موضح في الخطوة 4.3.3. ضع سهم فأرة الكمبيوتر في المكان قيد التحليل ، بحيث يتم تحديد نقطة الاهتمام في لقطة الشاشة (الشكل 6C ، D).
قم بتسمية ملف لقطة الشاشة باستخدام الأرقام المرتبطة لحساب ترتيب الظهور في الفيلم.
استمر في تحليل الملف ، وكرر الخطوتين 5.5 و 5.7 لكل بقعة فراغ في الفيلم. بمجرد تحليل جميع البقع الفارغة ، قم بقياس المساحة الإجمالية لورق الترشيح عن طريق التقاط لقطة شاشة واستخدام الخطوات الموضحة في 4.3.6.
احسب النسبة المئوية لمساحة كل بقعة من بقع البول كما هو موضح في الخطوة 4.3.9. قم بتحويل قيم٪ مساحة إلى حجم البول (ميكرولتر) لكل بقعة فراغ باستخدام منحنيات المعايرة التي تم إنشاؤها في الخطوة 4 ووظيفة الاستيفاء في برنامج الرسوم البيانية.
1. في برنامج الرسوم البيانية ، افتح جدول XY الذي يحتوي على بيانات منحنى المعايرة وأدخل قيم المساحة ٪ في العمود Y أسفل القيمة الأخيرة لمنحنى المعايرة (الشكل 7أ).
2. انقر فوق علامة التبويب جدول النتائج ، وضمن علامة التبويب النموذج ، انقر لتحديد استيفاء المجهولين من المنحنى القياسي واضغط على موافق. تظهر علامة تبويب باسم قيم X المتوسطة المقحمة بجوار علامة تبويب جدول النتائج. تحتوي علامة التبويب هذه على جدول يحتوي على القيم المقحمة التي تتوافق مع حجم البول بالميكرولتر لكل بقعة فراغ. (الشكل 7أ ، ب).
كرر الخطوات من 5.1 إلى 5.9 لتحليل جميع فئران التجارب.
قم بإنشاء ملف مصنف يحتوي على البيانات التي تم الحصول عليها من الخطوات 5.5 إلى 5.10 ، باستخدام جدول بيانات واحد لكل ماوس (الشكل 7ج). قم بإنشاء ملف واحد لتجارب المرحلة الخفيفة وآخر لتجارب المرحلة المظلمة. تحتوي هذه الملفات الرئيسية على جميع البيانات الأولية والحسابات اللازمة المستخدمة في مزيد من التحليلات.

6. تحليل نمط التبول من الفئران التجريبية

قم بإنشاء ملفات تعريف بقعة الفراغ الأولية والثانوية (الشكل 8أ ، ب والشكل 9).
ملاحظة: وفقا لدراسات توزيع التردد 23 ، تمثل البقع الفارغة التي تبلغ ≥20 ميكرولتر عادة >95٪ من إجمالي الحجم المفرغ وتعتبر بقع فراغ أولية (PVSs)⁸،²³^،³⁵. تعتبر البقع الفارغة التي تبلغ ≤20 ميكرولتر بقع فراغ ثانوية أو صغيرة (SVSs). وقد تبين أن التمييز بين PVSs و SVSs هو نهج مفيد لتوصيف الأنماط الظاهرية للإفراغ. يشير العدد المرتفع من SVSs إلى خلل وظيفي في الإفراغ³⁵.
1. من الملف الرئيسي الذي يحتوي على بيانات بقعة إفراغ ذات أهمية (مرحلة الضوء أو المرحلة المظلمة) ، صنف البقع بناء على حجمها على أنها PVSs عندما يكون حجمها ≥20 ميكرولتر ، أو SVSs عندما يكون حجمها <20 ميكرولتر.
2. احسب الرقم واحسب متوسط الحجم الملغى والحجم الإجمالي ل PVSs. احسب الرقم واحسب الحجم الإجمالي ل SVSs.
3. قم بإنشاء شريط رسم بياني يقارن عنصر التحكم بالفئران المعالجة لكل معلمة من المعلمات المحسوبة: عدد PVSs ، الحجم الملغى ل PVSs ، الحجم الإجمالي ل PVSs ، عدد SVSs ، الحجم الإجمالي ل SVSs.
اختياري: قم بإنشاء مخطط حجم فراغ تراكمي (وظيفة الدرج) لإظهار سلوك الإفراغ بمرور الوقت (الشكل 10 والشكل 11).
1. افتح الملف الرئيسي للمصنف وقم بتحويل وقت الإفراغ ، والذي يتم التعبير عنه بالساعات والدقائق والثواني ، إلى الصيغة العشرية. احسب حجم البول التراكمي (بالميكرولتر) لكل نقطة زمنية.
2. قم بإنشاء جدول XY في برنامج الرسوم البيانية مع الوقت في شكل عشري في العمود X وأحجام البول التراكمية في العمود Y. انسخ بيانات الوقت وحجم البول في الجدول. أضف نقاط بيانات (0؛ 0) و(6؛ القيمة القصوى). هذه النقاط ضرورية لإكمال الخطوط الأفقية للمخطط في بداية التجربة (الوقت: 0 ساعة) عندما يكون الحجم المفرغ صفرا (0 ؛ 0) ، وفي نهاية التجربة (الوقت: 6 ساعات) عندما تكون القيمة التراكمية للبول المفرغ مساوية للقيمة التي تم الحصول عليها لحدث الإفراغ الأخير (6 ؛ القيمة القصوى).
3. انقر نقرا مزدوجا على الرسم البياني ؛ يجب أن تظهر نافذة تنسيق الرسم البياني. حدد علامة التبويب المظهر ، وانقر لإلغاء تحديد الزر إظهار الرموز وانقر لتحديد إظهار الخط / المنحنى. انقر فوق خيار النمط وحدد البقاء على قيد الحياة.

النتائج

سلوك إفراغ الفئران Piezo1/2 بالضربة القاضية Piezo 1/2

خلال مرحلة التخزين من دورة التبول ، يفترض أن تستشعر الظهارة البولية التوتر الذي يمارسه البول المتراكم في المثانة ولتحويل هذا التحفيز الميكانيكي إلى استجابات خلوية مثل إطلاق ATP المصلي ^1,3

Discussion

يعد دمج المراقبة بالفيديو تعديلا فعالا من حيث التكلفة يقدم العديد من المزايا على VSA الكلاسيكي. في VSA الكلاسيكي ، والذي يستخدم عادة كفحص لنقطة النهاية ، من الصعب التمييز بين البقع الفارغة المتداخلة. هذا ليس مصدر قلق تافه ، حيث تميل الفئران إلى التبول عدة مرات في نفس المنطقة عندما يطول الفحص ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01DK119183 (إلى GA و MDC) ، وجائزة مشروع تجريبي من خلال P30DK079307 (إلى M.G.D.) ، وجائزة التطوير الوظيفي لجمعية جراحة المسالك البولية الأمريكية ومنحة مؤسسة وينترز (إلى NM) ، ومن قبل فسيولوجيا الخلية والكائنات النموذجية لتصوير الكلى من مركز بيتسبرغ لأبحاث الكلى (P30DK079307).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 10 inches	80/20	1010	Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 12 inches	80/20	1010	Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 40 inches	80/20	1010	Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches	80/20	1010	Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches	80/20	1010	Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut	80/20	3280	Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut	80/20	3287	Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support	80/20	14061	Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate	80/20	4118	Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate	80/20	4081	Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate	80/20	4080	Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate	80/20	4140	Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly	80/20	2064	Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket	80/20	4509	Amount: 6
24”-long UV tube lights	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)	Thermo Fisher Scientific	57144
Cosmos blotting paper (thick paper)	Blick Art Materials	10422-1005
Excel	Microsoft Corporation
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 9.4.0	graphing and statistics software
ImageJ FIJI	NIH
Parafilm	Merck		transparent film
Quick Time Player 10.5 software	Apple		multimedia player
Security spy	Ben software		video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20	80/20	3381	Amount: 80
UV transmitting acrylic	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm
Water gel: HydroGel	ClearH2O	70-01-5022	(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam	Logitech	C930e	Amount: 4

References

Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621 (2020).
de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327 (2015).
Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1 (2022).
Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070 (2015).
Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509 (2019).
Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160 (2020).
Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111 (2022).
Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230 (2013).
Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314 (2006).
Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450 (2007).
Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1 (2014).
Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79 (2014).
Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89 (2014).
Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26 (2014).
Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128 (2010).
Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939 (1973).
Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548 (2008).
Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31 (2021).
Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653 (2001).
Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101 (2013).
Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170 (2019).
Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449 (2020).
Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73 (2016).
Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303 (2019).
Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: