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Resumo

Este artigo descreve um novo método para estudar o comportamento miccional de camundongos incorporando o monitoramento de vídeo no ensaio convencional de ponto vazio. Essa abordagem fornece informações temporais, espaciais e volumétricas sobre os eventos miccionais e detalhes do comportamento do camundongo durante as fases clara e escura do dia.

Resumo

O comportamento miccional normal é o resultado da função coordenada da bexiga, da uretra e dos esfíncteres uretrais sob o controle adequado do sistema nervoso. Para estudar o comportamento miccional voluntário em modelos de camundongos, os pesquisadores desenvolveram o void spot assay (VSA), um método que mede o número e a área de manchas de urina depositadas em um papel de filtro que reveste o chão da gaiola de um animal. Embora tecnicamente simples e barato, este ensaio apresenta limitações quando usado como um ensaio de desfecho, incluindo a falta de resolução temporal dos eventos miccionais e dificuldades em quantificar manchas de urina sobrepostas. Para superar essas limitações, desenvolvemos um VSA videomonitorado, que chamamos de VSA em tempo real (RT-VSA), e que nos permite determinar a frequência miccional, avaliar o volume miccional e os padrões miccionais e fazer medições ao longo de janelas de tempo de 6 h durante as fases escura e clara do dia. O método descrito neste relato pode ser aplicado a uma ampla variedade de estudos baseados em camundongos que exploram os aspectos fisiológicos e neurocomportamentais da micção voluntária em estados de saúde e doença.

Introdução

O armazenamento de urina e a micção são coordenados por um circuito central (sistema nervoso central) que recebe informações sobre o estado de enchimento vesical através dos nervos pélvico e hipogástrico. O urotélio, o epitélio que reveste o trato urinário da pelve renal até a uretra proximal, forma uma barreira apertada aos resíduos metabólicos e patógenos presentes na urina. É um componente integrante de uma teia sensorial, que detecta e comunica o estado de enchimento da bexiga aos tecidos subjacentes e nervos aferentes 1,2. A ruptura da barreira urotelial ou alterações nas vias de mecanotransdução urotelial podem levar à disfunção miccional associada a sintomas do trato urinário inferior, como frequência, urgência, noctúria e incontinência 3,4,5,6,7. Da mesma forma, sabe-se que o envelhecimento, o diabetes, as infecções do trato urinário inferior, a cistite intersticial e outros processos patológicos que afetam a bexiga urinária, ou o circuito associado que controla sua função, causam disfunção vesical 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Uma melhor compreensão do comportamento miccional normal e anormal depende do desenvolvimento de métodos que possam discriminar de forma confiável entre os diferentes padrões de micção.

Tradicionalmente, o comportamento miccional voluntário de camundongos tem sido estudado por meio do void spot assay (VSA), desenvolvido por Desjardins e colaboradores20, e amplamente adotado devido à sua simplicidade, baixo custo e abordagem não invasiva8,21,22,23,24. Esse ensaio é tipicamente realizado como um ensaio final, no qual um camundongo passa um tempo definido em uma gaiola forrada por um papel de filtro, que é posteriormente analisado contando o número e avaliando o tamanho das manchas de urina quando o papel de filtro é colocado sob luz ultravioleta (UV) (as manchas de urina fluorescem nessas condições)20. Apesar dessas muitas vantagens, a ASV tradicional apresenta algumas limitações importantes. Como os camundongos frequentemente urinam nas mesmas áreas, os investigadores têm que restringir a duração do ensaio a um período de tempo relativamente curto (≤4 h)25. Mesmo quando a VSA é realizada em períodos de tempo mais curtos, é quase impossível resolver pequenas manchas miccionais (SVSs) que caem sobre grandes manchas vazias ou, discriminar SVSs do transporte de urina aderida à cauda ou patas. Também é muito difícil distinguir se as SVS são consequência de eventos miccionais frequentes, mas individuais (fenótipo frequentemente observado em resposta à cistite4,26), ou devido ao gotejamento pós-miccional (fenótipo associado à obstrução vesical 27). Além disso, o desejo de completar o ensaio durante o horário de trabalho, juntamente com as dificuldades de acesso às instalações habitacionais quando as luzes são apagadas, muitas vezes limita esses ensaios ao período de luz do ciclo circadiano de 24 horas. Assim, essas restrições de tempo impedem a avaliação do comportamento miccional de camundongos durante sua fase noturna ativa, diminuindo a capacidade de analisar genes específicos ou tratamentos que são governados por ritmos circadianos.

Para superar algumas dessas limitações, pesquisadores desenvolveram métodos alternativos para avaliar o comportamento miccional em tempo real 26,28,29,30,31,32. Algumas dessas abordagens envolvem o uso de equipamentos de alto custo, como gaiolas metabólicas26,28,29, ou o uso de câmeras térmicas30; no entanto, estes também têm limitações. Por exemplo, em gaiolas metabólicas, a urina tende a aderir aos fios do chão de malha e às paredes do funil, reduzindo a quantidade de urina que é coletada e medida. Assim, pode ser difícil coletar dados com precisão sobre pequenos vazios. Além disso, as gaiolas metabólicas não fornecem informações sobre a distribuição espacial dos eventos miccionais (i.e., micção nos cantos vs. no centro da câmara). Dado que a radiação infravermelha de comprimento de onda longo utilizada pelas câmeras termográficas não penetra nos sólidos, a atividade miccional avaliada pela videotermografia deve ser realizada em um sistema aberto, o que pode ser desafiador com camundongos ativos, pois eles podem saltar vários centímetros no ar. Outro sistema é a abordagem automatizada de mancha anulada sobre papel (aVSOP)33, que consiste em papel de filtro enrolado que enrola a uma velocidade constante abaixo do piso de malha de arame de uma gaiola de mouse. Essa abordagem evita danos no papel e a sobreposição de manchas de urina que ocorrem no VSA clássico, e sua implementação permite que o investigador realize experimentos ao longo de vários dias. No entanto, não fornece ao investigador o momento preciso dos eventos miccionais, e não há capacidade de examinar o comportamento e como ele se correlaciona com a mancha. Para obter essas informações, pesquisadores incorporaram o videomonitoramento aos ensaios miccionais, uma abordagem que permite a avaliação simultânea da atividade do camundongo e dos eventos miccionais31,32. Uma abordagem consiste na colocação de um diodo emissor de luz azul (LED) e uma câmera de vídeo com um filtro de proteína de fluorescência verde sob a gaiola experimental para visualizar os eventos miccionais, e um LED infravermelho e uma câmera de vídeo acima da gaiola para capturar a posição do mouse32. Esta configuração tem sido usada para monitorar o comportamento miccional durante a realização de fotometria de fibra; No entanto, o ambiente iluminado desse sistema exigiu que os pesquisadores tratassem seus camundongos com um agente diurético para estimular a micção. Em outro desenho experimental, câmeras grande angulares foram colocadas acima e abaixo da gaiola experimental para visualizar eventos de atividade motora e micção de camundongos, respectivamente. Nesse caso, manchas de urina depositadas em um papel de filtro que reveste o chão da gaiola foram reveladas iluminando o papel filtro com luzes UV colocadas sob a gaiola31. Essa configuração foi utilizada em ensaios curtos, com 4 min de duração, durante a fase leve do dia, para estudar os neurônios do tronco encefálico envolvidos no comportamento miccional voluntário31. A adequação deste sistema para seu uso durante a fase escura ou por períodos de tempo >4 min não foi relatada.

Neste artigo, é descrito um método que aprimora o VSA tradicional, permitindo o monitoramento de vídeo de longo prazo do comportamento miccional do mouse. Essa abordagem custo-efetiva fornece informações temporais, espaciais e volumétricas sobre eventos miccionais por longos períodos de tempo durante as fases clara e escura do dia, juntamente com detalhes relacionados ao comportamento do camundongo 3,4,34. São fornecidas informações detalhadas para a construção das câmaras de micção, a implementação de um VSA em tempo real (RT-VSA) e a análise dos dados. O RT-VAR é valioso para pesquisadores que buscam compreender os mecanismos fisiológicos que controlam a função do sistema urinário, desenvolver abordagens farmacológicas para o controle da micção e definir as bases moleculares dos processos patológicos que afetam o trato urinário inferior.

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Protocolo

Camundongos uroteliais Piezo1/2 double knockout (Pz1/2-KO, genótipo: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) e controles (Pz1/2-C, genótipo: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) foram gerados internamente a partir de cepas parentais obtidas dos laboratórios Jax (cepa Piezo1 fl/fl # 029213; Piezo2 fl/fl cepa # 027720; Upk2CRE+/- cepa # 029281). Camundongos fêmeas (1,5–3 meses de idade e 17–20 g de peso) e machos (2–4 meses de idade e 23–29 g de peso) foram utilizados nos experimentos. Para os experimentos de cistite induzida por ciclofosfamida, foram utilizadas fêmeas selvagens C57Bl/6J (3 meses de idade e ~20 g de peso) (laboratórios Jackson, cepa # 000664). Os animais foram alojados e os experimentos foram realizados no Centro de Cuidados com Animais da Universidade de Pittsburgh sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes da Política do Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório e da Lei de Bem-Estar Animal.

1. Montagem de gaiolas para ensaio de ponto vazio em tempo real (RT-VSA)

  1. O equipamento RT-VSA consiste em um suporte UV que contém duas lâmpadas UV e duas câmeras grande angular (câmeras inferiores), que são usadas para registrar a atividade miccional durante a fase de luz do dia. Organize duas câmaras de mouse para descansar no suporte. Conecte câmeras grande angular (câmeras superiores) à tampa de cada câmara do mouse, usada para registrar a atividade miccional durante a fase escura do dia (Figura 1A).
  2. Construa a estrutura do suporte UV e das câmaras do mouse de 1 em x 1 em perfis de alumínio com fenda em T. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista dos componentes usados para construir duas câmaras de mouse e o suporte UV e a Figura 1B–D para obter as diferentes visualizações dos componentes e dimensões montados.
  3. Construa cada câmara de rato com oito perfis de alumínio com fenda em T cortados a 10 pol e quatro cortados a 14,75 pol. Comece montando o fundo da câmara do mouse e use fixadores de extremidade padrão (Tabela 1) para montar os perfis com fenda em T de acordo com a Figura 1. Monte o acrílico transmissor UV de 38,5 cm x 26,5 cm no canal interno dos perfis para construir o piso das câmaras do mouse.
    NOTA: Para obter informações detalhadas sobre como montar os perfis com fenda em T com fixadores de extremidade padrão, visite a página da empresa.
  4. Construa as paredes da câmara do mouse com o resto dos perfis. Monte os painéis de policarbonato resistente à abrasão (AR) de 38,5 cm x 21,5 cm e 26,5 cm x 21,5 cm nos perfis para montar as paredes externas da câmara do mouse. Use os painéis de policarbonato AR de 37,5 cm x 23,9 cm e 24,4 cm x 23,9 cm para construir o interior da câmara do mouse.
  5. Fixe os painéis de policarbonato AR com o fixador de extremidade padrão 1/4-20 da banda de rodagem. Consulte as instruções de como montar os painéis nos perfis na página da Web na NOTA da etapa 1.3. Utilize calafetagem de silicone comercial para vedar as junções entre os painéis internos.
  6. Utilizar dois perfis de 12 polegadas e dois perfis de 14,75 polegadas em T para montar a tampa da gaiola, conforme indicado na Figura 1B. Monte um painel de policarbonato AR de 38,5 cm x 26,5 cm no canal interno dos perfis para completar a tampa.
  7. Monte o suporte de perfil da câmera 12 em perpendicular aos eixos longos da parte superior da gaiola e fixe com dois suportes de transição leve dentro dos suportes de canto (marcados como 3 na Figura 1B). Use uma placa plana reta (marcada como 2) como suporte de montagem da webcam e monte-a como mostrado na Figura 1B. Conecte a câmera ao suporte com o parafuso de montagem da câmera.
  8. Use o conjunto da dobradiça de elevação padrão da série 10 para fixar a tampa ao corpo da câmara do mouse (marcado como 1 na Figura 1B).
  9. Construa o suporte UV com quatro perfis com fenda em T cortados para 40 pol, quatro perfis com fenda em T cortados para 32 polegadas e quatro perfis com fendas em T cortados para 10 pol, de acordo com a Figura 1C,D. Monte uma folha espelhada de acrílico de 82,5 cm x 26,5 cm nos perfis para construir o fundo da câmara UV.
  10. Use a folha espelhada de acrílico de 82,5 cm x 30,5 cm e 26,5 cm x 30,5 cm para construir a parede do suporte UV.
  11. Conecte as placas planas T de cinco furos da série 10 (marcadas com 2 na Figura 1 C), as placas planas de cinco furos L da série 10 (marcadas com 3 na Figura 1 C) e as placas planas de cinco furos da série 10 (marcadas com 1 na Figura 1C) para fixar o suporte UV.
  12. Monte as câmeras inferiores em um perfil com fenda em T cortado para 32 polegadas e afixe na parte inferior do suporte com dois suportes de canto de transição leves, conforme mostrado na Figura 1D. Use placas planas retas para conectar as webcams ao perfil com fenda em T.
  13. Monte as lâmpadas UV nos perfis interno, frontal e traseiro e fixe nas placas planas retas como mostrado na Figura 1D.
  14. Conecte as quatro webcams às portas USB de um computador executando um software de vigilância por vídeo.

2. Alojamento de animais antes da experimentação

  1. Camundongos experimentais domésticos, criados propositalmente ou obtidos de um sítio externo, em grupos de quatro. Quando possível, use camundongos fêmeas ou machos compatíveis com a idade para esses experimentos. Se os animais forem obtidos de uma fonte externa, deixe-os aclimatar-se durante pelo menos 7 dias antes de realizar quaisquer procedimentos experimentais.
  2. Durante todo o tempo em que permanecerem no biotério, alojar os animais em gaiolas padrão contendo cama e enriquecimento (por exemplo, iglu plástico, roda, pedaço de papel para trituração) e mantê-los sob um ciclo dia/noite de 12 horas, com acesso a água e ração seca ad libitum.

3. Registros de RT-VSA durante as fases clara e escura do dia

NOTA: O protocolo abaixo descreve o uso do RT-VSA para avaliar o comportamento miccional do camundongo durante as fases clara e escura do dia. Os animais são mantidos em um ciclo claro de 12 h e escuro de 12 h com tempo de Zeitgeber (ZT) = 0 às 07:00 h. As gravações iniciam-se entre 10:30h e 11:00h (ZT = 3,5–4,0) para os experimentos da fase clara e entre 18:00h e 18:30h (ZT = 11,0–11,5) para os experimentos da fase escura. Quando os animais são testados em ambas as condições, os experimentos são tipicamente realizados em dois dias separados, com pelo menos 5 dias consecutivos entre os testes claro e escuro. Os experimentos não devem ser realizados em dias em que os biotérios são limpos ou as gaiolas são trocadas, pois podem resultar em estresses que afetam o comportamento miccional. Todas as etapas devem ser realizadas em condições de estresse mínimo para os camundongos.

  1. Transportar os animais experimentais de seu alojamento para a sala de procedimentos onde estão localizadas as câmaras de registro RT-VSA.
  2. Preparação da câmara de gravação RT-VSA
    1. Coloque um pedaço de papel de filtro (24,3 cm x 36,3 cm) no fundo de cada gaiola de gravação RT-VSA. Dependendo da hora do dia, use papel de filtro fino (experimentos de fase clara) ou grosso (experimentos de fase escura).
      NOTA: O papel de filtro espesso é usado durante a fase escura ativa, pois é mais resistente à trituração do que o papel de filtro fino. As câmeras superiores são usadas para visualizar manchas de urina depositadas em papel de filtro espesso durante a fase escura. Em contraste, durante a fase de luz, as câmeras inferiores são usadas porque a luz ambiente impede que as câmeras superiores detectem manchas de urina depositadas no papel de filtro. Neste caso, utiliza-se papel de filtro fino. Descobrimos que as câmeras inferiores são ineficazes na detecção de pequenos eventos miccionais depositados em papel de filtro espesso.
    2. Em cima do papel de filtro, coloque os seguintes itens: um iglu de plástico (que oferece um espaço para dormir), um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL para fins de enriquecimento e um prato plástico de 60 mm x 15 mm contendo dois ou três pedaços de ração seca de camundongo e 14 a 16 g de água na forma de um pacote de gel (gel de água não umectante; Gráfico 2).
      OBS: O uso de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para fins de enriquecimento foi específico para o invólucro utilizado neste estudo.
    3. Quando as câmaras de gravação estiverem prontas, coloque delicadamente os ratos experimentais dentro deitando-os suavemente sobre o papel de filtro. Certifique-se de que a transferência dos animais da gaiola de alojamento para as gaiolas de gravação ocorra com o mínimo de estresse.
    4. Uma vez que todos os animais experimentais estejam dentro de suas gaiolas de registro, com suas tampas fechadas, cubra a parte superior das tampas com um bluepad de bancada absorvente para minimizar os reflexos diretos da luz ambiente na superfície da tampa de plexiglass.
    5. Acenda as luzes UV na câmara inferior.
      OBS: Os animais não têm contato direto com a luz UV. A luz UV recomendada é detalhada na seção de materiais.
  3. Gravações RT-VSA
    1. Para gravar vídeo das câmeras superior e inferior, use um software de gravação de vigilância por vídeo, que pode ser configurado para gravar a partir de várias webcams ou câmeras em rede ao mesmo tempo.
    2. Ao abrir o programa, inicie a gravação pressionando Command e R na janela do programa. Execute gravações de vídeo a uma taxa de 1 quadro por s.
    3. Imediatamente após iniciar as gravações, saia da sala, fechando a porta suavemente. Certifique-se de que a sala permaneça silenciosa durante toda a duração do experimento.
  4. Concluir gravações RT-VSA
    1. Retornar à sala de procedimentos após 7 h (experimentos de fase clara) ou na manhã seguinte (experimentos de fase escura).
    2. Pare as gravações pressionando Command e T. Desligue as luzes UV.
    3. Depois de interromper a gravação, o software gera automaticamente um arquivo de filme (em formato .m4v) para cada câmera e o salva sob o nome da câmera em uma pasta de destino selecionada anteriormente. Verifique se, dentro de cada pasta da câmera, os experimentos estão organizados em pastas por data.
    4. Em cada pasta de data/experimento, verifique se há um arquivo .m4v e todos os arquivos .jpeg individuais que correspondem a cada um dos quadros de filme.
    5. Observação : os arquivos .jpeg podem ser usados para recuperar o experimento no caso de arquivos de filme ficar corrompido.
    6. Crie uma pasta na área de trabalho com o nome e a data do experimento e transfira todos os arquivos .m4v para essa pasta. Se necessário, exclua os arquivos de .jpeg depois que os arquivos de filme forem salvos e copiados.
    7. NOTA: Para experimentos de fase clara, o software gerará um filme por câmera, enquanto para experimentos de fase escura, ele gerará dois filmes para cada câmera. Isso ocorre porque um novo arquivo .m4v é gerado após a meia-noite, quando a data é alterada.
    8. Copie a pasta que contém os filmes em uma unidade flash para análise em um computador externo. Esta etapa pode levar vários minutos e pode ser executada em paralelo com as etapas 3.5.1 a 3.5.3.
  5. Limpeza das gaiolas de gravação e transferência de camundongos experimentais de volta ao local de alojamento
    1. Retire o bluepad que cobre as tampas das gaiolas. Transfira os animais das gaiolas de gravação para a gaiola de alojamento.
    2. Remova os acessórios e alimentos nas câmaras de gravação (por exemplo, iglus de plástico, tubos de plástico, prato com restos de ração e gel de água e papel de filtro) e elimine-os em resíduos bioperigosos.
    3. Limpe as gaiolas usando um aspirador de mãos, removendo ração e pellets fecais presentes no fundo da gaiola. Em seguida, borrife o piso e as paredes internas da gaiola com etanol 70% e limpe o interior com um pedaço de pano macio. Deixe a tampa das gaiolas aberta para deixá-las secar ao ar.
    4. Coloque a gaiola de alojamento com os animais em um recipiente secundário e transporte os animais de volta ao seu local de alojamento.

4. Geração de curvas de calibração

NOTA: Uma curva de calibração é necessária para converter áreas de pontos miccionais em volumes de urina. Se realizar experimentos durante as fases clara e escura do dia, então duas curvas de calibração devem ser geradas, uma para cada tipo de papel de filtro usado (papéis de filtro finos e grossos). As curvas de calibração são geradas em duplicata. Cada réplica é executada em um papel de filtro colocado em uma câmara de gravação RT-VSA. Dada a sua composição complexa, e excitabilidade UV, use urina de rato para fazer as curvas de calibração.

  1. Coleta de urina de camundongo
    1. Pegue um pedaço de filme transparente flexível (10 cm x 15 cm) e coloque-o em um banco.
    2. Escolha um rato pelo rabo e aperte-o. Massageie suavemente o abdômen inferior para induzir a micção. Coletar urina na superfície da folha de plástico de filme transparente.
    3. Solte o animal suavemente dentro de sua gaiola. Usando uma pipeta, transfira a urina da superfície do filme transparente para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL. Repita o procedimento com vários ratos até que ~10 mL de urina de camundongo sejam coletados, agrupe a urina e armazene a -20 °C.
      NOTA: Um total de ~10 mL de urina de camundongo é necessário para gerar curvas de calibração duplicadas para as fases clara e escura. Para evitar estresse em camundongos experimentais, não utilize camundongos que serão submetidos a experimentos de RT-VSA para coleta de urina.
  2. Gravações de curvas de calibração
    1. Descongele a urina coletada na etapa 4.1 e misture-a suavemente por 10 a 15 s.
    2. Coloque um pedaço de papel de filtro fino (24,3 cm x 36,3 cm) em cada uma das duas gaiolas de gravação RT-VSA.
    3. Pipetar os seguintes volumes de urina (em μL) em cada um dos papéis-filtro: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 e 750. Para evitar a sobreposição de pontos como resultado da difusão, aloque os pontos a uma distância suficiente uns dos outros.
    4. Feche a tampa das gaiolas e cubra-as com almofadas.
    5. Inicie a gravação pressionando Command e R, aplicando os mesmos parâmetros de software usados para gravar os experimentos (passo 3.3.).
    6. Registrar a curva de calibração por 1 h para permitir a máxima difusão dos pontos urinários. Pressione Command e T para interromper a gravação.
    7. Crie uma nova pasta na área de trabalho, coloque os arquivos .m4v nela e transfira os dados para uma unidade flash para análise subsequente.
    8. Execute um procedimento semelhante para gerar curvas duplicadas com papel de filtro grosso. Neste caso, adicione camadas extras de almofadas para escurecer o interior e simular condições de fase escura.
  3. Análise dos registros da curva de calibração
    1. Abra os arquivos .m4v em um software de player de filme, maximizando a janela para preencher a tela. Para analisar as curvas de calibração realizadas em papel filtro grosso, utilize os arquivos obtidos com as câmeras superiores (Figura 3A). Para analisar as curvas de calibração realizadas em papel filtro fino, utilize os arquivos obtidos com as câmeras inferiores (Figura 3B).
    2. Reproduza o arquivo .m4v, movendo o controle deslizante de tempo para frente e para trás para obter uma visão geral do filme completo da curva de calibração de 1 h.
    3. Identifique o intervalo de tempo em que as manchas de urina menores (<25 μL) têm maior intensidade e se espalharam ao máximo. Tire uma captura de tela dentro desse intervalo de tempo. Nomeie o arquivo de captura de tela e salve-o como um arquivo .png (Figura 3A, painel superior).
      NOTA: As capturas de tela são feitas pressionando a tecla F6. Para configurar F6 para aquisição de capturas de tela, selecione: Preferências do Sistema > Atalhos de > de Teclado e escreva F6 na caixa localizada à direita da opção Salvar Imagem da Tela como Arquivo .
    4. Identifique o intervalo de tempo em que as manchas de urina médias e grandes (>50 μL) têm área máxima e faça uma captura de tela. É possível que algumas das manchas de urina menores não sejam visíveis no momento em que as manchas maiores de urina exibem difusão máxima. Nomeie o arquivo e salve a captura de tela como um arquivo .png (Figura 3A, painel inferior).
    5. Abra o software ImageJ (NIH) e arraste e solte o ícone de arquivo .png obtido na etapa 4.3.3 para abrir o arquivo de imagem (Figura 4A).
    6. Na barra de ferramentas, selecione o ícone Seleções de Polígono e delineie a borda do papel de filtro.
    7. Em seguida, selecione Analisar na barra de menus, escolha Definir medidas no menu expandido e, na janela exibida, selecione Área. Clique em OK. Isso permite obter valores de área quando a etapa 4.3.8 é executada.
    8. Em seguida, selecione Analisar novamente na barra de menus e escolha Medir nas opções expandidas. Uma janela de resultados aparece contendo uma área de coluna que mostra os valores de área no pixel2 (Figura 4B–D).
    9. Selecione o ícone Seleções à mão livre na barra de ferramentas e use-o para desenhar uma linha ao redor do perímetro de um ponto vazio individual. Meça a área como na etapa 4.3.8. O software atualiza a tabela de resultados à medida que novas medições são realizadas. O novo conjunto de números aparece abaixo dos anteriores. Registre o número que aparece sob a área da coluna da janela de resultados para cada ponto analisado (Figura 4E–G).
    10. Repita as etapas 4.3.5 a 4.3.7 para cada um dos pontos de replicação.
    11. Defina a área total do papel de filtro como 100% e calcule a porcentagem de área (% área) para cada ponto de urina. Essa normalização corrigirá erros que podem ocorrer como consequência de diferenças no zoom ou posicionamento das câmeras.
    12. Crie uma nova tabela XY em um programa gráfico e insira os valores de volume de urina (em μL) na coluna X e os valores duplicados de % de área na coluna Y.
    13. Em seguida, selecione Análise > Análise > análise XY > Regressão não linear (ajuste de curva). Na janela de parâmetros exibida, selecione Modelo > Polinômio > Polinômio de Segunda Ordem (quadrático).
    14. Em seguida, na guia método, clique para marcar as seguintes seleções: Regressão de Mínimos Quadrados, Sem Ponderação e Considere cada valor Y de Replicação como um ponto individual.
    15. Na guia restrição, selecione B0, Tipo de restrição > Constante igual a e digite 0 na coluna Valor. Clique em OK.

5. Análise dos registros experimentais de camundongos

  1. Abra um arquivo de filme coletado durante a fase clara (câmera inferior) ou escura (câmera superior) para análise.
  2. Avalie a qualidade do arquivo de filme movendo o rolador de tempo para frente e para trás, confirmando que o papel filtro permanece intacto (sem rasgar ou mastigar) durante a janela de tempo de 6 horas a ser analisada. Se o papel estiver rasgado, não faça análise adicional, pois o camundongo pode ter urinado no plástico exposto, o que não pode ser quantificado (Figura 5).
  3. Para analisar experimentos coletados nas fases clara ou escura, use o comando de avanço rápido ou o controle deslizante da barra de tempo para mover para a janela de tempo desejada. A atividade miccional durante a fase clara é registrada entre 11:00 e 17:00 horas (ZT = 4,0–10,0) e durante a fase escura entre meia-noite e 06:00 horas (ZT = 17,0–23,0).
  4. Reproduza o filme no modo de avanço rápido clicando no ícone de >> (ou role manualmente pelo filme), procurando evidências de que o mouse está anulando. A maneira mais fácil de saber que isso está ocorrendo é procurar o aparecimento repentino de pontos brilhantes de urina no papel de filtro. Outro indicador é procurar mudanças comportamentais, incluindo movimento para os cantos da gaiola e um breve período de inatividade quando o mouse está miccionando.
    NOTA: À medida que se torna melhor na detecção de vazios, pode-se aumentar a velocidade de rolagem ou encaminhamento rápido. No entanto, em camundongos com cistite bacteriana e quimicamente induzida, que têm um número muito grande de pequenos vazios 4,34, pode-se perder eventos miccionais se nos movermos muito rapidamente pelo filme.
  5. Registre o horário em que cada vazio ocorre. Como convenção, o tempo da micção é registrado ao primeiro sinal de que a urina é detectada (Figura 6A,B).
  6. Para fazer medições do vazio, primeiro use a barra de rolagem para avançar (ou retroceder) no tempo, procurando o ponto no tempo em que ocorreu a difusão máxima do ponto de urina. Pause o filme neste ponto e faça uma captura de tela conforme descrito na etapa 4.3.3. Coloque a seta do mouse do computador no ponto sob análise, para que o ponto de interesse seja marcado na captura de tela (Figura 6C,D).
  7. Nomeie o arquivo de captura de tela usando números correlativos para explicar a ordem de aparição no filme.
  8. Continue analisando o arquivo, repetindo as etapas 5.5 e 5.7 para cada ponto vazio no filme. Uma vez que todos os pontos vazios tenham sido analisados, meça a área total do papel filtro capturando uma captura de tela e usando os passos descritos em 4.3.6.
  9. Calcular a % de área de cada uma das manchas de urina, conforme descrito no passo 4.3.9. Transformar os valores de % de área em volume de urina (μL) para cada ponto de urina utilizando as curvas de calibração geradas na etapa 4 e a função de interpolação no software gráfico.
    1. No software gráfico, abra a tabela XY contendo os dados da curva de calibração e insira os valores de área % na coluna Y abaixo do último valor da curva de calibração (Figura 7A).
    2. Clique na guia Tabela de Resultados e, na guia modelo, clique para selecionar Interpolar Desconhecidos da Curva Padrão e pressione OK. Uma guia chamada valores médios X interpolados aparece ao lado da guia tabela de resultados. Esta guia contém uma tabela com os valores interpolados que correspondem ao volume de urina em μL para cada ponto de micção. (Figura 7A,B).
  10. Repita as etapas 5.1 a 5.9 para analisar todos os camundongos experimentais.
  11. Crie um arquivo de pasta de trabalho que contenha os dados obtidos das etapas 5.5 a 5.10, usando uma planilha por mouse (Figura 7C). Crie um arquivo para os experimentos de fase clara e outro para os experimentos de fase escura. Esses arquivos mestre contêm todos os dados brutos e cálculos necessários usados em análises posteriores.

6. Análise do padrão urinário de camundongos experimentais

  1. Gere perfis de pontos vazios primários e secundários (Figura 8A,B e Figura 9).
    OBS: De acordo com estudos de distribuição defrequência23, as manchas miccionais ≥20 μL tipicamente representam >95% do volume miccional total e são consideradas manchas miccionais primárias (SVPs)8,23,35. As manchas vazias com ≤20 μL são consideradas manchas secundárias ou pequenas manchas (SVSs). A discriminação entre SVPs e SVSs tem se mostrado uma abordagem útil para caracterizar fenótipos miccionais. Um número elevado de SVS indica disfunção miccional35.
    1. A partir do arquivo mestre contendo dados de pontos miccionais de interesse (fase clara ou fase escura), classifique as manchas com base em seu volume como PVSs quando seu volume é ≥20 μL, ou SVSs quando seu volume é <20 μL.
    2. Conte o número e calcule o volume médio esvaziado e o volume total para os PVSs. Conte o número e calcule o volume total para os SVSs.
    3. Gere uma barra gráfica que compare o controle com os camundongos tratados para cada um dos parâmetros calculados: número de PVSs, volume miccional de PVSs, volume total de PVSs, número de SVSs, volume total de SVSs.
  2. Opcional: Gere um gráfico de volume vazio cumulativo (função escada) para mostrar o comportamento miccional ao longo do tempo (Figura 10 e Figura 11).
    1. Abra o arquivo mestre da pasta de trabalho e converta o tempo de anulação, que é expresso em horas, minutos e segundos, na forma decimal. Calcular o volume cumulativo de urina (em μL) para cada ponto de tempo.
    2. Gere uma tabela XY no software gráfico com o tempo em forma decimal na coluna X e volumes de urina acumulados na coluna Y. Copie os dados de tempo e volume de urina para a tabela. Adicione (0; 0) e (6; valor máximo) pontos de dados. Esses pontos são necessários para completar as linhas horizontais do gráfico no início do experimento (tempo: 0 h), quando o volume miccionado é zero (0; 0), e no final do experimento (tempo: 6 h), quando o valor cumulativo da urina miccionada é igual ao valor obtido para o último evento miccional (6; valor máximo).
    3. Clique duas vezes no gráfico; A janela Formatar gráfico deve aparecer. Selecione a guia Aparência , clique para desmarcar o botão para Mostrar símbolos e clique para selecionar Mostrar linha/curva de conexão. Clique na opção Estilo e selecione Sobrevivência.

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Resultados

Comportamento miccional de camundongos knockout uroteliais Piezo1/2

Durante a fase de armazenamento do ciclo miccional, hipotetiza-se o urotélio para detectar a tensão exercida pela urina acumulada na bexiga e transduzir esse estímulo mecânico em respostas celulares, como a liberação serosa de ATP 1,3. Demonstramos anteriormente que os canais de PIEZO1 e PIEZO2 ativados mecanicamente são expressos no u...

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Discussão

A incorporação da videomonitoração é uma modificação custo-efetiva que apresenta diversas vantagens em relação à VSA clássica. No VSA clássico, que é tipicamente usado como um ensaio de ponto final, é difícil distinguir pontos vazios sobrepostos. Esta não é uma preocupação trivial, pois os ratos tendem a urinar várias vezes na mesma área quando o ensaio é prolongado por várias horas, normalmente nos cantos de sua gaiola. Assim, a primeira vantagem do RT-VSA é que o examinador pode facilmente ident...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma R01DK119183 de concessão do NIH (para G.A. e M.D.C.), um prêmio de projeto piloto através do P30DK079307 (para M.G.D.), um prêmio de Desenvolvimento de Carreira da Associação Americana de Urologia e uma concessão da Fundação Winters (para N.M.), e pelo Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores do Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
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1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches80/201010Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches80/201010Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches80/201010Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches80/201010Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut80/203280Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut80/203287Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support80/2014061Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate80/204118Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate80/204081Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate80/204080Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate80/204140Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly80/202064Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket80/204509Amount: 6
24”-long UV tube lightsADJ Products LLCT8-F20BLB24Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror SheetProfesional PlasticsAmount: 1
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26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror SheetProfesional PlasticsAmount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Amount: 2
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AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Amount: 4
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AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper) Thermo Fisher Scientific57144
Cosmos blotting paper (thick paper)Blick Art Materials10422-1005
ExcelMicrosoft Corporation
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.4.0graphing and statistics software
ImageJ FIJINIH
ParafilmMercktransparent film
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Water gel: HydroGelClearH2O  70-01-5022(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
WebcamLogitechC930eAmount: 4

Referências

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  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070(2015).
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