실시간 보이드 스팟 어세이

요약

이 기사에서는 기존의 공극 스팟 분석에 비디오 모니터링을 통합하여 마우스 배뇨 거동을 연구하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 보이드 이벤트에 대한 시간적, 공간적, 체적 정보와 낮의 밝고 어두운 단계 동안 마우스 동작의 세부 정보를 제공합니다.

초록

정상적인 배뇨 행동은 신경계의 적절한 제어 하에 방광, 요도 및 요도 괄약근의 조정된 기능의 결과입니다. 마우스 모델에서 자발적인 배뇨 행동을 연구하기 위해 연구자들은 동물 케이지 바닥을 감싸는 여과지에 퇴적된 소변 반점의 수와 면적을 측정하는 방법인 공극 반점 분석(VSA)을 개발했습니다. 기술적으로 간단하고 저렴하지만 이 분석은 배뇨 사건의 시간적 분해능 부족과 겹치는 소변 반점을 정량화하는 데 어려움을 포함하여 종말점 분석으로 사용할 때 한계가 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 실시간 VSA(RT-VSA)라고 하는 비디오 모니터링 VSA를 개발했으며, 이를 통해 보이드 주파수를 결정하고, 보이드 볼륨 및 보이드 패턴을 평가하고, 낮의 어두운 단계와 밝은 단계 모두에서 6시간 동안 측정할 수 있습니다. 이 보고서에 설명된 방법은 건강 및 질병 상태에서 자발적인 배뇨의 생리학적 및 신경행동적 측면을 탐구하는 다양한 마우스 기반 연구에 적용할 수 있습니다.

서문

소변 저장과 배뇨는 골반 및 하복부 신경을 통해 방광 충전 상태에 대한 정보를 수신하는 중추 회로(중추 신경계)에 의해 조정됩니다. 신장 골반에서 근위 요도까지 요로를 둘러싸고 있는 상피인 요로상피는 소변에 존재하는 대사 노폐물과 병원체에 대한 단단한 장벽을 형성합니다. 이것은 방광의 충전 상태를 감지하고 기저 조직과 구심성 신경에 전달하는 감각 웹의 필수 구성 요소입니다 ^1,2. 요로상피막의 파괴 또는 요로상피기계 전달 경로의 변화는 빈뇨, 절박뇨, 야뇨증, 요실금과 같은 하부 요로 증상과 함께 배뇨 기능 장애를 유발할 수 있다 3,4,5,6,7. 마찬가지로, 노화, 당뇨병, 하부 요로 감염, 간질성 방광염, 및 방광 또는 그 기능을 조절하는 관련 회로에 영향을 미치는 다른 질병 과정은 방광 기능 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17^{, 18,19}. 정상 및 비정상 배뇨 행동에 대한 더 나은 이해는 다양한 배뇨 패턴을 안정적으로 구별할 수 있는 방법의 개발에 달려 있습니다.

전통적으로, 마우스의 자발적인 배뇨 거동은 데자르뎅(Desjardins)과 동료들에 의해 개발된 공극 반점 분석(void spot assay, VSA)을 사용하여 연구되어 왔으며²⁰, 그 단순성, 저비용, 비침습적 접근법으로 인해 널리 채택되었다 8,21,22,23,24. 이 분석은 일반적으로 종말점 분석으로 수행되며, 마우스는 여과지가 늘어선 케이지에서 정의된 시간을 보내고, 이후 여과지를 자외선(UV) 광선(이러한 조건에서 소변 반점이 형광을 발함) 아래에 놓았을 때 소변 반점의 수를 세고 크기를 평가하여 분석합니다^.20. 이러한 많은 장점에도 불구하고 기존 VSA에는 몇 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 생쥐는 종종 같은 부위에서 소변을 보기 때문에 연구자는 분석 기간을 비교적 짧은 시간(≤4시간)으로 제한해야 합니다²⁵. VSA가 더 짧은 기간에 걸쳐 수행되더라도 큰 공극 반점 위로 떨어지는 작은 공극 반점(SVS)을 해결하거나 꼬리나 발에 부착된 소변의 이월과 SVS를 구별하는 것은 거의 불가능합니다. 또한 SVS가 빈번하지만 개별적인 배뇨 사건(방^광염에 대한 반응으로 종종 관찰되는 표현^형)의 결과인지 아니면 배뇨 후 드리블(방광출구 폐쇄와 관련된 표현형)의 결과인지 구별하는 것도 매우 어렵습니다²⁷). 또한, 근무 시간 동안 분석을 완료하려는 욕구와 조명이 꺼졌을 때 주거 시설에 접근하는 데 어려움이 있기 때문에 이러한 분석은 종종 24시간 일주기 주기의 조명 기간으로 제한됩니다. 따라서 이러한 시간 제약은 활성 야간 단계에서 마우스 배뇨 행동의 평가를 방해하여 일주기 리듬에 의해 제어되는 특정 유전자 또는 치료법을 분석하는 능력을 감소시킵니다.

이러한 한계 중 일부를 극복하기 위해 연구자들은 실시간으로 배뇨 거동을 평가하는 대체 방법을 개발했습니다 26,28,29,30,31,32. 이러한 접근법 중 일부는 대사 케이지(^{26, 28, 29})와 같은 고가의 장비의 사용 또는 열화상 카메라⁽³⁰)의 사용을 포함한다; 그러나 이것들 역시 한계가 있습니다. 예를 들어, 대사 케이지에서 소변은 메쉬 바닥의 와이어와 깔때기 벽에 달라붙는 경향이 있어 수집 및 측정되는 소변의 양을 줄입니다. 따라서 작은 공극에 대한 데이터를 정확하게 수집하기 어려울 수 있습니다. 또한, 대사 케이지는 배뇨 사건의 공간적 분포(즉, 모서리 대 챔버 중앙의 배뇨)에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 열화상 카메라에서 사용하는 장파장 적외선이 고체를 투과하지 않는다는 점을 감안할 때, 비디오 열화상 촬영으로 평가한 공극 활동은 개방형 시스템에서 수행해야 하며, 이는 활성 마우스가 공중에서 몇 인치를 점프할 수 있기 때문에 어려울 수 있습니다. 또 다른 시스템은 aVSOP(Automated voided stain on paper) 접근법(³³)이며, 이는 마우스 케이지의 철망 바닥 아래에서 일정한 속도로 감겨 있는 압연 여과지로 구성된다. 이 접근법은 종이 손상과 고전적인 VSA에서 발생하는 소변 반점의 겹침을 방지하며, 이를 구현하여 조사자가 며칠 동안 실험을 수행할 수 있도록 합니다. 그러나 조사관에게 배뇨 사건의 정확한 시기를 제공하지 않으며 행동 및 그것이 스포팅과 어떤 관련이 있는지 조사할 수 있는 능력이 없습니다. 이 정보를 얻기 위해, 연구자들은 마우스 활동과 배뇨 사건을 동시에 평가할 수 있는 접근법인 배뇨 분석에 비디오 모니터링을 통합했다^31,32. 한 가지 접근법은 청색 발광 다이오드(LED) 및 녹색 형광 단백질 필터 세트를 갖는 비디오-카메라를 실험 케이지 아래에 배치하여 보이드 이벤트를 시각화하고, 적외선 LED 및 비디오-카메라를 케이지 위에 배치하여 마우스 위치⁽³²)를 캡처하는 것으로 구성된다. 이 설정은 섬유 측광을 수행하는 동안 보이드 거동을 모니터링하는 데 사용되었습니다. 그러나 이 시스템의 밝은 조명 환경에서는 조사관이 배뇨를 자극하기 위해 이뇨제로 마우스를 치료해야 했습니다. 또 다른 실험 설계에서는 광각 카메라를 실험 케이지 위와 아래에 배치하여 마우스 운동 활동과 배뇨 이벤트를 각각 시각화했습니다. 이 경우, 케이지 바닥을 라이닝하는 여과지 상에 침착된 소변 반점은 케이지(³¹) 아래에 배치된 UV 광으로 여과지를 조명함으로써 드러났다. 이 설정은 자발적인 배뇨 행동³¹에 관여하는 뇌간 뉴런을 연구하기 위해 하루 중 가벼운 단계 동안 4분 동안 짧은 분석에 사용되었습니다. 암흑기 동안 또는 >4분 동안 사용하기 위한 이 시스템의 적합성은 보고되지 않았습니다.

이 기사에서는 마우스 보이드 동작에 대한 장기 비디오 모니터링을 허용하여 기존 VSA를 향상시키는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 비용 효율적인 접근법은 마우스 행동(^3,4,34)과 관련된 세부사항과 함께, 하루의 밝은 단계와 어두운 단계 동안 연장된 기간 동안 이벤트 무효화에 대한 시간적, 공간적^, 체적 정보를 제공한다. 보이드 챔버의 구성, 실시간 VSA(RT-VSA)의 구현 및 데이터 분석에 대한 자세한 정보가 제공됩니다. RT-VSA는 비뇨기계의 기능을 제어하는 생리학적 메커니즘을 이해하고, 배뇨를 조절하기 위한 약리학적 접근법을 개발하고, 하부 요로에 영향을 미치는 질병 과정의 분자적 기초를 정의하려는 연구자에게 유용합니다.

프로토콜

Urothelial Piezo1/2 이중 녹아웃 마우스(Pz1/2-KO , 유전자형: Piezo1 fl^/fl; 피에조2 fl^/fl; Upk2^CRE+/-) 및 대조군(Pz1/2-C, 유전자형: Piezo1 fl^/fl; 피에조2 fl^/fl; Upk2^CRE-/-)는 Jax 실험실에서 얻은 부모 균주(Piezo1 fl^/fl 균주 #029213; Piezo2 fl^/fl 균주 # 027720; Upk2^CRE+/- 균주 # 029281). 암컷 (1.5-3 개월, 체중 17-20g)과 수컷 (2-4 개월, 체중 23-29g) 마우스를 실험에 사용했다. 시클로포스파미드 유발 방광염 실험을 위해 야생형 C57Bl/6J 암컷(생후 3개월, 체중 ~20g)을 사용했습니다(Jackson laboratories, 균주 #000664). 동물을 수용하고 실험은 피츠버그 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 하에 피츠버그 대학 동물 보호 시설에서 수행되었습니다. 모든 동물 실험은 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책 및 동물 복지법의 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 실시간 보이드 스팟 분석(RT-VSA)을 위한 케이지 조립

1. RT-VSA 장비는 2개의 UV 전구와 2개의 광각 카메라(하단 카메라)를 고정하는 UV 스탠드로 구성되며, 이 카메라는 하루 중 조명 단계에서 공극 활동을 기록하는 데 사용됩니다. 스탠드에 놓을 두 개의 마우스 챔버를 배치합니다. 광각 카메라(상단 카메라)를 각 마우스 챔버의 뚜껑에 부착하여 하루 중 어두운 단계에서 배뇨 활동을 기록하는 데 사용합니다(그림 1A).
2. UV 스탠드 및 마우스 챔버의 프레임을 1 in x 1 in T-슬롯 알루미늄 프로파일로 구성합니다. 두 개의 마우스 챔버와 UV 스탠드를 구축하는 데 사용되는 구성 요소 목록은 표 1을 참조하고 조립된 구성 요소 및 치수의 다양한 보기는 그림 1B-D 를 참조하십시오.
3. 10인치로 절단된 8개의 T-슬롯 알루미늄 프로파일과 14.75인치로 절단된 4개의 T-슬롯 알루미늄 프로파일로 각 마우스 챔버를 구성합니다. 마우스 챔버의 바닥을 조립하는 것으로 시작하고 표준 엔드 패스너(표 1)를 사용하여 T-슬롯 프로를 조립합니다.file그림 1에 따라. 38.5 cm x 26.5 cm UV 투과 아크릴을 프로파일의 내부 채널에 장착하여 마우스 챔버의 바닥을 구축한다.
   알림: 표준 엔드 패스너가 있는 T-슬롯 프로파일을 조립하는 방법에 대한 자세한 내용은 회사 웹 페이지를 참조하십시오.
4. 나머지 프로파일로 마우스 챔버의 벽을 만듭니다. 38.5cm x 21.5cm 및 26.5cm x 21.5cm 내마모성(AR) 폴리카보네이트 패널을 프로파일에 장착하여 마우스 챔버의 외벽을 조립합니다. 37.5cm x 23.9cm 및 24.4cm x 23.9cm AR 폴리카보네이트 패널을 사용하여 마우스 챔버의 내부를 구성합니다.
5. 표준 엔드 패스너 1/4-20 트레드로 AR 폴리카보네이트 패널을 고정합니다. 프로에 패널을 장착하는 방법에 대한 지침을 참조하십시오.file1.3단계의 참고에 있는 웹 페이지의 페이지에서. 상업용 실리콘 코크를 사용하여 내부 패널 사이의 접합부를 밀봉하십시오.
6. 2개의 12인치 및 2개의 14.75인치 T-슬롯 프로files를 사용하여 그림 1B에 표시된 대로 케이지 뚜껑을 조립합니다. 38.5cm x 26.5cm AR 폴리카보네이트 패널을 프로파일의 내부 채널에 장착하여 덮개를 완성합니다.
7. 카메라 프로에 12 장착 file 케이지 상단의 긴 축에 수직으로 지지대를 고정하고 모서리 브래킷 내부에 두 개의 라이트 트랜지션으로 고정합니다(그림 3B에서 1로 표시됨). 직선 평판(2로 표시)을 web캠 장착 지지대로 그림 1B와 같이 장착합니다. 카메라 장착 나사를 사용하여 카메라를 지지대에 부착합니다.
8. 10 시리즈 표준 리프트오프 힌지 오른쪽 어셈블리를 사용하여 마우스 챔버 본체에 덮개를 부착합니다(그림 1B에서 1로 표시됨).
9. 그림 1C,D에 따라 4개의 T-슬롯 프로파일이 40인치로 절단되고, 4개의 T-슬롯 프로파일이 32인치로 절단되고, 4개의 T-슬롯이 있는 프로파일이 10인치로 절단된 UV 스탠드를 구성합니다. 82.5cm x 26.5cm 아크릴 미러 시트를 프로파일에 장착하여 UV 챔버의 바닥을 만듭니다.
10. 82.5cm x 30.5cm 및 26.5cm x 30.5cm 아크릴 미러 시트를 사용하여 UV 스탠드의 벽을 구성합니다.
11. 10 시리즈 5홀 T 플랫 플레이트(그림 2 C에서 1로 표시), 10 시리즈 5홀 L 플랫 플레이트(그림 3 C에서 1로 표시) 및 10 시리즈 5홀 티 플랫 플레이트(그림1 C에서 1로 표시)를 부착하여 UV 스탠드를 고정합니다.
12. 하단 카메라를 T-슬롯 프로에 장착file 32인치로 자르고 그림 1D와 같이 두 개의 라이트 전환 코너 브래킷으로 스탠드 바닥에 부착합니다. 직선 평판을 사용하여 웹캠을 T-슬롯 프로에 부착file.
13. UV 램프 장착amps 내부, 전면 및 후면에 files를 선택하고 그림 1D와 같이 직선 평판에 부착합니다.
14. 4개의 웹캠을 비디오 감시 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터의 USB 포트에 연결합니다.

2. 실험 전 동물 사육

1. 사육되거나 외부 사이트에서 얻은 실험용 마우스를 4 마리의 그룹으로 수용합니다. 가능하면 이러한 실험에 연령이 일치하는 암컷 또는 수컷 마우스를 사용하십시오. 동물을 외부 출처에서 얻은 경우 실험 절차를 수행하기 전에 최소 7 일 동안 순응하도록하십시오.
2. 동물 시설에 있는 동안 침구와 농축물(예: 플라스틱 이글루, 바퀴, 파쇄용 종이)이 들어 있는 표준 케이지에 동물을 수용하고 물과 마른 쥐 차우를 자유롭게 이용할 수 있는 12시간 주야간 주기로 유지합니다.

3. 하루 중 밝고 어두운 단계 동안의 RT-VSA 기록

알림: 아래 프로토콜은 RT-VSA를 사용하여 하루 중 밝고 어두운 단계에서 마우스 배뇨 행동을 평가하는 방법을 설명합니다. 동물들은 오전 07:00에 Zeitgeber 시간(ZT) = 0인 12시간 조명 및 12시간 어두운 주기로 유지됩니다. 기록은 밝은 위상 실험의 경우 오전 10:30에서 오전 11:00(ZT = 3.5–4.0) 사이, 어두운 단계 실험의 경우 오후 06:00에서 오후 06:30(ZT = 11.0–11.5) 사이에 시작됩니다. 동물을 두 조건 모두에서 시험할 때 실험은 일반적으로 밝은 시험과 어두운 시험 사이에 최소 연속 5일과 함께 별도의 이틀에 걸쳐 수행됩니다. 동물실을 청소하거나 케이지를 교체하는 날에는 배뇨 행동에 영향을 미치는 스트레스가 발생할 수 있으므로 실험을 수행해서는 안 됩니다. 모든 단계는 마우스에 대한 최소한의 스트레스 조건 하에서 수행되어야합니다.

1. 실험 동물을 사육장에서 RT-VSA 기록 챔버가 있는 시술실로 운반합니다.
2. RT-VSA 레코딩 챔버 준비
   1. 각 RT-VSA 기록 케이지의 바닥에 여과지(24.3cm x 36.3cm)를 놓습니다. 하루 중 시간에 따라 얇은(밝은 단계 실험) 또는 두꺼운(어두운 단계 실험) 여과지를 사용합니다.
      알림: 두꺼운 여과지는 얇은 여과지보다 파쇄에 더 강하기 때문에 활성 암흑기에 사용됩니다. 탑 카메라는 어두운 단계에서 두꺼운 여과지에 쌓인 소변 반점을 시각화하는 데 사용됩니다. 대조적으로, 조명 단계에서는 주변 조명이 상단 카메라가 여과지에 침착된 소변 반점을 감지하지 못하도록 하기 때문에 하단 카메라가 사용됩니다. 이 경우 얇은 여과지가 사용됩니다. 우리는 하단 카메라가 두꺼운 여과지에 침전된 작은 공극 이벤트를 감지하는 데 효과적이지 않다는 것을 발견했습니다.
   2. 여과지 위에 다음 품목을 놓습니다 : 플라스틱 이글루 (수면 공간을 제공함), 농축 용 멸균 1.5mL 마이크로 원심 분리기 튜브, 2 개 또는 3 개의 마우스 건조 차우와 14-16g의 물이 들어있는 60mm x 15mm 플라스틱 접시 젤 팩 (비 습윤수 젤; 그림 2).
      참고: 농축 목적으로 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브를 사용하는 것은 이 연구에 사용된 인클로저에 따라 다릅니다.
   3. 기록 챔버가 준비되면 실험용 마우스를 여과지 위에 부드럽게 내려 놓아 부드럽게 안에 놓습니다. 하우징 케이지에서 기록 케이지로 동물을 옮길 때 최소한의 스트레스로 발생하는지 확인하십시오.
   4. 모든 실험 동물이 뚜껑을 닫은 상태에서 기록 케이지 안에 들어가면 플렉시 유리 뚜껑 표면의 직접적인 주변광 반사를 최소화하기 위해 흡수성 벤치 블루 패드로 뚜껑 상단을 덮습니다.
   5. 하부 챔버의 UV 조명을 켭니다.
      참고: 동물은 자외선과 직접 접촉하지 않습니다. 권장 UV 광선은 재료 섹션에 자세히 설명되어 있습니다.
3. RT-VSA 레코딩
   1. 상단 및 하단 카메라에서 비디오를 녹화하려면 한 번에 여러 웹캠 또는 네트워크 카메라에서 녹화하도록 구성할 수 있는 비디오 감시 녹화 소프트웨어를 사용하십시오.
   2. 프로그램을 열면 프로그램 창에서 Command 와 R 을 눌러 녹음을 시작합니다. 초당 1프레임의 속도로 비디오 녹화를 수행합니다.
   3. 녹음을 시작한 직후 방을 나가 문을 부드럽게 닫습니다. 실험이 진행되는 동안 방이 조용하게 유지되는지 확인합니다.
4. RT-VSA 레코딩 완료
   1. 7시간(밝은 단계 실험) 또는 다음날 아침(어두운 단계 실험) 후에 시술실로 돌아갑니다.
   2. Command와 T를 눌러 녹음을 중지합니다. 자외선을 끕니다.
   3. 녹화를 중지한 후 소프트웨어는 각 카메라에 대한 동영상 파일(.m4v 형식)을 자동으로 생성하고 이전에 선택한 대상 폴더에 카메라 이름으로 저장합니다. 각 카메라 폴더 내에서 실험이 날짜별로 폴더로 구성되어 있는지 확인합니다.
   4. 각 날짜/실험 폴더에 하나의 .m4v 파일과 각 동영상 프레임에 해당하는 모든 개별 .jpeg 파일이 있는지 확인합니다.
   5. 참고 : .jpeg 파일은 동영상 파일이 손상된 경우 실험을 복구하는 데 사용할 수 있습니다.
   6. 바탕 화면에 실험 이름과 날짜가 포함된 폴더를 만들고 모든 .m4v 파일을 이 폴더로 전송합니다. 필요한 경우 동영상 파일이 저장 및 백업된 후 .jpeg 파일을 삭제합니다.
   7. 참고: 밝은 단계 실험의 경우 소프트웨어는 카메라당 하나의 동영상을 생성하고 어두운 단계 실험의 경우 각 카메라에 대해 두 개의 동영상을 생성합니다. 이는 날짜가 변경되는 자정 이후에 새 .m4v 파일이 생성되기 때문입니다.
   8. 외부 컴퓨터에서 분석할 수 있도록 동영상이 포함된 폴더를 플래시 드라이브에 복사합니다. 이 단계는 몇 분 정도 걸릴 수 있으며 3.5.1-3.5.3단계와 병행하여 수행할 수 있습니다.
5. 기록 케이지 청소 및 실험용 마우스를 주거 위치로 다시 이동
   1. 케이지 뚜껑을 덮고 있는 블루패드를 제거합니다. 기록 케이지에서 하우징 케이지로 동물을 옮깁니다.
   2. 녹음실에서 액세서리와 식품(예: 플라스틱 이글루, 플라스틱 튜브, 차우와 워터 젤이 담긴 접시, 여과지)을 제거하고 생물학적 유해 폐기물에 폐기하십시오.
   3. 핸드 진공 청소기를 사용하여 케이지를 청소하고 케이지 바닥에 있는 차우와 배설물 알갱이를 제거합니다. 그런 다음 케이지의 바닥과 내부 벽에 70% 에탄올을 뿌리고 부드러운 천으로 내부를 청소합니다. 케이지의 뚜껑을 열어 공기 건조를 허용하십시오.
   4. 동물과 함께 사육장을 보조 컨테이너에 넣고 동물을 사육 위치로 다시 운반합니다.

4. 검량선 생성

참고: 공극 부위를 소변량으로 전환하려면 보정 곡선이 필요합니다. 하루 중 밝은 단계와 어두운 단계에서 실험을 수행하는 경우 사용되는 각 유형의 여과지(얇고 두꺼운 여과지)에 대해 하나씩 두 개의 보정 곡선을 생성해야 합니다. 검량선은 이중으로 생성됩니다. 각 복제는 RT-VSA 기록 챔버에 배치된 여과지에서 실행됩니다. 복잡한 구성과 UV 흥분성을 감안할 때 마우스 소변을 사용하여 보정 곡선을 만드십시오.

1. 쥐 소변 수집
   1. 유연한 투명 필름 (10cm x 15cm)을 가져 와서 벤치에 놓습니다.
   2. 꼬리로 마우스를 잡고 긁습니다. 배뇨를 유도하기 위해 하복부를 부드럽게 마사지하십시오. 투명 필름 플라스틱 시트의 표면에 소변을 수집합니다.
   3. 새장 안에서 동물을 부드럽게 풀어줍니다. 피펫을 사용하여 투명 필름 표면의 소변을 멸균된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. ~10mL의 마우스 소변이 수집될 때까지 여러 마우스로 절차를 반복하고 소변을 모아 -20°C에서 보관합니다.
      참고: 밝은 단계와 어두운 단계에 대한 중복 보정 곡선을 생성하려면 총 ~10mL의 마우스 소변이 필요합니다. 실험용 마우스에 스트레스를 주지 않으려면 소변 수집을 위해 RT-VSA 실험을 받을 마우스를 사용하지 마십시오.
2. 검량선 기록
   1. 4.1단계에서 수집한 소변을 해동하고 10-15초 동안 부드럽게 볼텍싱하여 혼합합니다.
   2. 얇은 여과지(24.3cm x 36.3cm)를 두 개의 RT-VSA 기록 케이지 각각에 놓습니다.
   3. 각 여과지에 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 및 750의 소변량(μL)을 피펫팅합니다. 확산으로 인한 스폿 겹침을 방지하려면 스폿을 서로 충분한 거리에 할당하십시오.
   4. 케이지의 뚜껑을 닫고 패드로 덮으십시오.
   5. Command 및 R을 누르고 실험을 기록하는 데 사용된 것과 동일한 소프트웨어 매개변수를 적용하여 기록을 시작합니다(3.3단계).
   6. 소변 반점이 최대한 확산될 수 있도록 1시간 동안 보정 곡선을 등록합니다. Command 와 T 를 눌러 녹음을 중지합니다.
   7. 바탕 화면에 새 폴더를 만들고 .m4v 파일을 넣은 다음 후속 분석을 위해 데이터를 플래시 드라이브로 전송합니다.
   8. 유사한 절차를 수행하여 두꺼운 여과지로 중복 곡선을 생성합니다. 이 경우 패드를 추가하여 내부를 어둡게 하고 어두운 위상 조건을 시뮬레이션합니다.
3. 검량선 기록 분석
   1. 동영상 플레이어 소프트웨어에서 .m4v 파일을 열고 창을 최대화하여 화면을 채웁니다. 두꺼운 여과지에서 수행된 검량선을 분석하려면 상단 카메라로 얻은 파일을 사용합니다(그림 3A). 얇은 여과지에서 수행된 검량선을 분석하려면 하단 카메라로 얻은 파일을 사용하십시오(그림 3B).
   2. .m4v 파일을 재생하고 시간 슬라이더를 앞뒤로 움직여 전체 1시간 검량선 동영상의 개요를 볼 수 있습니다.
   3. 더 작은 소변 반점(<25μL)의 강도가 가장 크고 최대로 퍼진 시간 범위를 식별합니다. 이 시간 범위 내에서 스크린샷을 찍습니다. 스크린샷 파일의 이름을 지정하고 .png 파일로 저장합니다(그림 3A, 위쪽 패널).
      참고: 스크린샷은 F6 키를 눌러 촬영합니다. 스크린 샷 획득을 위해 F6을 설정하려면 시스템 환경 설정 > 키보드 > 단축키를 선택하고 화면 사진을 파일로 저장 옵션의 오른쪽에있는 상자에 F6을 씁니다.
   4. 중간 및 큰 소변 반점(>50μL)의 최대 면적을 갖는 시간 범위를 식별하고 스크린샷을 찍습니다. 더 큰 소변 반점이 최대 확산을 나타낼 때까지 작은 소변 반점 중 일부가 보이지 않을 수 있습니다. 파일 이름을 지정하고 스크린샷을 .png 파일로 저장합니다(그림 3A, 아래쪽 패널).
   5. ImageJ 소프트웨어(NIH)를 연 다음 4.3.3단계에서 얻은 .png 파일 아이콘을 끌어다 놓아 이미지 파일을 엽니다(그림 4A).
   6. 도구 모음에서 Polygon Selections 아이콘을 선택하고 필터 용지의 테두리를 그립니다.
   7. 그런 다음 메뉴 모음에서 분석을 선택하고, 확장된 메뉴에서 측정값 설정을 선택하고, 팝업 창에서 영역을 선택합니다. 확인을 클릭합니다. 이를 통해 4.3.8 단계가 수행 될 때 영역 값을 얻을 수 있습니다.
   8. 그런 다음 메뉴 모음에서 분석을 다시 선택하고 확장된 옵션에서 측정을 선택합니다. 픽셀² 의 영역 값을 표시하는 열 영역이 포함된 결과 창이 나타납니다(그림 4B–D).
   9. 도구 모음에서 [자유형 선택] 아이콘을 선택하고 이 아이콘을 사용하여 개별 보이드 스폿의 둘레에 선을 그립니다. 4.3.8단계와 같이 면적을 측정합니다. 소프트웨어는 새로운 측정이 수행될 때 결과 테이블을 업데이트합니다. 새 숫자 집합이 이전 숫자 아래에 나타납니다. 분석된 각 스팟에 대해 결과 창의 열 영역 아래에 나타나는 숫자를 기록합니다(그림 4E–G).
   10. 각 복제 지점에 대해 4.3.5 - 4.3.7단계를 반복합니다.
   11. 여과지의 전체 면적을 100%로 설정하고 각 소변 반점의 면적(% 면적)을 계산합니다. 이 정규화는 카메라의 확대/축소 또는 위치 차이로 인해 발생할 수 있는 오류를 수정합니다.
   12. 그래프 프로그램에서 새 XY 테이블을 만들고 X 열에 소변량(μL) 값을 삽입하고 Y 열에 % 면적의 중복 값을 삽입합니다.
   13. 그런 다음 분석 > 분석 > XY 분석 > 비선형 회귀(곡선 적합)를 선택합니다. 표시되는 매개변수 창에서 Model > Polynomial(다항식) > Second Order Polynomial(2차)을 선택합니다.
   14. 그런 다음 방법(Method) 탭에서 최소 제곱 회귀 분석(Least Squares Regression), 가중치 적용(No Weighting) 및 각 반복실험 Y 값을 개별 점으로 고려(Consider each Replicate y value as an individual point) 선택 항목을 클릭하여 표시합니다.
   15. 구속(contrain) 탭에서 B0, 구속 유형(Constraint Type) > 상수 같음(Constant to equal)을 선택하고 값(Value ) 열 아래에 0을 입력합니다. 확인을 클릭합니다.

5. 실험용 마우스 기록 분석

1. 밝은 단계(아래쪽 카메라) 또는 어두운 단계(위쪽 카메라) 동안 수집된 동영상 파일을 열어 분석합니다.
2. 타임 스크롤러를 앞뒤로 움직여 동영상 파일의 품질을 평가하고, 분석할 6시간 동안 여과지가 손상되지 않는지(찢어지거나 씹히지 않음) 유지되는지 확인합니다. 종이가 찢어진 경우 마우스가 정량화할 수 없는 노출된 플라스틱에 소변을 보았을 수 있으므로 추가 분석을 수행하지 마십시오(그림 5).
3. 밝은 단계 또는 어두운 단계에서 수집된 실험을 분석하려면 빨리 감기 명령 또는 시간 표시줄 슬라이더를 사용하여 원하는 시간 창으로 이동합니다. 밝은 단계 동안의 배뇨 활동은 오전 11:00에서 오후 05:00 사이(ZT = 4.0–10.0)와 자정에서 오전 06:00 사이(ZT = 17.0–23.0) 어두운 단계에서 기록됩니다.
4. >> 아이콘을 클릭하거나 동영상을 수동으로 스크롤하여 빨리 감기 모드에서 동영상을 재생하고 마우스가 보이지 않는다는 증거를 찾습니다. 이것이 발생하고 있음을 알 수있는 가장 쉬운 방법은 여과지에 소변의 밝은 반점이 갑자기 나타나는 것을 찾는 것입니다. 또 다른 지표는 케이지 모서리로의 움직임과 마우스가 배뇨 중일 때 잠시 동안 활동하지 않는 것을 포함한 행동 변화를 찾는 것입니다.
   알림: 보이드를 더 잘 감지할수록 스크롤 또는 빨리 감기 속도를 높일 수 있습니다. 그러나, 박테리아 및 화학적으로 유도된 방광염을 가진 마우스의 경우, 매우 많은 수의 작은 공극을 가지고 있다 ^4,34, 영화를 너무 빨리 움직이면 배뇨 사건을 놓칠 수 있다.
5. 각 보이드가 발생하는 시간을 등록합니다. 관례에 따라 배뇨 시간은 소변이 감지되는 첫 번째 징후에 기록됩니다(그림 6A, B).
6. 공극을 측정하려면 먼저 스크롤 막대를 사용하여 시간을 앞(또는 뒤로)하여 소변 반점의 최대 확산이 발생한 시점을 찾습니다. 이 시점에서 동영상을 일시 중지하고 4.3.3 단계에서 설명한대로 스크린 샷을 찍습니다. 컴퓨터 마우스 화살표를 분석 중인 지점에 놓아 관심 지점이 스크린샷에 표시되도록 합니다(그림 6C,D).
7. 동영상의 출현 순서를 설명하기 위해 상관 번호를 사용하여 스크린샷 파일의 이름을 지정합니다.
8. 동영상의 각 빈 자리에 대해 5.5단계와 5.7단계를 반복하여 파일을 계속 분석합니다. 모든 보이드 스폿이 분석되면 스크린샷을 캡처하고 4.3.6에 설명된 단계를 사용하여 여과지의 전체 면적을 측정합니다.
9. 4.3.9 단계에서 설명한대로 각 소변 반점의 % 면적을 계산하십시오. 4단계에서 생성된 보정 곡선과 그래프 소프트웨어의 보간 기능을 사용하여 각 공극 지점에 대해 % 면적 값을 소변 부피(μL)로 변환합니다.
   1. 그래프 작성 소프트웨어에서 검량선의 데이터가 포함된 XY 테이블을 열고 검량선의 마지막 값 아래 Y 열에 % 면적 값을 삽입합니다(그림 7A).
   2. 결과 테이블(Table of Results) 탭을 클릭하고 모델(model) 탭에서 표준 커브(Standard Curve)에서 알 수 없는 항목 보간(Interpolate Unknowns from Standard Curve)을 클릭하여 선택한 다음 확인(OK)을 누릅니다. 보간된 X 평균 값이라는 탭이 결과 테이블 탭 옆에 나타납니다. 이 탭에는 각 공극 지점에 대한 소변량(μL)에 해당하는 보간된 값이 있는 표가 포함되어 있습니다. (그림 7A, B).
10. 5.1단계부터 5.9단계까지 반복하여 모든 실험용 마우스를 분석합니다.
11. 마우스당 하나의 스프레드시트를 사용하여 5.5단계부터 5.10단계까지 가져온 데이터가 포함된 통합 문서 파일을 만듭니다(그림 7C). 밝은 단계 실험에 대해 하나의 파일을 만들고 어두운 단계에 대해 다른 파일을 만듭니다. 이 마스터 파일에는 추가 분석에 사용되는 모든 원시 데이터와 필요한 계산이 포함되어 있습니다.

6. 실험용 마우스의 배뇨 패턴 분석

1. 1차 및 2차 보이드 스폿 프로파일을 생성합니다(그림 8A, B 및 그림 9).
   참고: 주파수 분포 연구 23에 따르면 ≥20μL인 공극 반점은 일반적으로 총 공극 부피의 >95%를 나타내며 1차 공극 반점(PVS)^으로 간주됩니다^8,23,35. ≤20μL인 공극 반점은 2차 또는 작은 공극 반점(SVS)으로 간주됩니다. PVS와 SVS 사이의 차별은 배뇨 표현형을 특성화하는 데 유용한 접근 방식인 것으로 나타났습니다. SVS의 수가 증가하면 배뇨 기능 장애를 나타냅니다³⁵.
   1. 관심 있는 보이드 스팟 데이터(밝은 위상 또는 어두운 위상)가 포함된 마스터 파일에서 부피를 기준으로 스폿을 ≥20μL인 PVS로, 부피가 <20μL인 SVS로 분류합니다.
   2. 숫자를 세고 PVS의 평균 보이드 볼륨과 총 볼륨을 계산합니다. 숫자를 세고 SVS의 총 볼륨을 계산합니다.
   3. 계산된 각 파라미터(PVS 수, PVS 공극 부피, PVS 총 부피, SVS 수, SVS 총 부피)에 대해 대조군을 처리된 마우스와 비교하는 그래프 막대를 생성합니다.
2. 선택 사항: 시간 경과에 따른 보이드 동작을 표시하기 위해 누적 보이드 볼륨 플롯(계단 함수)을 생성합니다(그림 10 및 그림 11).
   1. 통합 문서 마스터 파일을 열고 시, 분, 초로 표시되는 무효화 시간을 10진수 형식으로 변환합니다. 각 시점에 대한 누적 소변량(μL)을 계산합니다.
   2. 그래프 작성 소프트웨어에서 X 열에 십진수 형식의 시간, Y 열에 누적 소변량이 있는 XY 테이블을 생성합니다. 시간 및 소변량 데이터를 표에 복사합니다. (0, 0) 및 (6, 최대값) 데이터 요소를 추가합니다. 이 점은 배뇨 부피가 0 (0; 0) 일 때 실험 시작 (시간 : 0 h)과 배뇨 된 소변의 누적 값이 마지막 배뇨 이벤트 (6, 최대 값)에 대해 얻은 값과 같을 때 실험 종료 (시간 : 6 h)에 플롯의 수평선을 완성하는 데 필요합니다.
   3. 그래프를 두 번 클릭하십시오. 그래프 서식 창이 나타납니다. 모양새(Appearance ) 탭을 선택하고 기호 보기(Show Symbols ) 버튼을 클릭하여 선택 취소한 다음 연결선/곡선 표시(Show Connecting Line/Curve)를 클릭하여 선택합니다. 스타일 옵션을 클릭하고 생존을 선택합니다.

결과

요로상피 Piezo1/2 녹아웃 마우스의 배뇨 행동

배뇨 주기의 저장 단계에서 요로상피는 방광에 축적된 소변에 의해 가해지는 긴장을 감지하고 이 기계적 자극을 장막 ATP 방출 ^1,3과 같은 세포 반응으로 변환한다는 가설이 있습니다. 우리는 이전에 기계적으로 활성화 된 PIEZO1 및 PIEZO2 채널이 마우스 요로 상피

토론

비디오 모니터링의 통합은 기존 VSA에 비해 몇 가지 이점을 제공하는 비용 효율적인 수정입니다. 일반적으로 종말점 분석으로 사용되는 기존 VSA에서는 겹치는 공극 지점을 구별하기가 어렵습니다. 마우스는 일반적으로 케이지 모서리에서 몇 시간 동안 분석이 연장될 때 같은 영역에서 여러 번 소변을 보는 경향이 있기 때문에 이것은 사소한 문제가 아닙니다. 따라서, RT-VSA의 첫 번째 이점은 조사?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches	80/20	1010	Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches	80/20	1010	Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches	80/20	1010	Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches	80/20	1010	Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches	80/20	1010	Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut	80/20	3280	Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut	80/20	3287	Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support	80/20	14061	Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate	80/20	4118	Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate	80/20	4081	Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate	80/20	4080	Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate	80/20	4140	Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly	80/20	2064	Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket	80/20	4509	Amount: 6
24”-long UV tube lights	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)	Thermo Fisher Scientific	57144
Cosmos blotting paper (thick paper)	Blick Art Materials	10422-1005
Excel	Microsoft Corporation
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 9.4.0	graphing and statistics software
ImageJ FIJI	NIH
Parafilm	Merck		transparent film
Quick Time Player 10.5 software	Apple		multimedia player
Security spy	Ben software		video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20	80/20	3381	Amount: 80
UV transmitting acrylic	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm
Water gel: HydroGel	ClearH2O	70-01-5022	(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam	Logitech	C930e	Amount: 4