실시간 보이드 스팟 어세이

요약

이 기사에서는 기존의 공극 스팟 분석에 비디오 모니터링을 통합하여 마우스 배뇨 거동을 연구하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 보이드 이벤트에 대한 시간적, 공간적, 체적 정보와 낮의 밝고 어두운 단계 동안 마우스 동작의 세부 정보를 제공합니다.

초록

정상적인 배뇨 행동은 신경계의 적절한 제어 하에 방광, 요도 및 요도 괄약근의 조정된 기능의 결과입니다. 마우스 모델에서 자발적인 배뇨 행동을 연구하기 위해 연구자들은 동물 케이지 바닥을 감싸는 여과지에 퇴적된 소변 반점의 수와 면적을 측정하는 방법인 공극 반점 분석(VSA)을 개발했습니다. 기술적으로 간단하고 저렴하지만 이 분석은 배뇨 사건의 시간적 분해능 부족과 겹치는 소변 반점을 정량화하는 데 어려움을 포함하여 종말점 분석으로 사용할 때 한계가 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 실시간 VSA(RT-VSA)라고 하는 비디오 모니터링 VSA를 개발했으며, 이를 통해 보이드 주파수를 결정하고, 보이드 볼륨 및 보이드 패턴을 평가하고, 낮의 어두운 단계와 밝은 단계 모두에서 6시간 동안 측정할 수 있습니다. 이 보고서에 설명된 방법은 건강 및 질병 상태에서 자발적인 배뇨의 생리학적 및 신경행동적 측면을 탐구하는 다양한 마우스 기반 연구에 적용할 수 있습니다.

서문

소변 저장과 배뇨는 골반 및 하복부 신경을 통해 방광 충전 상태에 대한 정보를 수신하는 중추 회로(중추 신경계)에 의해 조정됩니다. 신장 골반에서 근위 요도까지 요로를 둘러싸고 있는 상피인 요로상피는 소변에 존재하는 대사 노폐물과 병원체에 대한 단단한 장벽을 형성합니다. 이것은 방광의 충전 상태를 감지하고 기저 조직과 구심성 신경에 전달하는 감각 웹의 필수 구성 요소입니다 ^1,2. 요로상피막의 파괴 또는 요로상피기계 전달 경로의 변화는 빈뇨, 절박뇨, 야뇨증, 요실금과 같은 하부 요로 증상과 함께 배뇨 기능 장애를 유발할 수 있다 3,4,5,6,7. 마찬가지로, 노화, 당뇨병, 하부 요로 감염, 간질성 방광염, 및 방광 또는 그 기능을 조절하는 관련 회로에 영향을 미치는 다른 질병 과정은 방광 기능 장애를 유발하는 것으로 알려져 있다 8,9,10,11,12,....

프로토콜

Urothelial Piezo1/2 이중 녹아웃 마우스(Pz1/2-KO , 유전자형: Piezo1 fl^/fl; 피에조2 fl^/fl; Upk2^CRE+/-) 및 대조군(Pz1/2-C, 유전자형: Piezo1 fl^/fl; 피에조2 fl^/fl; Upk2^CRE-/-)는 Jax 실험실에서 얻은 부모 균주(Piezo1 fl^/fl 균주 #029213; Piezo2 fl^/fl 균주 # 027720; Upk2^CRE+/- 균주 # 029281). 암컷 (1.5-3 개월, 체중 17-20g)과 수컷 (2-4 개월, 체중 23-29g) 마우스를 실험에 사용했다. 시클로포스파미드 유발 방광염 실험을 위해 야생형 C57Bl/6J 암컷(생후 3개월, 체중 ~20g)을 사용했습니다(Jackson laboratories, 균주 #000664). 동물을 수용하고 실험은 피츠버그 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인 하에 피츠버그 대학 동물 보호 시설에서 수행되었습니다. 모든 동물 실험은 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정....

결과

요로상피 Piezo1/2 녹아웃 마우스의 배뇨 행동

배뇨 주기의 저장 단계에서 요로상피는 방광에 축적된 소변에 의해 가해지는 긴장을 감지하고 이 기계적 자극을 장막 ATP 방출 ^1,3과 같은 세포 반응으로 변환한다는 가설이 있습니다. 우리는 이전에 기계적으로 활성화 된 PIEZO1 및 PIEZO2 채널이 마우스 요로 상피

토론

비디오 모니터링의 통합은 기존 VSA에 비해 몇 가지 이점을 제공하는 비용 효율적인 수정입니다. 일반적으로 종말점 분석으로 사용되는 기존 VSA에서는 겹치는 공극 지점을 구별하기가 어렵습니다. 마우스는 일반적으로 케이지 모서리에서 몇 시간 동안 분석이 연장될 때 같은 영역에서 여러 번 소변을 보는 경향이 있기 때문에 이것은 사소한 문제가 아닙니다. 따라서, RT-VSA의 첫 번째 이점은 조사?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches	80/20	1010	Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches	80/20	1010	Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches	80/20	1010	Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches	80/20	1010	Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches	80/20	1010	Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut	80/20	3280	Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut	80/20	3287	Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support	80/20	14061	Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate	80/20	4118	Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate	80/20	4081	Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate	80/20	4080	Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate	80/20	4140	Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly	80/20	2064	Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket	80/20	4509	Amount: 6
24”-long UV tube lights	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
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AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)	Thermo Fisher Scientific	57144
Cosmos blotting paper (thick paper)	Blick Art Materials	10422-1005
Excel	Microsoft Corporation
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 9.4.0	graphing and statistics software
ImageJ FIJI	NIH
Parafilm	Merck		transparent film
Quick Time Player 10.5 software	Apple		multimedia player
Security spy	Ben software		video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20	80/20	3381	Amount: 80
UV transmitting acrylic	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm
Water gel: HydroGel	ClearH2O	70-01-5022	(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam	Logitech	C930e	Amount: 4