Gerçek Zamanlı Boşluk Noktası Testi

Özet

Bu makalede, geleneksel boşluk noktası testine video izlemeyi dahil ederek fare işeme davranışını incelemek için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, günün aydınlık ve karanlık evrelerinde işeme olayları ve fare davranışının ayrıntıları hakkında zamansal, uzamsal ve hacimsel bilgiler sağlar.

Özet

Normal işeme davranışı, sinir sisteminin uygun kontrolü altında mesane, üretra ve üretral sfinkterlerin koordineli fonksiyonunun sonucudur. Fare modellerinde gönüllü işeme davranışını incelemek için araştırmacılar, bir hayvanın kafesinin zeminini kaplayan bir filtre kağıdı üzerinde biriken idrar lekelerinin sayısını ve alanını ölçen bir yöntem olan boşluk noktası testini (VSA) geliştirdiler. Teknik olarak basit ve ucuz olmasına rağmen, bu tahlil, işeme olaylarının zamansal çözünürlüğünün olmaması ve örtüşen idrar noktalarının ölçülmesinde zorluklar da dahil olmak üzere bir son nokta testi olarak kullanıldığında sınırlamalara sahiptir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, gerçek zamanlı VSA (RT-VSA) olarak adlandırdığımız ve işeme frekansını belirlememize, işeme hacmini ve işeme modellerini değerlendirmemize ve günün hem karanlık hem de aydınlık fazlarında 6 saatlik zaman aralıklarında ölçümler yapmamıza olanak tanıyan video izlemeli bir VSA geliştirdik. Bu raporda açıklanan yöntem, sağlık ve hastalık durumlarında gönüllü işitmenin fizyolojik ve nörodavranışsal yönlerini araştıran çok çeşitli fare tabanlı çalışmalara uygulanabilir.

Giriş

İdrar depolanması ve işlenmesi, pelvik ve hipogastrik sinirler aracılığıyla mesane dolum durumu hakkında bilgi alan merkezi bir devre (merkezi sinir sistemi) tarafından koordine edilir. Ürotel, idrar yolunu renal pelvisten proksimal üretraya kadar kaplayan epitel, idrarda bulunan metabolik atık ürünlere ve patojenlere sıkı bir bariyer oluşturur. Mesanenin doldurma durumunu algılayan ve altta yatan dokulara ve afferent sinirlere ileten duyusal bir ağın ayrılmaz bir bileşenidir ^1,2. Ürotelyal bariyerin bozulması veya ürotelyal mekanotransdüksiyon yollarındaki değişiklikler, frekans, aciliyet, noktüri ve inkontinans gibi alt üriner sistem semptomları ile birlikte işeme disfonksiyonuna yol açabilir 3,4,5,6,7. Aynı şekilde, yaşlanma, diyabet, alt idrar yolu enfeksiyonları, interstisyel sistit ve idrar kesesini etkileyen diğer hastalık süreçlerinin veya işlevini kontrol eden ilişkili devrelerin mesane disfonksiyonuna neden olduğu bilinmektedir 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17^{, 18,19}. Normal ve anormal işeme davranışının daha iyi anlaşılması, farklı idrara çıkma modelleri arasında güvenilir bir şekilde ayrım yapabilen yöntemlerin geliştirilmesine bağlıdır.

Geleneksel olarak, farelerin gönüllü işeme davranışı, Desjardins ve meslektaşları²⁰ tarafından geliştirilen ve basitliği, düşük maliyeti ve invaziv olmayan yaklaşımı nedeniyle geniş çapta benimsenen boşluk noktası testi (VSA) kullanılarak incelenmiştir ^{8,21,22,23,24}. Bu tahlil tipik olarak, bir farenin bir filtre kağıdı ile kaplı bir kafeste belirli bir süre harcadığı, daha sonra filtre kağıdı ultraviyole (UV) ışığı altında yerleştirildiğinde (bu koşullar altında idrar lekeleri floresan) sayıyı sayarak ve idrar lekelerinin boyutunu değerlendirerek analiz edilen bir son nokta testi olarak ^{gerçekleştirilir20}. Bu birçok avantaja rağmen, geleneksel VSA bazı önemli sınırlamalar sunmaktadır. Fareler genellikle aynı bölgelerde idrara çıktıklarından, araştırmacılar tahlilin süresini nispeten kısa bir süre (≤4 saat)²⁵ ile sınırlamak zorundadır. VSA daha kısa zaman dilimlerinde gerçekleştirilse bile, büyük boşluk noktalarının üzerine düşen küçük boşluk noktalarını (SVS'ler) çözmek veya SVS'leri kuyruklara veya pençelere yapışmış idrarın taşınmasından ayırt etmek neredeyse imkansızdır. SVS'lerin sık fakat bireysel işeme olaylarının (sistit ^4,26'ya yanıt olarak sıklıkla gözlenen bir fenotip) veya miktürasyon sonrası damlama (mesane çıkış tıkanıklığı ²⁷ ile ilişkili bir fenotip) nedeniyle olup olmadığını ayırt etmek de çok zordur. Ayrıca, çalışma saatleri içinde tahlili tamamlama arzusu, ışıklar kapatıldığında konut tesislerine erişimdeki zorluklarla birleştiğinde, bu tahlilleri genellikle 24 saatlik sirkadiyen döngünün ışık periyoduyla sınırlar. Bu nedenle, bu zaman kısıtlamaları, aktif gece evrelerinde fare işeme davranışının değerlendirilmesini önler ve sirkadiyen ritimler tarafından yönetilen belirli genleri veya tedavileri analiz etme yeteneğini azaltır.

Bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmek için, araştırmacılar işeme davranışını gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için alternatif yöntemler geliştirdiler 26,28,29,30,31,32. Bu yaklaşımlardan bazıları, metabolik kafesler^26,28,29 veya termal kameraların kullanımı³⁰ gibi pahalı ekipmanların kullanımını içerir; ancak, bunların da sınırlamaları vardır. Örneğin, metabolik kafeslerde, idrar ağ tabanının tellerine ve huninin duvarlarına yapışma eğilimindedir, bu da toplanan ve ölçülen idrar miktarını azaltır. Bu nedenle, küçük boşluklar hakkında doğru bir şekilde veri toplamak zor olabilir. Dahası, metabolik kafesler işeme olaylarının mekansal dağılımı hakkında bilgi vermez (yani, köşelerde idrara çıkma ve odanın merkezi). Termografik kameralar tarafından kullanılan uzun dalga boylu kızılötesi radyasyonun katılara nüfuz etmediği göz önüne alındığında, video termografisi ile değerlendirilen işeme aktivitesi, havada birkaç inç zıplayabilecekleri için aktif farelerle zor olabilecek açık bir sistemde gerçekleştirilmelidir. Diğer bir sistem ise, bir fare kafesinin tel örgü tabanının altında sabit bir hızda sarılan haddelenmiş filtre kağıdından oluşan otomatik boşluklu kağıt lekesi (aVSOP) yaklaşım^33'tür. Bu yaklaşım, kağıt hasarını ve klasik VSA'da meydana gelen idrar lekelerinin üst üste binmesini önler ve uygulanması, araştırmacının birkaç gün boyunca deneyler yapmasına izin verir. Bununla birlikte, araştırmacıya işeme olaylarının kesin zamanlamasını sağlamaz ve davranışı ve lekelenme ile nasıl ilişkili olduğunu inceleme yeteneği yoktur. Bu bilgiyi elde etmek için araştırmacılar, fare aktivitesinin ve idrara çıkma olaylarının eşzamanlı olarak değerlendirilmesine izin veren bir yaklaşım olan işeme tahlillerine video izlemeyi dahil etmişlerdir^31,32. Bir yaklaşım, işeme olaylarını görselleştirmek için deneysel kafesin altına mavi ışık yayan bir diyot (LED) ve yeşil floresan protein filtreli bir video kamera ve fare pozisyonu^32'yi yakalamak için kafesin üzerine bir kızılötesi LED ve bir video kamera yerleştirmekten oluşur. Bu kurulum, fiber fotometri yaparken işeme davranışını izlemek için kullanılmıştır; Bununla birlikte, bu sistemin parlak aydınlatılmış ortamı, araştırmacıların işemeyi uyarmak için farelerini bir diüretik ajanla tedavi etmelerini gerektirdi. Başka bir deneysel tasarımda, sırasıyla fare motor aktivitesini ve idrara çıkma olaylarını görselleştirmek için deney kafesinin üstüne ve altına geniş açılı kameralar yerleştirildi. Bu durumda, kafesin zeminini kaplayan bir filtre kağıdı üzerinde biriken idrar lekeleri, filtre kağıdının kafes^31'in altına yerleştirilen UV ışıkları ile aydınlatılmasıyla ortaya çıkarılmıştır. Bu kurulum, gönüllü işeme davranışında yer alan beyin sapı nöronlarını incelemek için günün ışık fazı sırasında, 4 dakikalık kısa tahlillerde kullanıldı³¹. Bu sistemin karanlık fazda veya >4 dakikalık sürelerde kullanımına uygunluğu bildirilmemiştir.

Bu makalede, fare işeme davranışının uzun süreli video izlemesine izin vererek geleneksel VSA'yı geliştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu uygun maliyetli yaklaşım, fare davranışıyla ilgili ayrıntıların yanı sıra günün aydınlık ve karanlık evrelerinde uzun süreler boyunca işeme olayları hakkında zamansal, uzamsal ve hacimsel bilgiler sağlar ^3,4,34. İşeme odalarının yapımı, gerçek zamanlı bir VSA (RT-VSA) uygulaması ve verilerin analizi için ayrıntılı bilgi verilmektedir. RT-VSA, üriner sistemin işlevini kontrol eden fizyolojik mekanizmaları anlamak, işitmeyi kontrol etmek için farmakolojik yaklaşımlar geliştirmek ve alt üriner sistemi etkileyen hastalık süreçlerinin moleküler temelini tanımlamak isteyen araştırmacılar için değerlidir.

Protokol

Urothelial Piezo1/2 çift nakavt fareleri (Pz1/2-KO , genotip: Piezo1 fl^/fl; Piezo2^{fl / fl}; Upk2^CRE+/-) ve kontrolleri (Pz1/2-C, genotip: Piezo1 fl^/fl; Piezo2^{fl / fl}; Upk2^CRE-/-), Jax laboratuvarlarından elde edilen ebeveyn suşlarından (Piezo1 fl^{/ fl} suşu # 029213; Piezo2^{fl / fl} suşu # 027720; Upk2^CRE+/- suş # 029281). Deneylerde hem dişi (1.5-3 aylık ve 17-20 g ağırlığında) hem de erkek (2-4 aylık ve 23-29 g ağırlığında) fareler kullanıldı. Siklofosfit kaynaklı sistit deneyleri için, vahşi tip C57Bl / 6J dişiler (3 aylık ve ~ 20 g ağırlığında) kullanılmıştır (Jackson laboratuvarları, suş # 000664). Hayvanlar barındırıldı ve deneyler, Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayı altında Pittsburgh Üniversitesi Hayvan Bakım Tesisi'nde gerçekleştirildi. Tüm hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının İnsancıl Bakımı ve Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmeti Politikası ve Hayvan Refahı Yasası'nın ilgili kılavuz ilkelerine ve düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Gerçek zamanlı boşluk noktası analizi için kafeslerin montajı (RT-VSA)

1. RT-VSA sondaj makinesi, günün ışık fazında işeme aktivitesini kaydetmek için kullanılan iki UV ampul ve iki geniş açılı kamera (alt kameralar) tutan bir UV standından oluşur. Standın üzerinde duracak iki fare odası düzenleyin. Her fare odasının kapağına, günün karanlık evresinde işeme aktivitesini kaydetmek için kullanılan geniş açılı kameralar (üst kameralar) takın (Şekil 1A).
2. UV standının ve fare odalarının çerçevesini T oluklu alüminyum profillerde 1 inç x 1'den oluşturun. İki fare haznesi ve UV standı oluşturmak için kullanılan bileşenlerin listesi için Tablo 1'e ve monte edilmiş bileşenlerin ve boyutların farklı görünümleri için Şekil 1B-D'ye bakın.
3. Her fare haznesini, 10 inç'e kadar kesilmiş sekiz T oluklu alüminyum profille ve dördü 14,75 inç'e kadar kesilmiş olacak şekilde oluşturun. Fare haznesinin tabanını monte ederek başlayın ve Şekil 1'e göre T-oluklu profilleri monte etmek için standart uç bağlantı elemanlarını (Tablo 1) kullanın. Fare odalarının zeminini oluşturmak için profillerin iç kanalına 38,5 cm x 26,5 cm UV ileten akriliği monte edin.
   NOT: T-oluklu profillerin standart uç bağlantı elemanları ile nasıl monte edileceği hakkında ayrıntılı bilgi için, şirketin web sayfasını ziyaret edin.
4. Fare odasının duvarlarını profillerin geri kalanıyla birlikte inşa edin. 38,5 cm x 21,5 cm ve 26,5 cm x 21,5 cm aşınmaya dayanıklı (AR) polikarbonat panelleri fare haznesinin dış duvarlarını monte etmek için profillere monte edin. Fare haznesinin içini oluşturmak için 37,5 cm x 23,9 cm ve 24,4 cm x 23,9 cm AR polikarbonat panelleri kullanın.
5. AR polikarbonat panelleri standart uç bağlantı elemanı 1/4-20 sırt ile sabitleyin. Panellerin web sayfasındaki profillere nasıl monte edileceğine ilişkin talimatlara adım 1.3'ün NOTU'nda bakın. İç paneller arasındaki bağlantıları kapatmak için ticari silikon kazan kullanın.
6. Kafesin kapağını Şekil 1B'de gösterildiği gibi monte etmek için T-oluklu profillerde iki adet 12 inç ve iki adet 14,75 kullanın. Kapağı tamamlamak için profillerin iç kanalına 38,5 cm x 26,5 cm AR polikarbonat panel monte edin.
7. 12 kamera profili desteğini kafesin üst kısmındaki uzun eksenlere dik olarak monte edin ve köşe braketlerinin içinde iki hafif geçişle sabitleyin (Şekil 1B'de 3 olarak işaretlenmiştir). Web kamerası montaj desteği olarak düz düz bir plaka (2 işaretli) kullanın ve Şekil 1B'de gösterildiği gibi monte edin. Fotoğraf makinesini kamera montaj vidasıyla desteğe takın.
8. Kapağı fare haznesinin gövdesine takmak için 10 serisi standart kaldırma menteşesi sağ tertibatını kullanın (Şekil1 B'de 1 olarak işaretlenmiştir).
9. UV standını, Şekil 1C,D'ye göre, 40 inç'e kadar kesilmiş dört T-oluklu profil, 32 inç'e kesilmiş dört T-oluklu profil ve 10 inç'e kesilmiş dört T-oluklu profil ile inşa edin. UV haznesinin tabanını oluşturmak için profillere 82,5 cm x 26,5 cm akrilik ayna tabakası monte edin.
10. UV standının duvarını oluşturmak için 82,5 cm x 30,5 cm ve 26,5 cm x 30,5 cm akrilik ayna tabakasını kullanın.
11. UV standını sabitlemek için 10 serisi beş delikli T düz plakaları (Şekil 1 C'de 2 olarak işaretlenmiş), 10 serisi beş delikli L düz plakaları (Şekil 1 C'de 3 olarak işaretlenmiş) ve 10 serisi beş delikli tişört düz plakalarını (Şekil 1 C'de 1 olarak işaretlenmiş) takın.
12. Alt kameraları 32 inçe kadar kesilmiş T oluklu bir profile monte edin ve Şekil 1D'de gösterildiği gibi iki hafif geçiş köşe braketi ile standın altına yapıştırın. Web kameralarını T oluklu profile bağlamak için düz düz plakalar kullanın.
13. UV lambalarını iç, ön ve arka profillere monte edin ve Şekil 1D'de gösterildiği gibi düz düz plakalara takın.
14. Dört web kamerasını bir video gözetim yazılımı çalıştıran bir bilgisayarın USB bağlantı noktalarına bağlayın.

2. Deneyden önce hayvan barınağı

1. Amaca yönelik olarak yetiştirilen veya harici bir bölgeden elde edilen ev deney fareleri, dörderli gruplar halinde. Mümkün olduğunda, bu deneyler için yaşa uygun dişi veya erkek fareler kullanın. Hayvanlar harici bir kaynaktan elde edilirse, herhangi bir deneysel prosedür uygulamadan önce en az 7 gün boyunca iklimlendirmelerine izin verin.
2. Hayvan tesisinde geçirdikleri süre boyunca, hayvanları yatak takımları ve zenginleştirme (örneğin, plastik iglo, tekerlek, parçalama için kağıt parçası) içeren standart kafeslerde barındırın ve suya ve kuru fare chow ad libitum'a erişimi olan 12 saatlik bir gündüz / gece döngüsü altında tutun.

3. Günün aydınlık ve karanlık aşamalarında RT-VSA kayıtları

NOT: Aşağıdaki protokolde, günün aydınlık ve karanlık aşamalarında fare işeme davranışını değerlendirmek için RT-VSA'nın kullanımı açıklanmaktadır. Hayvanlar, Zeitgeber zamanı (ZT) = 0 saat 07: 00'de 12 saat ışık ve 12 saat karanlık döngüde tutulur. Kayıtlar, ışık fazı deneyleri için 10:30 ile 11:00 (ZT = 3.5–4.0) arasında ve karanlık faz deneyleri için 18:00-18:30 (ZT = 11.0–11.5) arasında başlar. Hayvanlar her iki koşulda da test edildiğinde, deneyler tipik olarak açık ve koyu testler arasında en az 5 ardışık gün olmak üzere iki ayrı günde gerçekleştirilir. Deneyler, hayvan odalarının temizlendiği veya kafeslerin değiştirildiği günlerde yapılmamalıdır, çünkü bunlar işeme davranışını etkileyen streslere neden olabilir. Tüm adımlar, fareler için minimum stres koşulları altında gerçekleştirilmelidir.

1. Deney hayvanlarını barındıkları yerden RT-VSA kayıt odalarının bulunduğu prosedür odasına taşıyın.
2. RT-VSA kayıt odası hazırlama
   1. Her RT-VSA kayıt kafesinin altına bir parça filtre kağıdı (24,3 cm x 36,3 cm) yerleştirin. Günün saatine bağlı olarak, ince (ışık fazı deneyleri) veya kalın (karanlık faz deneyleri) filtre kağıdı kullanın.
      NOT: Kalın filtre kağıdı, ince filtre kağıdından daha parçalanmaya karşı daha dirençli olduğu için aktif karanlık fazda kullanılır. En iyi kameralar, karanlık fazda kalın filtre kağıdı üzerinde biriken idrar lekelerini görselleştirmek için kullanılır. Buna karşılık, ışık fazı sırasında, alt kameralar kullanılır, çünkü ortam ışığı, üst kameraların filtre kağıdında biriken idrar noktalarını algılamasını önler. Bu durumda, ince filtre kağıdı kullanılır. Alt kameraların, kalın filtre kağıdı üzerinde biriken küçük işeme olaylarını tespit etmede etkisiz olduğunu bulduk.
   2. Filtre kağıdının üzerine, aşağıdaki öğeleri yerleştirin: plastik bir iglo (uyku alanı sağlayan), zenginleştirme amaçlı steril bir 1,5 mL mikro santrifüj tüpü ve iki veya üç parça fare kuru çorbası ve jel paketi şeklinde 14-16 g su içeren 60 mm x 15 mm'lik plastik bir tabak (ıslanmayan su jeli; Şekil 2).
      NOT: Zenginleştirme amacıyla 1,5 mL mikro santrifüj tüplerinin kullanımı, bu çalışmada kullanılan muhafazaya özgüdür.
   3. Kayıt odaları hazır olduğunda, deney farelerini yavaşça filtre kağıdına yerleştirerek içine yerleştirin. Hayvanların barınak kafesinden kayıt kafeslerine transferinin minimum stresle gerçekleştiğinden emin olun.
   4. Tüm deney hayvanları, kapakları kapalıyken kayıt kafeslerine girdikten sonra, pleksiglas kapak yüzeyindeki doğrudan ortam ışığı yansımalarını en aza indirmek için kapakların üstünü emici bir tezgah bluepad ile örtün.
   5. Alt odadaki UV ışıklarını açın.
      NOT: Hayvanların UV ışığı ile doğrudan teması yoktur. Önerilen UV ışığı malzemeler bölümünde detaylandırılmıştır.
3. RT-VSA kayıtları
   1. Üst ve alt kameralardan video kaydetmek için, aynı anda birden fazla web kamerasından veya ağa bağlı kameradan kayıt yapmak üzere yapılandırılabilen bir video gözetim kayıt yazılımı kullanın.
   2. Programı açtıktan sonra, program penceresinde Command ve R tuşlarına basarak kaydı başlatın. Video kayıtlarını s başına 1 kare hızında gerçekleştirin.
   3. Kayıtları başlattıktan hemen sonra, kapıyı yavaşça kapatarak odadan çıkın. Deneyin tüm süresi boyunca odanın sessiz kaldığından emin olun.
4. RT-VSA kayıtlarını tamamlama
   1. 7 saat sonra (ışık fazı deneyleri) veya ertesi sabah (karanlık faz deneyleri) prosedür odasına dönün.
   2. Command ve T tuşlarına basarak kayıtları durdurun. UV ışıklarını kapatın.
   3. Kaydı durdurduktan sonra, yazılım her kamera için otomatik olarak bir film dosyası (.m4v formatında) oluşturur ve daha önce seçilen bir hedef klasörde kameranın adı altında kaydeder. Her kamera klasöründe, deneylerin tarihe göre klasörler halinde düzenlendiğini doğrulayın.
   4. Her tarih/deneme klasöründe, bir .m4v dosyası ve film karelerinin her birine karşılık gelen tüm ayrı ayrı .jpeg dosyaları olduğunu doğrulayın.
   5. NOT: .jpeg dosyaları, film dosyalarının bozulması durumunda denemeyi kurtarmak için kullanılabilir.
   6. Masaüstünde denemenin adını ve tarihini içeren bir klasör oluşturun ve .m4v tüm dosyaları bu klasöre aktarın. Gerekirse, film dosyaları kaydedilip yedeklendikten sonra .jpeg dosyaları silin.
   7. NOT: Işık fazı deneyleri için, yazılım kamera başına bir film üretirken, karanlık faz deneyleri için her kamera için iki film üretecektir. Bunun nedeni, tarih değiştiğinde gece yarısından sonra yeni bir .m4v dosyası oluşturulmasıdır.
   8. Filmleri içeren klasörü harici bir bilgisayarda analiz etmek üzere bir flash sürücüye kopyalayın. Bu adım birkaç dakika sürebilir ve 3.5.1 ile 3.5.3 arasındaki adımlara paralel olarak gerçekleştirilebilir.
5. Kayıt kafeslerinin temizlenmesi ve deneysel farelerin barındıkları yere geri aktarılması
   1. Kafeslerin kapaklarını kaplayan mavi pedi çıkarın. Hayvanları kayıt kafeslerinden barınak kafeslerine aktarın.
   2. Kayıt odalarındaki aksesuarları ve gıda maddelerini (örneğin, plastik iglolar, plastik tüpler, chow ve su jeli dinlenmeli tabak ve filtre kağıdı) çıkarın ve bunları biyotehlikeli atıklara atın.
   3. Kafesleri bir el elektrikli süpürgesi kullanarak temizleyin, kafesin dibinde bulunan chow ve dışkı topaklarını çıkarın. Ardından, kafesin zeminine ve iç duvarlarına% 70 etanol püskürtün ve iç kısmı yumuşak bir bezle temizleyin. Hava kurumasını sağlamak için kafeslerin kapağını açık bırakın.
   4. Barınak kafesini hayvanlarla birlikte ikincil bir kaba yerleştirin ve hayvanları barınma yerlerine geri taşıyın.

4. Kalibrasyon eğrilerinin oluşturulması

NOT: Boşluk noktası alanlarını idrar hacimlerine dönüştürmek için bir kalibrasyon eğrisi gereklidir. Günün aydınlık ve karanlık evrelerinde deneyler yapılıyorsa, kullanılan her filtre kağıdı türü için bir tane olmak üzere iki kalibrasyon eğrisi oluşturulmalıdır (ince ve kalın filtre kağıtları). Kalibrasyon eğrileri çift olarak oluşturulur. Her çoğaltma, RT-VSA kayıt odasına yerleştirilmiş bir filtre kağıdı üzerinde çalıştırılır. Karmaşık bileşimi ve UV uyarılabilirliği göz önüne alındığında, kalibrasyon eğrilerini yapmak için fare idrarı kullanın.

1. Fare idrarı toplama
   1. Bir parça esnek şeffaf film (10 cm x 15 cm) alın ve bir tezgahın üzerine yerleştirin.
   2. Kuyruğundan bir fare seçin ve fırçalayın. İdrar yapmayı tetiklemek için alt karın bölgesine yumuşak bir şekilde masaj yapın. Şeffaf film plastik tabakanın yüzeyinde idrar toplayın.
   3. Hayvanı yavaşça kafesinin içine bırakın. Bir pipet kullanarak, idrarı şeffaf filmin yüzeyinden steril bir 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne aktarın. ~ 10 mL fare idrarı toplanana kadar prosedürü birden fazla fareyle tekrarlayın, idrarı bir araya getirin ve -20 ° C'de saklayın.
      NOT: Açık ve koyu fazlar için çift kalibrasyon eğrileri oluşturmak için toplam ~ 10 mL fare idrarı gerekir. Deneysel fareleri strese sokmaktan kaçınmak için, idrar toplama için RT-VSA deneylerine tabi tutulacak fareleri kullanmayın.
2. Kalibrasyon eğrisi kayıtları
   1. Adım 4.1'de toplanan idrarı çözün ve 10-15 saniye boyunca hafifçe vorteks yaparak karıştırın.
   2. İki RT-VSA kayıt kafesinin her birine bir parça ince filtre kağıdı (24,3 cm x 36,3 cm) yerleştirin.
   3. Filtre kağıtlarının her birine aşağıdaki idrar hacimlerini (μL cinsinden) pipetleyin: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ve 750. Difüzyonun bir sonucu olarak nokta çakışmasını önlemek için, noktaları birbirinden yeterli bir mesafede tahsis edin.
   4. Kafeslerin kapağını kapatın ve pedlerle örtün.
   5. Command ve R tuşlarına basarak, denemeleri kaydetmek için kullanılan yazılım parametrelerinin aynısını uygulayarak kayda başlayın (adım 3.3.).
   6. İdrar noktalarının maksimum difüzyonuna izin vermek için kalibrasyon eğrisini 1 saat boyunca kaydedin. Kaydı durdurmak için Command ve T tuşlarına basın.
   7. Masaüstünde yeni bir klasör oluşturun, .m4v dosyalarını içine yerleştirin ve ardından daha sonra analiz etmek üzere verileri bir flash sürücüye aktarın.
   8. Kalın filtre kağıdıyla yinelenen eğriler oluşturmak için benzer bir prosedür uygulayın. Bu durumda, iç mekanı karartmak ve karanlık faz koşullarını simüle etmek için ekstra ped katmanları ekleyin.
3. Kalibrasyon eğrisi kayıtlarının analizi
   1. .m4v dosyalarını bir film oynatıcı yazılımında açın ve pencereyi ekranı dolduracak şekilde ekranı kaplayın. Kalın filtre kağıdı üzerinde gerçekleştirilen kalibrasyon eğrilerini analiz etmek için, en iyi kameralarla elde edilen dosyaları kullanın (Şekil 3A). İnce filtre kağıdı üzerinde gerçekleştirilen kalibrasyon eğrilerini analiz etmek için, alt kameralar ile elde edilen dosyaları kullanın (Şekil 3B).
   2. 1 saatlik kalibrasyon eğrisi filminin tamamına genel bir bakış elde etmek için zaman kaydırıcısını ileri ve geri hareket ettirerek .m4v dosyasını oynatın.
   3. Daha küçük idrar lekelerinin (<25 μL) en yüksek yoğunluğa sahip olduğu ve maksimum yayıldığı zaman aralığını belirleyin. Bu zaman aralığında bir ekran görüntüsü alın. Ekran görüntüsü dosyasını adlandırın ve .png dosyası olarak kaydedin (Şekil 3A, üst panel).
      NOT: Ekran görüntüleri F6 tuşuna basılarak alınır. F6'yı ekran görüntüsü alma amacıyla ayarlamak için şunu seçin: Sistem Tercihleri > Klavye > Kısayollar'ı seçin ve Ekranın Resmini Dosya Olarak Kaydet seçeneğinin sağında bulunan kutuya F6 yazın.
   4. Orta ve büyük idrar lekelerinin (>50 μL) maksimum alana sahip olduğu zaman aralığını belirleyin ve ekran görüntüsü alın. Daha küçük idrar lekelerinin bazılarının, daha büyük idrar lekeleri maksimum difüzyon sergilediğinde görünmemesi mümkündür. Dosyayı adlandırın ve ekran görüntüsünü .png dosyası olarak kaydedin (Şekil 3A, alt panel).
   5. ImageJ yazılımını (NIH) açın ve ardından görüntü dosyasını açmak için adım 4.3.3'te elde edilen .png dosyası simgesini sürükleyip bırakın (Şekil 4A).
   6. Araç çubuğundan Çokgen Seçimleri simgesini seçin ve filtre kağıdının kenarlığını belirtin.
   7. Ardından, menü çubuğundan Analiz Et'i seçin, genişletilmiş menüden Ölçümleri Ayarla'yı seçin ve açılan pencereden Alan'ı seçin. Tamam'ı tıklatın. Bu, adım 4.3.8 gerçekleştirildiğinde alan değerlerinin elde edilmesini sağlar.
   8. Ardından, menü çubuğundan tekrar Analiz Et'i seçin ve genişletilmiş seçeneklerden Ölçüm'ü seçin. Alan değerlerini piksel² olarak gösteren bir sütun alanı içeren bir sonuç penceresi açılır (Şekil 4B-D).
   9. Araç çubuğundan Serbest El Seçimleri simgesini seçin ve tek bir boşluk noktasının çevresine bir çizgi çizmek için kullanın. Alanı adım 4.3.8'deki gibi ölçün. Yazılım, yeni ölçümler yapıldıkça sonuç tablosunu günceller. Yeni sayı kümesi öncekilerin altında görünür. Analiz edilen her nokta için sonuçlar penceresinin sütun alanının altında görünen sayıyı kaydedin (Şekil 4E-G).
   10. Çoğaltılan noktaların her biri için 4.3.5 ile 4.3.7 arasındaki adımları yineleyin.
   11. Filtre kağıdının toplam alanını %100 olarak ayarlayın ve her idrar noktası için alan yüzdesini (% alan) hesaplayın. Bu normalleştirme, kameraların yakınlaştırma veya konumlandırılmasındaki farklılıkların bir sonucu olarak ortaya çıkabilecek hataları düzeltir.
   12. Bir grafik programında yeni bir XY tablosu oluşturun ve X sütununa idrar hacmi değerlerini (μL cinsinden) ve % alanının yinelenen değerlerini Y sütununa ekleyin.
   13. Ardından, Analiz > Doğrusal Olmayan Regresyon (eğri uyumu) > > XY analizini analiz et'i seçin. Görüntülenen parametreler penceresinden Model > Polinom > İkinci Dereceden Polinom (ikinci dereceden) seçeneğini belirleyin.
   14. Ardından, yöntem sekmesinden, aşağıdaki seçimleri işaretlemek için tıklatın: En Küçük Kareler Regresyonu, Ağırlıklandırma Yok ve Her Y Değerini Ayrı Bir Nokta Olarak Çoğaltın.
   15. Kısıtla sekmesinden B0, Kısıtlama Türü > Sabit eşittir'i seçin ve Değer sütununun altına 0 yazın. Tamam'ı tıklatın.

5. Deneysel fare kayıtlarının analizi

1. Işık fazı (alt kamera) veya karanlık faz (üst kamera) sırasında toplanan bir film dosyasını analiz için açın.
2. Zaman kaydırıcıyı ileri ve geri hareket ettirerek, analiz edilecek 6 saatlik zaman penceresi boyunca filtre kağıdının bozulmadan (yırtılma veya çiğneme olmadan) kaldığını doğrulayarak film dosyasının kalitesini değerlendirin. Kağıt yırtılmışsa, fare açıkta kalan plastiğin üzerine idrar yapmış olabileceğinden, nicelleştirilemeyen başka bir analiz yapmayın (Şekil 5).
3. Açık veya koyu fazlarda toplanan denemeleri analiz etmek için, istenen zaman penceresine gitmek üzere ileri sarma komutunu veya zaman çubuğu kaydırıcısını kullanın. Işık fazı sırasında işeme aktivitesi 11:00 ile 17:00 arasında (ZT = 4.0–10.0) ve karanlık fazda gece yarısı ile 06:00 arasında (ZT = 17.0–23.0) kaydedilir.
4. >> simgesine tıklayarak (veya filmde manuel olarak gezinerek) farenin işediğine dair kanıt arayarak filmi ileri sarma modunda oynatın. Bunun gerçekleştiğini söylemenin en kolay yolu, filtre kağıdında parlak idrar lekelerinin aniden ortaya çıkmasını sağlamaktır. Başka bir gösterge, kafesin köşelerine hareket ve fare işediğinde kısa bir hareketsizlik süresi de dahil olmak üzere davranış değişikliklerini aramaktır.
   NOT: Boşlukları algılamada daha iyi hale geldikçe, kaydırma veya hızlı ileri sarma hızını artırabilirsiniz. Bununla birlikte, çok sayıda küçük boşluk ^4,34'e sahip olan bakteriyel ve kimyasal olarak indüklenen sistitli farelerde, film boyunca çok hızlı hareket ederse işeme olayları kaçırılabilir.
5. Her boşluğun oluştuğu zamanı kaydedin. Bir kural olarak, boşluğun zamanı, idrarın tespit edildiğine dair ilk işarette kaydedilir (Şekil 6A,B).
6. Boşluğun ölçümlerini yapmak için, önce idrar noktasının maksimum difüzyonunun meydana geldiği zaman noktasını arayarak zaman içinde ileri (veya geri) hareket etmek için kaydırma çubuğunu kullanın. Bu noktada filmi duraklatın ve adım 4.3.3'te açıklandığı gibi bir ekran görüntüsü alın. Bilgisayar fare okunu analiz altındaki noktaya yerleştirin, böylece ilgilenilen nokta ekran görüntüsünde işaretlenir (Şekil 6C, D).
7. Filmdeki görünüm sırasını hesaba katmak için ekran görüntüsü dosyasını bağıntılı sayılar kullanarak adlandırın.
8. Filmdeki her boşluk noktası için 5.5 ve 5.7 adımlarını tekrarlayarak dosyayı analiz etmeye devam edin. Tüm boşluk noktaları analiz edildikten sonra, bir ekran görüntüsü yakalayarak ve 4.3.6'da açıklanan adımları kullanarak filtre kağıdının toplam alanını ölçün.
9. Adım 4.3.9'da açıklandığı gibi idrar lekelerinin her birinin % alanını hesaplayın. Adım 4'te oluşturulan kalibrasyon eğrilerini ve grafik yazılımındaki interpolat işlevini kullanarak her boşluk noktası için % alan değerlerini idrar hacmine (μL) dönüştürün.
   1. Grafik yazılımında, kalibrasyon eğrisinin verilerini içeren XY tablosunu açın ve kalibrasyon eğrisinin son değerinin altındaki Y sütununa % alan değerlerini ekleyin (Şekil 7A).
   2. Sonuç Tablosu sekmesine tıklayın ve model sekmesinin altında, Standart Eğri'den Bilinmeyenleri Enterpolat seçmek için tıklayın ve Tamam'a basın. Sonuç tablosu sekmesinin yanında enterpolasyonlu X ortalama değerleri adlı bir sekme görünür. Bu sekme, her boşluk noktası için μL cinsinden idrar hacmine karşılık gelen enterpolasyonlu değerleri içeren bir tablo içerir. (Şekil 7A,B).
10. Tüm deneysel fareleri analiz etmek için 5.1 ile 5.9 arasındaki adımları tekrarlayın.
11. Fare başına bir elektronik tablo kullanarak 5.5 ile 5.10 arasındaki adımlardan elde edilen verileri içeren bir çalışma kitabı dosyası oluşturun (Şekil 7C). Işık fazı deneyleri için bir dosya ve karanlık faz deneyleri için başka bir dosya oluşturun. Bu ana dosyalar, daha sonraki analizlerde kullanılan tüm ham verileri ve gerekli hesaplamaları içerir.

6. Deneysel farelerin idrara çıkma paterninin analizi

1. Birincil ve ikincil boşluk nokta profilleri oluşturun (Şekil 8A,B ve Şekil 9).
   NOT: Frekans dağılımı çalışmaları 23'e göre, ≥20 μL olan boşluk noktaları tipik olarak toplam boşalan hacmin% >95'ini temsil eder ve birincil boşluk noktaları (PVS'ler) ^olarak kabul edilir8,23,35. ≤20 μL olan boşluk lekeleri ikincil veya küçük boşluk noktaları (SVS'ler) olarak kabul edilir. PVS'ler ve SVS'ler arasındaki ayrımın işeme fenotiplerini karakterize etmek için yararlı bir yaklaşım olduğu gösterilmiştir. Yüksek sayıda SVS, işeme disfonksiyonuna işaret^{eder 35}.
   1. İlgilenilen işeme noktası verilerini (açık faz veya karanlık faz) içeren ana dosyadan, noktaları hacimlerine göre hacimleri ≥20 μL olduğunda PVS'ler veya hacimleri <20 μL olduğunda SVS'ler olarak sınıflandırın.
   2. Sayıyı sayın ve PVS'ler için ortalama geçersiz hacmi ve toplam hacmi hesaplayın.
   3. Hesaplanan parametrelerin her biri için kontrolü işlenen farelerle karşılaştıran bir grafik çubuğu oluşturun: PVS sayısı, PVS'lerin boşalan hacmi, PVS'lerin toplam hacmi, SVS sayısı, SVS'lerin toplam hacmi.
2. İsteğe bağlı: Zaman içinde işeme davranışını göstermek için kümülatif bir işeme hacmi grafiği (merdiven işlevi) oluşturun (Şekil 10 ve Şekil 11).
   1. Çalışma kitabı ana dosyasını açın ve saat, dakika ve saniye cinsinden ifade edilen işeme zamanını ondalık forma dönüştürün. Her zaman noktası için kümülatif idrar hacmini (μL cinsinden) hesaplayın.
   2. Grafik yazılımında, X sütununda ondalık biçimde zaman ve Y sütununda kümülatif idrar hacimleri olan bir XY tablosu oluşturun. Zaman ve idrar hacmi verilerini tabloya kopyalayın. (0; 0) ve (6; maksimum değer) veri noktaları ekleyin. Bu noktalar, boşa çıkarılan hacim sıfır (0; 0) olduğunda deneyin başlangıcında (zaman: 0 saat) ve deneyin sonunda (zaman: 6 saat) işemiş idrarın kümülatif değeri son işeme olayı için elde edilen değere eşit olduğunda (6; maksimum değer) grafiğin yatay çizgilerini tamamlamak için gereklidir.
   3. Grafiğe çift tıklayın; Grafiği Biçimlendir penceresi görünmelidir. Görünüm sekmesini seçin, Sembolleri Göster düğmesinin seçimini kaldırmak için tıklatın ve Bağlantı Çizgisini/Eğrisini Göster'i seçmek için tıklatın. Stil seçeneğine tıklayın ve Hayatta Kalma'yı seçin.

Sonuçlar

Ürotelyal Piezo1/2 nakavt farelerin işeme davranışı

Miktüritasyon döngüsünün depolama aşamasında, ürotelyumun mesanede biriken idrarın uyguladığı gerginliği algılamak ve bu mekanik uyaranı serozal ATP salınımı ^1,3 gibi hücresel yanıtlara dönüştürmek için hipotez vardır. Daha önce mekanik olarak aktive edilen PIEZO1 ve PIEZO2 kanallarının fare urothelium...

Tartışmalar

Video izlemenin dahil edilmesi, klasik VSA'ya göre çeşitli avantajlar sunan uygun maliyetli bir değişikliktir. Tipik olarak bir son nokta testi olarak kullanılan klasik VSA'da, örtüşen boşluk noktalarını ayırt etmek zordur. Bu önemsiz bir endişe değildir, çünkü fareler, tahlil birkaç saat uzatıldığında, tipik olarak kafeslerinin köşelerinde, aynı bölgede birden çok kez idrara çıkma eğilimindedir. Bu nedenle, RT-VSA'nın ilk avantajı, araştırmacının kısmen veya tamamen birbirinin üze...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches	80/20	1010	Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches	80/20	1010	Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches	80/20	1010	Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches	80/20	1010	Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches	80/20	1010	Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut	80/20	3280	Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut	80/20	3287	Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support	80/20	14061	Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate	80/20	4118	Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate	80/20	4081	Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate	80/20	4080	Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate	80/20	4140	Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly	80/20	2064	Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket	80/20	4509	Amount: 6
24”-long UV tube lights	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet	Profesional Plastics		Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance)	80/20	65-2641	Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)	Thermo Fisher Scientific	57144
Cosmos blotting paper (thick paper)	Blick Art Materials	10422-1005
Excel	Microsoft Corporation
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 9.4.0	graphing and statistics software
ImageJ FIJI	NIH
Parafilm	Merck		transparent film
Quick Time Player 10.5 software	Apple		multimedia player
Security spy	Ben software		video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20	80/20	3381	Amount: 80
UV transmitting acrylic	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm
Water gel: HydroGel	ClearH2O	70-01-5022	(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam	Logitech	C930e	Amount: 4