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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo descrive un nuovo metodo per studiare il comportamento di minzione del topo incorporando il monitoraggio video nel test convenzionale del punto vuoto. Questo approccio fornisce informazioni temporali, spaziali e volumetriche sugli eventi di svuotamento e sui dettagli del comportamento del mouse durante le fasi di luce e buio del giorno.

Abstract

Il normale comportamento minzionale è il risultato della funzione coordinata della vescica, dell'uretra e degli sfinteri uretrali sotto il corretto controllo del sistema nervoso. Per studiare il comportamento di minzione volontaria nei modelli murini, i ricercatori hanno sviluppato il void spot assay (VSA), un metodo che misura il numero e l'area di macchie di urina depositate su una carta da filtro che riveste il pavimento della gabbia di un animale. Sebbene tecnicamente semplice e poco costoso, questo test presenta dei limiti quando viene utilizzato come test end-point, tra cui la mancanza di risoluzione temporale degli eventi minzionali e le difficoltà nel quantificare le macchie di urina sovrapposte. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un VSA video-monitorato, che chiamiamo VSA IN TEMPO REALE (RT-VSA), e che ci consente di determinare la frequenza di svuotamento, valutare il volume vuoto e i modelli di svuotamento ed effettuare misurazioni su finestre temporali di 6 ore durante le fasi buie e chiare del giorno. Il metodo descritto in questo rapporto può essere applicato a un'ampia varietà di studi basati sui topi che esplorano gli aspetti fisiologici e neurocomportamentali della minzione volontaria negli stati di salute e malattia.

Introduzione

La conservazione delle urine e la minzione sono coordinate da un circuito centrale (sistema nervoso centrale) che riceve informazioni sullo stato di riempimento della vescica attraverso i nervi pelvico e ipogastrico. L'urotelio, l'epitelio che riveste il tratto urinario dalla pelvi renale all'uretra prossimale, forma una stretta barriera ai prodotti di scarto metabolici e agli agenti patogeni presenti nelle urine. È parte integrante di una rete sensoriale, che rileva e comunica lo stato di riempimento della vescica ai tessuti sottostanti e ai nervi afferenti 1,2. La rottura della barriera uroteliale, o alterazioni nelle vie di meccanotrasduzione uroteliale, possono portare a disfunzioni minzionali insieme a sintomi del tratto urinario inferiore come frequenza, urgenza, nicturia e incontinenza 3,4,5,6,7. Allo stesso modo, l'invecchiamento, il diabete, le infezioni del tratto urinario inferiore, la cistite interstiziale e altri processi patologici che colpiscono la vescica urinaria o i circuiti associati che controllano la sua funzione, sono noti per causare disfunzione della vescica 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Una migliore comprensione del comportamento minzionale normale e anormale dipende dallo sviluppo di metodi che possono discriminare in modo affidabile tra diversi modelli di minzione.

Tradizionalmente, il comportamento di minzione volontaria dei topi è stato studiato utilizzando il void spot assay (VSA), sviluppato da Desjardins e colleghi20, e ampiamente adottato grazie alla sua semplicità, basso costo e approccio non invasivo 8,21,22,23,24. Questo test viene tipicamente eseguito come test finale, in cui un topo trascorre una quantità definita di tempo in una gabbia rivestita da una carta da filtro, che viene successivamente analizzata contando il numero e valutando la dimensione delle macchie di urina quando la carta da filtro viene posta sotto luce ultravioletta (UV) (le macchie di urina sono fluorescenti in queste condizioni)20. Nonostante questi numerosi vantaggi, il VSA tradizionale presenta alcune importanti limitazioni. Poiché i topi spesso urinano nelle stesse aree, i ricercatori devono limitare la durata del test a un periodo di tempo relativamente breve (≤4 ore)25. Anche quando il VSA viene eseguito su periodi di tempo più brevi, è quasi impossibile risolvere piccoli punti vuoti (SVS) che cadono su grandi macchie vuote o, per discriminare le SVS dal trascinamento di urina aderente alla coda o alle zampe. È anche molto difficile distinguere se le SVS sono una conseguenza di frequenti ma singoli eventi minzionali (un fenotipo che si osserva spesso in risposta alla cistite 4,26), o a causa del dribbling post-minzione (un fenotipo associato all'ostruzione dello sbocco della vescica27). Inoltre, il desiderio di completare il test durante l'orario di lavoro, unito alle difficoltà di accesso alle strutture abitative quando le luci sono spente, spesso limita questi test al periodo di luce del ciclo circadiano di 24 ore. Pertanto, questi vincoli temporali impediscono la valutazione del comportamento minzionale del topo durante la loro fase notturna attiva, diminuendo la capacità di analizzare geni o trattamenti specifici che sono governati dai ritmi circadiani.

Per superare alcune di queste limitazioni, i ricercatori hanno sviluppato metodi alternativi per valutare il comportamento minzionale in tempo reale 26,28,29,30,31,32. Alcuni di questi approcci prevedono l'uso di attrezzature costose come le gabbie metaboliche26,28,29 o l'uso di telecamere termiche30; Tuttavia, anche questi hanno dei limiti. Ad esempio, nelle gabbie metaboliche, l'urina tende ad aderire ai fili del pavimento della rete e alle pareti dell'imbuto, riducendo la quantità di urina che viene raccolta e misurata. Pertanto, può essere difficile raccogliere con precisione dati su piccoli vuoti. Inoltre, le gabbie metaboliche non forniscono informazioni sulla distribuzione spaziale degli eventi di minzione (cioè la minzione negli angoli rispetto al centro della camera). Dato che la radiazione infrarossa a lunga lunghezza d'onda utilizzata dalle telecamere termografiche non penetra i solidi, l'attività di svuotamento valutata dalla videotermografia deve essere eseguita in un sistema aperto, che può essere difficile con i topi attivi, in quanto possono saltare diversi centimetri nell'aria. Un altro sistema è l'approccio automatizzato aVSOP (automated voided stain on paper)33, che consiste in carta da filtro arrotolata che si avvolge a velocità costante sotto il pavimento in rete metallica di una gabbia per topi. Questo approccio previene i danni alla carta e la sovrapposizione di macchie di urina che si verificano nel VSA classico e la sua implementazione consente allo sperimentatore di eseguire esperimenti per diversi giorni. Tuttavia, non fornisce allo sperimentatore una tempistica precisa degli eventi di minzione e non vi è alcuna capacità di esaminare il comportamento e come si correla con lo spotting. Per ottenere queste informazioni, i ricercatori hanno incorporato il video-monitoraggio ai saggi di minzione, un approccio che consente la valutazione simultanea dell'attività del topo e degli eventi di minzione31,32. Un approccio consiste nel posizionare un diodo a emissione di luce blu (LED) e una videocamera con un filtro proteico a fluorescenza verde posto sotto la gabbia sperimentale per visualizzare gli eventi di svuotamento, e un LED a infrarossi e una videocamera sopra la gabbia per catturare la posizione del mouse32. Questa configurazione è stata utilizzata per monitorare il comportamento dello svuotamento durante l'esecuzione della fotometria delle fibre; Tuttavia, l'ambiente illuminato di questo sistema ha richiesto ai ricercatori di trattare i loro topi con un agente diuretico per stimolare la minzione. In un altro progetto sperimentale, le telecamere grandangolari sono state posizionate sopra e sotto la gabbia sperimentale per visualizzare rispettivamente l'attività motoria del topo e gli eventi di minzione. In questo caso, le macchie di urina depositate su una carta da filtro che riveste il pavimento della gabbia sono state rivelate illuminando la carta da filtro con luci UV poste sotto la gabbia31. Questa configurazione è stata utilizzata in saggi brevi, della durata di 4 minuti, durante la fase luminosa del giorno per studiare i neuroni del tronco cerebrale coinvolti nel comportamento di minzione volontaria31. L'idoneità di questo sistema per il suo utilizzo durante la fase di buio o per periodi di tempo >4 minuti non è stata riportata.

In questo articolo viene descritto un metodo che migliora il VSA tradizionale consentendo il monitoraggio video a lungo termine del comportamento di svuotamento del mouse. Questo approccio economico fornisce informazioni temporali, spaziali e volumetriche sugli eventi di svuotamento per lunghi periodi di tempo durante le fasi di luce e buio del giorno, insieme a dettagli relativi al comportamento del mouse 3,4,34. Vengono fornite informazioni dettagliate per la costruzione delle camere di svuotamento, l'implementazione di un VSA (RT-VSA) in tempo reale e l'analisi dei dati. L'RT-VSA è prezioso per i ricercatori che cercano di comprendere i meccanismi fisiologici che controllano la funzione del sistema urinario, per sviluppare approcci farmacologici per controllare la minzione e per definire le basi molecolari dei processi patologici che colpiscono il tratto urinario inferiore.

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Protocollo

Topi uroteliali piezoelettrici a doppio knockout (Pz1/2-KO, genotipo: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) e controlli (Pz1/2-C, genotipo: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) sono stati generati internamente da ceppi parentali ottenuti dai laboratori Jax (ceppo # 029213 Piezo1 fl/fl ; Ceppo Piezo2 fl/fl # 027720; Upk2CRE+/- ceppo # 029281). Negli esperimenti sono stati utilizzati topi sia femmine (1,5-3 mesi e 17-20 g di peso) che maschi (2-4 mesi e 23-29 g di peso). Per esperimenti di cistite indotta da ciclofosfamide, sono state utilizzate femmine selvatiche C57Bl / 6J (3 mesi e ~ 20 g di peso) (i laboratori Jackson, ceppo # 000664). Gli animali sono stati ospitati e gli esperimenti sono stati eseguiti presso l'Università di Pittsburgh Animal Care Facility sotto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pittsburgh. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti della politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso di animali da laboratorio e della legge sul benessere degli animali.

1. Assemblaggio di gabbie per il test del punto vuoto in tempo reale (RT-VSA)

  1. Il rig RT-VSA è costituito da un supporto UV che contiene due lampadine UV e due telecamere grandangolari (telecamere inferiori), che vengono utilizzate per registrare l'attività di svuotamento durante la fase luminosa del giorno. Disporre due camere per il mouse per riposare sul supporto. Collegare le telecamere grandangolari (fotocamere superiori) al coperchio di ciascuna camera del mouse, utilizzate per registrare l'attività di svuotamento durante la fase buia del giorno (Figura 1A).
  2. Costruisci il telaio del supporto UV e delle camere del mouse da 1 in x 1 nei profili in alluminio con scanalatura a T. Vedere la Tabella 1 per un elenco dei componenti utilizzati per costruire due camere per mouse e il supporto UV e la Figura 1B-D per le diverse viste dei componenti e delle dimensioni assemblati.
  3. Costruisci ogni camera del mouse con otto profili in alluminio con scanalatura a T tagliati a 10 pollici e quattro tagli a 14,75 pollici. Iniziare assemblando la parte inferiore della camera del mouse e utilizzare elementi di fissaggio standard (Tabella 1) per assemblare i profili con scanalatura a T secondo la Figura 1. Montare l'acrilico trasmissore UV 38,5 cm x 26,5 cm nel canale interno dei profili per costruire il pavimento delle camere del mouse.
    NOTA: per informazioni dettagliate su come assemblare i profili con scanalatura a T con elementi di fissaggio standard, visitare la pagina Web dell'azienda.
  4. Costruisci le pareti della camera del mouse con il resto dei profili. Montare i pannelli in policarbonato resistente all'abrasione (AR) da 38,5 cm x 21,5 cm e 26,5 cm x 21,5 cm nei profili per assemblare le pareti esterne della camera del mouse. Utilizzare i pannelli in policarbonato AR da 37,5 cm x 23,9 cm e 24,4 cm x 23,9 cm per costruire l'interno della camera del mouse.
  5. Fissare i pannelli in policarbonato AR con chiusura standard 1/4-20 battistrada. Vedere le istruzioni su come montare i pannelli nei profili sulla pagina web nella NOTA del punto 1.3. Utilizzare il silicone commerciale calafataggio per sigillare le giunzioni tra i pannelli interni.
  6. Utilizzare due profili con fessura a T da 12 pollici e due da 14,75 pollici per assemblare il coperchio della gabbia come indicato nella figura 1B. Montare un pannello in policarbonato AR da 38,5 cm x 26,5 cm nel canale interno dei profili per completare il coperchio.
  7. Montare il supporto del profilo della telecamera da 12 pollici perpendicolare agli assi lunghi della parte superiore della gabbia e fissarlo con due passaggi leggeri all'interno delle staffe angolari (contrassegnato 3 nella Figura 1B). Utilizzare una piastra piana diritta (contrassegnata con 2) come supporto per il montaggio della webcam e montarla come mostrato nella Figura 1B. Collegare la fotocamera al supporto con la vite di montaggio della fotocamera.
  8. Utilizzare il gruppo cerniera di sollevamento standard serie 10 a destra per fissare il coperchio al corpo della camera del mouse (contrassegnato 1 nella Figura 1B).
  9. Costruire il supporto UV con quattro profili con scanalatura a T tagliati a 40 pollici, quattro profili con fessura a T tagliati a 32 pollici e quattro profili con fessura a T tagliati a 10 pollici, secondo la Figura 1C, D. Montare una lastra a specchio acrilico di 82,5 cm x 26,5 cm nei profili per costruire il fondo della camera UV.
  10. Utilizzare la lastra di specchio acrilico da 82,5 cm x 30,5 cm e 26,5 cm x 30,5 cm per costruire la parete del supporto UV.
  11. Fissare le piastre piatte a T a cinque fori serie 10 (contrassegnate 2 nella Figura 1 C), le piastre piatte L a cinque fori della serie 10 (contrassegnate con 3 nella Figura 1 C) e le piastre piatte a T a cinque fori della serie 10 (contrassegnate 1 nella Figura 1C) per fissare il supporto UV.
  12. Montare le telecamere inferiori in un profilo con scanalatura a T tagliato a 32 pollici e fissarle sul fondo del supporto con due staffe angolari di transizione lite come mostrato nella Figura 1D. Utilizzare piastre piatte dritte per collegare le webcam al profilo con scanalatura a T.
  13. Montare le lampade UV all'interno, sul fronte e sul retro e fissarle alle piastre piane diritte come mostrato nella Figura 1D.
  14. Collegare le quattro webcam alle porte USB di un computer che esegue un software di videosorveglianza.

2. Stabulazione degli animali prima della sperimentazione

  1. Topi sperimentali domestici, allevati appositamente o ottenuti da un sito esterno, in gruppi di quattro. Quando possibile, utilizzare topi femmina o maschio di pari età per questi esperimenti. Se gli animali sono ottenuti da una fonte esterna, consentire loro di acclimatarsi per almeno 7 giorni prima di condurre qualsiasi procedura sperimentale.
  2. Durante tutto il loro tempo nella struttura per animali, ospitano gli animali in gabbie standard contenenti lettiera e arricchimento (ad esempio, igloo di plastica, ruota, pezzo di carta per la triturazione) e tenerli sotto un ciclo giorno / notte di 12 ore, con accesso all'acqua e al chow secco del topo ad libitum.

3. Registrazioni RT-VSA durante le fasi chiare e scure del giorno

NOTA: il protocollo seguente descrive l'uso di RT-VSA per valutare il comportamento di svuotamento del mouse durante le fasi di luce e buio della giornata. Gli animali sono tenuti su un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio con Zeitgeber time (ZT) = 0 alle 07:00 a.m. Le registrazioni iniziano tra le 10:30 e le 11:00 (ZT = 3,5-4,0) per gli esperimenti in fase luminosa e tra le 18:00 e le 18:30 (ZT = 11,0-11,5) per gli esperimenti in fase oscura. Quando gli animali vengono testati in entrambe le condizioni, gli esperimenti vengono in genere eseguiti in due giorni separati, con almeno 5 giorni consecutivi tra i test di luce e buio. Gli esperimenti non dovrebbero essere eseguiti nei giorni in cui le stanze degli animali vengono pulite o le gabbie vengono cambiate, poiché possono causare stress che influenzano il comportamento svuotante. Tutti i passaggi devono essere eseguiti in condizioni di stress minimo per i topi.

  1. Trasportare gli animali da esperimento dalla loro posizione di stabulazione alla sala operatoria in cui si trovano le camere di registrazione RT-VSA.
  2. Preparazione della camera di registrazione RT-VSA
    1. Posizionare un pezzo di carta da filtro (24,3 cm x 36,3 cm) nella parte inferiore di ogni gabbia di registrazione RT-VSA. A seconda dell'ora del giorno, utilizzare carta da filtro sottile (esperimenti in fase leggera) o spessa (esperimenti in fase scura).
      NOTA: la carta da filtro spessa viene utilizzata durante la fase di buio attivo in quanto è più resistente alla triturazione rispetto alla carta da filtro sottile. Le fotocamere superiori vengono utilizzate per visualizzare le macchie di urina depositate su carta da filtro spessa durante la fase scura. Al contrario, durante la fase di luce, le telecamere inferiori vengono utilizzate perché la luce ambientale impedisce alle telecamere superiori di rilevare le macchie di urina depositate sulla carta da filtro. In questo caso, viene utilizzata carta da filtro sottile. Abbiamo scoperto che le telecamere inferiori sono inefficaci nel rilevare piccoli eventi di svuotamento depositati su carta da filtro spessa.
    2. Sopra la carta da filtro, posizionare i seguenti elementi: un igloo di plastica (che offre uno spazio per dormire), una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 ml per scopi di arricchimento e una capsula di plastica da 60 x 15 mm contenente due o tre pezzi di chow secco di topo e 14-16 g di acqua sotto forma di gel-pack (gel d'acqua non bagnante; Figura 2).
      NOTA: L'uso di provette da microcentrifuga da 1,5 ml per scopi di arricchimento era specifico per l'involucro utilizzato in questo studio.
    3. Una volta che le camere di registrazione sono pronte, posizionare delicatamente i topi sperimentali all'interno stendendoli delicatamente sulla carta da filtro. Assicurarsi che il trasferimento degli animali dalla gabbia dell'alloggiamento alle gabbie di registrazione avvenga con il minimo stress.
    4. Una volta che tutti gli animali da esperimento sono all'interno delle loro gabbie di registrazione, con i coperchi chiusi, coprire la parte superiore dei coperchi con un bluepad assorbente da banco per ridurre al minimo i riflessi diretti della luce ambientale sulla superficie del coperchio in plexiglass.
    5. Accendere le luci UV nella camera inferiore.
      NOTA: Gli animali non hanno alcun contatto diretto con la luce UV. La luce UV consigliata è dettagliata nella sezione materiali.
  3. Registrazioni RT-VSA
    1. Per registrare video dalle telecamere superiore e inferiore, utilizzare un software di registrazione di videosorveglianza, che può essere configurato per registrare da più webcam o telecamere di rete contemporaneamente.
    2. All'apertura del programma, avviare la registrazione premendo Comando e R nella finestra del programma. Esegui registrazioni video a una velocità di 1 fotogramma per s.
    3. Subito dopo aver avviato le registrazioni, esci dalla stanza, chiudendo delicatamente la porta. Assicurati che la stanza rimanga silenziosa per l'intera durata dell'esperimento.
  4. Termina le registrazioni RT-VSA
    1. Tornare nella sala operatoria dopo 7 ore (esperimenti in fase di luce) o la mattina successiva (esperimenti di fase oscura).
    2. Interrompi le registrazioni premendo Comando e T. Spegnere le luci UV.
    3. Dopo aver interrotto la registrazione, il software genera automaticamente un file filmato (in formato .m4v) per ogni telecamera e lo salva sotto il nome della fotocamera in una cartella di destinazione precedentemente selezionata. Verificare che, all'interno di ogni cartella della fotocamera, gli esperimenti siano organizzati in cartelle per data.
    4. In ogni cartella data/esperimento, verificate che esista un file di .m4v e tutti i singoli file di .jpeg corrispondenti a ciascuno dei fotogrammi del filmato.
    5. NOTA: i file .jpeg possono essere utilizzati per recuperare l'esperimento nel caso in cui i file del filmato vengano danneggiati.
    6. Crea una cartella sul desktop con il nome e la data dell'esperimento e trasferisci tutti i file .m4v in questa cartella. Se necessario, eliminare i file .jpeg una volta salvati e sottoposti a backup i file del filmato.
    7. NOTA: per gli esperimenti in fase di luce, il software genererà un filmato per telecamera, mentre per gli esperimenti in fase scura, genererà due filmati per ogni telecamera. Questo perché un nuovo file .m4v viene generato dopo la mezzanotte quando la data cambia.
    8. Copiare la cartella contenente i filmati in un'unità flash per l'analisi in un computer esterno. Questo passaggio può richiedere alcuni minuti e può essere eseguito in parallelo ai passaggi da 3.5.1 a 3.5.3.
  5. Pulizia delle gabbie di registrazione e trasferimento dei topi sperimentali nella loro posizione di alloggiamento
    1. Rimuovere il bluepad che copre i coperchi delle gabbie. Trasferire gli animali dalle gabbie di registrazione alla loro gabbia di alloggiamento.
    2. Rimuovere gli accessori e gli alimenti nelle camere di registrazione (ad esempio, igloo di plastica, tubi di plastica, piatto con resti di chow e gel d'acqua e carta da filtro) e smaltirli nei rifiuti biopericolosi.
    3. Pulire le gabbie utilizzando un aspirapolvere a mano, rimuovendo il chow e i pellet fecali presenti sul fondo della gabbia. Quindi, spruzzare il pavimento e le pareti interne della gabbia con etanolo al 70% e pulire l'interno con un pezzo di panno morbido. Lasciare il coperchio delle gabbie aperto per consentire loro di asciugare all'aria.
    4. Collocare la gabbia di alloggiamento con gli animali in un contenitore secondario e trasportare gli animali nella loro posizione di stabulazione.

4. Generazione di curve di calibrazione

NOTA: è necessaria una curva di calibrazione per convertire le aree spot vuote in volumi di urina. Se si eseguono esperimenti durante le fasi di luce e buio della giornata, è necessario generare due curve di calibrazione, una per ogni tipo di carta da filtro utilizzata (carta da filtro sottile e spessa). Le curve di calibrazione vengono generate in duplicato. Ogni replica viene eseguita su una carta da filtro posta in una camera di registrazione RT-VSA. Data la sua composizione complessa e l'eccitabilità UV, utilizzare l'urina di topo per effettuare le curve di calibrazione.

  1. Raccolta delle urine del topo
    1. Prendi un pezzo di pellicola trasparente flessibile (10 cm x 15 cm) e posizionalo su una panca.
    2. Scegli un topo per la coda e collottola. Massaggiare delicatamente l'addome inferiore per indurre la minzione. Raccogliere l'urina sulla superficie del foglio di plastica del film trasparente.
    3. Rilascia delicatamente l'animale all'interno della sua gabbia. Utilizzando una pipetta, trasferire l'urina dalla superficie del film trasparente a una provetta sterile da 1,5 mL di microcentrifuga. Ripetere la procedura con più topi fino a raccogliere ~ 10 ml di urina di topo, raggruppare l'urina e conservare a -20 ° C.
      NOTA: è necessario un totale di ~ 10 ml di urina di topo per generare curve di calibrazione duplicate per le fasi di luce e buio. Per evitare di stressare i topi sperimentali, non utilizzare topi che saranno sottoposti a esperimenti RT-VSA per la raccolta delle urine.
  2. Registrazioni della curva di calibrazione
    1. Scongelare l'urina raccolta nel passaggio 4.1 e mescolarla vorticando delicatamente per 10-15 s.
    2. Posizionare un pezzo di carta da filtro sottile (24,3 cm x 36,3 cm) in ciascuna delle due gabbie di registrazione RT-VSA.
    3. Pipettare i seguenti volumi di urina (in μL) su ciascuna carta da filtro: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 e 750. Per evitare la sovrapposizione delle macchie a seguito della diffusione, allocare i punti a una distanza sufficiente l'uno dall'altro.
    4. Chiudere il coperchio delle gabbie e coprirle con cuscinetti
    5. Avviare la registrazione premendo Comando e R, applicando gli stessi parametri software utilizzati per registrare gli esperimenti (passaggio 3.3.).
    6. Registrare la curva di calibrazione per 1 ora per consentire la massima diffusione delle macchie di urina. Premere Comando e T per interrompere la registrazione.
    7. Creare una nuova cartella nel desktop, inserire i file .m4v al suo interno, quindi trasferire i dati su un'unità flash per l'analisi successiva.
    8. Eseguire una procedura simile per generare curve duplicate con carta da filtro spessa. In questo caso, aggiungi ulteriori strati di pad per scurire l'interno e simulare le condizioni di fase scura.
  3. Analisi delle registrazioni della curva di calibrazione
    1. Apri i file .m4v in un software di riproduzione di film, ingrandendo la finestra per riempire lo schermo. Per analizzare le curve di calibrazione eseguite su carta da filtro spessa, utilizzare i file ottenuti con le fotocamere superiori (Figura 3A). Per analizzare le curve di calibrazione eseguite su carta da filtro sottile, utilizzare i file ottenuti con le fotocamere inferiori (Figura 3B).
    2. Riproduci il file .m4v, spostando il cursore temporale avanti e indietro per ottenere una panoramica del filmato completo della curva di calibrazione di 1 ora.
    3. Identificare l'intervallo di tempo in cui le macchie di urina più piccole (<25 μL) hanno la massima intensità e si sono diffuse al massimo. Fai uno screenshot entro questo intervallo di tempo. Assegnare un nome al file di screenshot e salvarlo come file di .png (Figura 3A, pannello superiore).
      NOTA: le schermate vengono acquisite premendo il tasto F6. Per impostare F6 per l'acquisizione di screenshot, seleziona: Preferenze di Sistema > Tastiera > Scorciatoie e scrivi F6 nella casella che si trova a destra dell'opzione Salva immagine dello schermo come file .
    4. Identificare l'intervallo di tempo in cui le macchie di urina medie e grandi (>50 μL) hanno un'area massima e fare uno screenshot. È possibile che alcune delle macchie di urina più piccole non siano visibili nel momento in cui le macchie di urina più grandi mostrano la massima diffusione. Assegna un nome al file e salva lo screenshot come file di .png (Figura 3A, pannello inferiore).
    5. Aprire il software ImageJ (NIH) e quindi trascinare e rilasciare l'icona del file .png ottenuta nel passaggio 4.3.3 per aprire il file di immagine (Figura 4A).
    6. Dalla barra degli strumenti, selezionare l'icona Selezioni poligonali e delineare il bordo della carta da filtro.
    7. Quindi, seleziona Analizza dalla barra dei menu, scegli Imposta misure dal menu espanso e dalla finestra che si apre seleziona Area. Fare clic su OK. Ciò consente di ottenere valori di area quando viene eseguito il passaggio 4.3.8.
    8. Quindi, seleziona di nuovo Analizza dalla barra dei menu e scegli Misura dalle opzioni espanse. Viene visualizzata una finestra dei risultati contenente un'area di colonna che mostra i valori dell'area in pixel2 (Figura 4B-D).
    9. Selezionate l'icona Selezioni a mano libera (Freehand Selections) dalla barra degli strumenti e utilizzatela per tracciare una linea attorno al perimetro di un singolo punto vuoto. Misurare l'area come al punto 4.3.8. Il software aggiorna la tabella dei risultati man mano che vengono eseguite nuove misurazioni. Il nuovo set di numeri appare sotto i precedenti. Registrare il numero visualizzato sotto l'area della colonna della finestra dei risultati per ogni punto analizzato (Figura 4E-G).
    10. Ripetere i passaggi da 4.3.5 a 4.3.7 per ciascuno degli spot replicati.
    11. Impostare l'area totale della carta da filtro come 100% e calcolare la percentuale di area (area %) per ogni punto urinario. Questa normalizzazione correggerà gli errori che potrebbero verificarsi come conseguenza delle differenze nello zoom o nel posizionamento delle telecamere.
    12. Creare una nuova tabella XY in un programma grafico e inserire i valori del volume urinario (in μL) nella colonna X e i valori duplicati dell'area % nella colonna Y.
    13. Quindi, selezionate Analisi > Analizza > Analisi XY > Regressione non lineare (adattamento curva). Dalla finestra dei parametri visualizzata, selezionate Polinomio > modello > Polinomio del secondo ordine (quadratico).
    14. Quindi, dalla scheda metodo, fare clic per contrassegnare le seguenti selezioni: Regressione dei minimi quadrati, Nessuna ponderazione e considerare ogni replica del valore Y come un singolo punto.
    15. Nella scheda Vincolo selezionare B0, Tipo vincolo > Costante uguale a e digitare 0 nella colonna Valore. Fare clic su OK.

5. Analisi delle registrazioni sperimentali dei topi

  1. Aprire un filmato raccolto durante la fase di luce (fotocamera inferiore) o la fase scura (fotocamera superiore) per l'analisi.
  2. Valutare la qualità del file filmato spostando lo scorrimento temporale avanti e indietro, confermando che la carta da filtro rimanga intatta (senza strappi o masticazioni) durante la finestra temporale di 6 ore da analizzare. Se la carta è strappata, non eseguire ulteriori analisi, poiché il topo potrebbe aver urinato sulla plastica esposta che non può essere quantificata (Figura 5).
  3. Per analizzare gli esperimenti raccolti nelle fasi di luce o buio, utilizzare il comando di avanzamento rapido o il dispositivo di scorrimento della barra temporale per passare alla finestra temporale desiderata. L'attività di svuotamento durante la fase luminosa viene registrata tra le 11:00 e le 17:00 (ZT = 4,0-10,0) e durante la fase oscura tra mezzanotte e le 06:00 (ZT = 17,0-23,0).
  4. Riproduci il filmato in modalità di avanzamento rapido facendo clic sull'icona >> (o scorri manualmente il filmato), cercando la prova che il mouse si sta annullando. Il modo più semplice per dire che ciò sta accadendo è cercare l'improvvisa comparsa di macchie luminose di urina sulla carta da filtro. Un altro indicatore è quello di cercare cambiamenti comportamentali tra cui il movimento agli angoli della gabbia e un breve periodo di inattività quando il topo sta svuotando.
    NOTA: Man mano che si migliora il rilevamento dei vuoti, è possibile aumentare la velocità di scorrimento o avanzamento rapido. Tuttavia, nei topi con cistite batterica e indotta chimicamente, che hanno un numero molto elevato di piccoli vuoti 4,34, si possono perdere eventi svuotanti se ci si muove troppo velocemente attraverso il film.
  5. Registra l'ora in cui si verifica ogni vuoto. Come convenzione, il tempo del vuoto viene registrato al primo segno che viene rilevata l'urina (Figura 6A,B).
  6. Per effettuare misurazioni del vuoto, utilizzare prima la barra di scorrimento per spostarsi avanti (o indietro) nel tempo, cercando il punto nel tempo in cui si è verificata la massima diffusione della macchia urinaria. Mettere in pausa il filmato a questo punto e fare uno screenshot come descritto nel passaggio 4.3.3. Posizionare la freccia del mouse del computer nel punto in analisi, in modo che il punto di interesse sia contrassegnato nello screenshot (Figura 6C,D).
  7. Assegna un nome al file dello screenshot utilizzando numeri correlati per tenere conto dell'ordine di apparizione nel filmato.
  8. Continuare ad analizzare il file, ripetendo i passaggi 5.5 e 5.7 per ogni punto vuoto sul filmato. Una volta analizzati tutti i punti vuoti, misurare l'area totale della carta da filtro catturando uno screenshot e utilizzando i passaggi descritti al punto 4.3.6.
  9. Calcolare l'area % di ciascuna delle macchie di urina come descritto al punto 4.3.9. Trasformare i valori dell'area % in volume di urina (μL) per ogni punto vuoto utilizzando le curve di calibrazione generate nel passaggio 4 e la funzione di interpolazione nel software grafico.
    1. Nel software grafico, aprire la tabella XY contenente i dati della curva di calibrazione e inserire i valori dell'area % nella colonna Y sotto l'ultimo valore della curva di calibrazione (Figura 7A).
    2. Fate clic sulla scheda Tabella dei risultati e, nella scheda Modello, fate clic su per selezionare Interpola incognite (Interpolate Unknowns) da Curva standard (Standard Curve ), quindi premete OK. Una scheda denominata valori medi X interpolati viene visualizzata accanto alla scheda della tabella dei risultati. Questa scheda contiene una tabella con i valori interpolati che corrispondono al volume di urina in μL per ogni punto vuoto. (Figura 7A,B).
  10. Ripetere i passaggi da 5.1 a 5.9 per analizzare tutti i topi sperimentali.
  11. Creare un file di cartella di lavoro contenente i dati ottenuti dai passaggi da 5.5 a 5.10, utilizzando un foglio di calcolo per mouse (Figura 7C). Creare un file per gli esperimenti della fase di luce e un altro per quelli della fase oscura. Questi file master contengono tutti i dati grezzi e i calcoli necessari utilizzati in ulteriori analisi.

6. Analisi del pattern di minzione di topi sperimentali

  1. Generare profili spot vuoti primari e secondari (Figura 8A,B e Figura 9).
    NOTA: Secondo gli studi sulla distribuzione di frequenza 23, i punti vuoti che sono ≥20 μL rappresentano tipicamente il >95% del volume totale vuoto e sono considerati punti vuoti primari (PVS)8,23,35. Le macchie vuote che sono ≤20 μL sono considerate macchie vuote secondarie o piccole (SVS). La discriminazione tra PVS e SVS ha dimostrato di essere un approccio utile per caratterizzare i fenotipi minzionali. Un numero elevato di SVS indica una disfunzione minzionale35.
    1. Dal file master contenente i dati spot di minzione di interesse (fase chiara o fase oscura), classificare gli spot in base al loro volume come PVS quando il loro volume è ≥20 μL o SVS quando il loro volume è <20 μL.
    2. Contare il numero e calcolare il volume medio vuoto e il volume totale per i PVS. Contare il numero e calcolare il volume totale per gli SVS.
    3. Generare una barra grafica che confronta il controllo con i topi trattati per ciascuno dei parametri calcolati: numero di PVS, volume vuoto di PVS, volume totale di PVS, numero di SVS, volume totale di SVS.
  2. Facoltativo: genera un grafico cumulativo del volume vuoto (funzione scala) per mostrare il comportamento dello svuotamento nel tempo (Figura 10 e Figura 11).
    1. Aprire il file master della cartella di lavoro e convertire il tempo di annullamento, espresso in ore, minuti e secondi, nel formato decimale. Calcolare il volume cumulativo di urina (in μL) per ogni punto temporale.
    2. Genera una tabella XY nel software grafico con il tempo in forma decimale nella colonna X e i volumi cumulativi di urina nella colonna Y. Copiare i dati relativi al tempo e al volume delle urine nella tabella. Aggiungere punti dati (0; 0) e (6; valore massimo). Questi punti sono necessari per completare le linee orizzontali del grafico all'inizio dell'esperimento (tempo: 0 h) quando il volume vuoto è zero (0; 0), e alla fine dell'esperimento (tempo: 6 h) quando il valore cumulativo dell'urina vuota è uguale al valore ottenuto per l'ultimo evento di svuotamento (6; valore massimo).
    3. Fare doppio clic sul grafico; Dovrebbe apparire la finestra Formato grafico. Selezionate la scheda Aspetto (Appearance ), fate clic su per deselezionare il pulsante Mostra simboli (Show Symbols ), quindi fate clic su Mostra linea di connessione/curva (Show Connecting Line/Curve). Fai clic sull'opzione Stile e seleziona Sopravvivenza.

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Risultati

Comportamento minzionale dei topi knockout uroteliali piezo1/2

Durante la fase di conservazione del ciclo di minzione, si ipotizza che l'urotelio percepisca la tensione esercitata dall'urina accumulata nella vescica e trasduca questo stimolo meccanico in risposte cellulari come il rilascio sieroso di ATP 1,3. Abbiamo precedentemente dimostrato che i canali PIEZO1 e PIEZO2 attivati meccanicamente sono espressi...

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Discussione

L'incorporazione del video-monitoraggio è una modifica economica che presenta diversi vantaggi rispetto al VSA classico. Nel VSA classico, che viene tipicamente utilizzato come test end-point, è difficile distinguere punti vuoti sovrapposti. Questa non è una preoccupazione banale, poiché i topi tendono a urinare più volte nella stessa area quando il test viene prolungato per diverse ore, in genere negli angoli della loro gabbia. Pertanto, il primo vantaggio di RT-VSA è che lo sperimentatore può facilmente identifi...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione NIH R01DK119183 (a G.A. e MDC), un premio per un progetto pilota attraverso P30DK079307 (a M.G.D.), un premio per lo sviluppo della carriera dell'American Urology Association e una sovvenzione della Winters Foundation (a NM), e dal Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores del Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches80/201010Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches80/201010Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches80/201010Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches80/201010Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches80/201010Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut80/203280Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut80/203287Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support80/2014061Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate80/204118Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate80/204081Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate80/204080Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate80/204140Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly80/202064Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket80/204509Amount: 6
24”-long UV tube lightsADJ Products LLCT8-F20BLB24Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror SheetProfesional PlasticsAmount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror SheetProfesional PlasticsAmount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror SheetProfesional PlasticsAmount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance)80/2065-2641Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper) Thermo Fisher Scientific57144
Cosmos blotting paper (thick paper)Blick Art Materials10422-1005
ExcelMicrosoft Corporation
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.4.0graphing and statistics software
ImageJ FIJINIH
ParafilmMercktransparent film
Quick Time Player 10.5 software Applemultimedia player
Security spyBen softwarevideo surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-2080/203381Amount: 80
UV transmitting acrylicSpartechPolycast Solacryl SUVTAmount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGelClearH2O  70-01-5022(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
WebcamLogitechC930eAmount: 4

Riferimenti

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