JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه الدراسة تسليم إصابة دماغية رضحية متكررة للفئران وزرع متزامن لنافذة الجمجمة للتصوير اللاحق داخل الجسم ل EGFP المعبر عنه بالخلايا العصبية باستخدام المجهر ثنائي الفوتون.

Abstract

الهدف من هذا البروتوكول هو توضيح كيفية التصور الطولي للتعبير عن وتوطين بروتين مهم داخل أنواع معينة من خلايا دماغ الحيوان ، عند التعرض للمنبهات الخارجية. هنا ، يتم عرض إدارة إصابة الدماغ الرضحية المغلقة في الجمجمة (TBI) والزرع المتزامن لنافذة الجمجمة للتصوير الطولي اللاحق داخل الجسم في الفئران. يتم حقن الفئران داخل الجمجمة بفيروس مرتبط بالغدي (AAV) يعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (EGFP) تحت محفز عصبي محدد. بعد 2 إلى 4 أسابيع ، تتعرض الفئران لإصابات الدماغ الرضية المتكررة باستخدام جهاز إنقاص الوزن فوق موقع حقن AAV. في نفس الجلسة الجراحية ، يتم زرع الفئران بعمود رأس معدني ثم نافذة زجاجية في الجمجمة فوق موقع تأثير إصابات الدماغ الرضية. يتم فحص التعبير والتوطين الخلوي ل EGFP باستخدام مجهر ثنائي الفوتون في نفس منطقة الدماغ المعرضة للصدمة على مدار أشهر.

Introduction

إصابات الدماغ الرضحية (TBI) ، والتي يمكن أن تنجم عن الإصابات الرياضية وتصادم المركبات والقتال العسكري ، هي مصدر قلق صحي في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يؤدي TBI إلى عجز فسيولوجي ومعرفي وسلوكي ، وإعاقة أو وفيات مدى الحياة 1,2. يمكن تصنيف شدة إصابات الدماغ الرضية على أنها خفيفة ومتوسطة وشديدة ، والغالبية العظمى منها خفيفة إصابات الدماغ الرضية (75٪ -90٪)3. من المعترف به بشكل متزايد أن إصابات الدماغ الرضية ، وخاصة التكرار لإصابات الدماغ الرضية ، يمكن أن تعزز تنكس الخلايا العصبية وتعمل كعوامل خطر للعديد من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS) ، والخرف الجبهي الصدغي (FTD) ، والاعتلال الدماغي الرضحي المزمن (CTE)4،5،6. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء التنكس العصبي الناجم عن إصابات الدماغ الرضية لا تزال غير واضحة ، وبالتالي تمثل مجالا نشطا للدراسة. للحصول على نظرة ثاقبة حول كيفية استجابة الخلايا العصبية والتعافي من إصابات الدماغ الرضية ، يتم وصف طريقة لمراقبة البروتينات ذات العلامات الفلورية ذات الأهمية ، وتحديدا داخل الخلايا العصبية ، عن طريق التصوير الطولي داخل الجسم في الفئران بعد إصابات الدماغ الرضية هنا.

تحقيقا لهذه الغاية ، توضح هذه الدراسة كيفية الجمع بين إجراء جراحي لإدارة إصابات الدماغ الرضية المغلقة في الجمجمة يشبه ما تم الإبلاغ عنه سابقا 7,8 ، جنبا إلى جنب مع إجراء جراحي لزرع نافذة الجمجمة للتصوير داخل المصب ، كما وصفه Goldey etal 9. والجدير بالذكر أنه ليس من الممكن زرع نافذة الجمجمة أولا ثم إجراء إصابات الدماغ الرضية في نفس المنطقة ، حيث من المحتمل أن يؤدي تأثير انخفاض الوزن الذي يحفز إصابات الدماغ الرضية إلى إتلاف النافذة والتسبب في ضرر لا يمكن إصلاحه للفأر. لذلك ، تم تصميم هذا البروتوكول لإدارة إصابات الدماغ الرضية ثم زرع نافذة الجمجمة مباشرة فوق موقع التأثير ، كل ذلك خلال نفس الجلسة الجراحية. تتمثل ميزة الجمع بين كل من إصابات الدماغ الرضية وزرع نافذة الجمجمة في جلسة جراحية واحدة في تقليل عدد المرات التي يخضع فيها الفأر لعملية جراحية. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح للمرء بمراقبة الاستجابة الفورية (أي على مقياس زمني للساعات) لإصابات الدماغ الرضية ، بدلا من زرع النافذة في جلسة جراحية لاحقة (أي التصوير الأولي الذي يبدأ على مقياس زمني من الأيام بعد إصابات الدماغ الرضية). توفر نافذة الجمجمة ومنصة التصوير داخل الجسم أيضا مزايا على مراقبة البروتينات العصبية بالطرق التقليدية مثل التلوين المناعي للأنسجة الثابتة. على سبيل المثال ، هناك حاجة إلى عدد أقل من الفئران للتصوير داخل الجسم ، حيث يمكن دراسة نفس الفأر في نقاط زمنية متعددة ، على عكس مجموعات منفصلة من الفئران اللازمة لنقاط زمنية منفصلة. علاوة على ذلك ، يمكن مراقبة نفس الخلايا العصبية بمرور الوقت ، مما يسمح للمرء بتتبع أحداث بيولوجية أو مرضية محددة داخل نفس الخلية.

كدليل على المفهوم ، يتم توضيح التعبير الخاص بالخلايا العصبية لبروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (EGFP) تحت مروج المشبك هنا10. يمكن توسيع هذا النهج ليشمل 1) أنواع مختلفة من خلايا الدماغ من خلال استخدام محفزات أخرى محددة من نوع الخلية ، مثل مروج البروتين الأساسي للمايلين (MBP) للخلايا قليلة التغصن ومحفز البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) للخلايا النجمية11 ، 2) البروتينات المستهدفة المختلفة ذات الأهمية عن طريق دمج جيناتها مع جين EGFP ، و 3) المشاركة في التعبير عن بروتينات متعددة تنصهر في فلوروفورات مختلفة. هنا ، يتم تعبئة EGFP والتعبير عنه عن طريق توصيل الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) من خلال الحقن داخل الجمجمة. يتم إعطاء إصابات الدماغ الرضية المغلقة باستخدام جهاز إنقاص الوزن ، يليه زرع نافذة الجمجمة. يتم تحقيق تصور EGFP العصبي من خلال نافذة الجمجمة ، باستخدام المجهر ثنائي الفوتون للكشف عن مضان EGFP في الجسم الحي. باستخدام ليزر الفوتون الثنائي ، من الممكن اختراق الأنسجة القشرية بشكل أعمق مع الحد الأدنى من التلف الضوئي ، مما يسمح بالتصوير الطولي المتكرر لنفس المناطق القشرية داخل فأر فردي لأيام وحتىأشهر 12،13،14،15. باختصار ، يهدف هذا النهج المتمثل في الجمع بين جراحة TBI والتصوير داخل الجسم إلى تعزيز فهم الأحداث الجزيئية التي تساهم في أمراض الأمراض التي يسببها TBI16,17.

Protocol

تم إجراء جميع البروتوكولات المتعلقة بالحيوانات وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر الذي نشرته لجنة المجلس القومي للبحوث (الولايات المتحدة). تمت الموافقة على البروتوكولات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في كلية الطب بجامعة ماساتشوستس تشان (UMMS) (تصريح رقم 202100057). باختصار ، كما هو موضح في مخطط الدراسة (الشكل 1) ، يتلقى الحيوان حقنة فيروس ، وإصابات الدماغ الرضية ، وزرع نافذة ، ثم التصوير داخل الجسم في تسلسل زمني.

ملاحظة: تمت إزالة الشروط التجارية. يرجى الرجوع إلى جدول المواد لمعرفة المعدات المحددة المستخدمة.

1. الحقن داخل الجمجمة من AAV باستخدام جهاز تجسيمي

  1. AAV (PHP.eB) -Syn1-EGFP
    1. استخدم عيار فيروسي من 1 × 1013 جينوم فيروسي لكل ملليلتر (vg / mL). يشير Syn1 إلى Synapsin1 ، وهو محفز خاص بالخلايا العصبية يسمح بالتعبير الفيروسي المقيد في الخلايا العصبية. يمكن تحضير الفيروس داخليا أو الاستعانة بمصادر خارجية.
  2. التحضير لجراحة الحقن التجسيمي لإدارة AAV
    1. مقص الأوتوكلاف العادي ، الفرجار الجراحي ، مقص الربيع الجراحي ، ملقط جراحي ، ملقط البعوض ، شاش ، قضيب ذو رأس قطني ، وحقنة زجاجية ميكرولتر.
    2. تعقيم منطقة الجراحة باستخدام 75٪ من الإيثانول. قم بتوسيع الستارة الجراحية المعقمة التي تستخدم لمرة واحدة لتغطية منطقة الجراحة على منصة التجسيم.
      ملاحظة: للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان أثناء جراحة الحقن ، استخدم جهاز تسخين منظم التغذية المرتدة.
    3. وزن وتسجيل وزن جسم الماوس.
    4. افتح صمام خزان الأكسجين واضبط تدفق الأكسجين على 1.5 لتر / دقيقة. افتح جهاز التخدير واضبط قيمة مستوى الأيزوفلوران على ثلاثة.
      ملاحظة: يمكن أن يكون الغاز الحامل إما هواء الغرفة أو أكسجين 100٪ في هذه الخطوة.
    5. ضع الماوس في غرفة الحث واتركه لمدة 5 دقائق لتحقيق التخدير الكامل.
    6. بمجرد تخدير الفأر بالكامل (أي معدلات التنفس البطيئة ولكن الثابتة في دورة واحدة تقريبا لكل 2 ثانية ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل) ، قم بإزالة الماوس من غرفة الحث وضع رأس الماوس في الإطار المجسم.
    7. ضع مخروط أنف أنبوب التخدير فوق خطم الفأر.
    8. الحفاظ على التخدير باستخدام 1.5٪ إيزوفلوران ، مع الغاز الناقل بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة حتى نهاية الجراحة. تحقق بشكل دوري من وتيرة التنفس ، وقم بقرص الذيل أو إصبع القدم كل 15 دقيقة على الأقل طوال الجراحة لتقييم التخدير المناسب. اضبط تركيز الأيزوفلوران حسب الاقتضاء للحفاظ على عمق التخدير المطلوب.
    9. املأ حقنة ميكرولتر (10 ميكرولتر) بمحلول الفيروس. ثم ، ثبت المحقنة على مضخة الحاقن الدقيقة المتطابقة لجهاز التجسيم.
  3. جراحة الحقن
    1. تطبيق البوبرينورفين (1 ملغ/كغ، تحت الجلد) باستخدام حقنة أنسولين يمكن التخلص منها وتطبيق مرهم مزلق للعين على عيني الفأر.
    2. إزالة الشعر من فروة الرأس في أعلى الرأس عن طريق التشذيب بالمقص العادي 1.
    3. نظف جلد فروة الرأس باستخدام أدوات التطبيق ذات الشاش والقطن. تطهير الجلد باستخدام 75٪ من الإيثانول أولا ثم البيتادين. كرر هذا ثلاث مرات (أي الإيثانول متبوعا بالبيتادين) ، مع ترك التطبيق النهائي للبيتادين على الجلد.
    4. أعد التحقق من عمق التخدير للتأكد من أن الفأر مخدر بالكامل (أي معدلات تنفس بطيئة ولكن ثابتة في دورة واحدة تقريبا لكل 2 ثانية ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل). قم بعمل شق ~ 1 سم باستخدام مقص عادي 2 على طول خط الوسط لفضح الجمجمة الجدارية اليمنى ، وقم بإزالة السمحاق باستخدام قضيب ذو رأس قطني.
    5. ضع علامة على نقطتين على الجمجمة باستخدام قلم تحديد عند هذه الإحداثيات: النقطة A: 2.5 مم خلف Bregma و 1 مم جانبي لخط الوسط فوق نصف الكرة الأيمن. النقطة B: 2.5 مم خلف Bregma و 2 مم جانبي لخط الوسط فوق نصف الكرة الأيمن.
    6. احفر ثقبين بعناية عبر الجمجمة عند الإحداثيات المحددة باستخدام مثقاب أسنان كهربائي مع لقمة كربيد EF4 دقيقة.
      ملاحظة: احرص على عدم إتلاف أنسجة المخ.
    7. اضبط الإطار التجسيمي لمحاذاة طرف إبرة حقنة الميكرولتر مع فتحة الجمجمة التي تكون جانبية بمقدار 1 مم إلى خط الوسط.
    8. اخفض إبرة المحقنة للمس سطح الدماغ ، ثم اضبط هذا الموقع كنقطة الصفر (للمحور z). اخفض طرف الإبرة في قشرة الدماغ إلى عمق 0.5 مم ، وغرس ببطء 1 ميكرولتر من محلول الفيروس بسرعة 200 نانولتر / دقيقة.
    9. انتظر 5 دقائق بعد حقن محلول الفيروس بالكامل في أنسجة المخ قبل سحب الإبرة لمنع ارتجاع المحلول.
    10. اسحب إبرة الحقنة ببطء. كرر الحقن في الموقع الآخر. خياطة الشق بخياطة جراحية معقمة غير قابلة للامتصاص (مقياس 6-0).
    11. تطبيق سيفازولين [500 ملغ/كغ (333 ملغ/مل، عادة ~45 ميكرولتر)، في العضل]، وميلوكسيكام (5 ملغ/كغ، تحت الجلد) بعد الجراحة بينما لا يزال الحيوان مخدرا.
    12. حرر الماوس من الإطار التجسيمي وتوقف عن التخدير. ضع الماوس في قفص نظيف فوق بطانية التدفئة ، وراقب الحيوان حتى يصبح متنقلا (حوالي 15 دقيقة). ثم نقل إلى قفص المنزل.
    13. يجب تطبيق البوبرينورفين (1 ملغ/ كغ، تحت الجلد) وميلوكسيكام (5 ملغ/كغ، تحت الجلد) مرة أخرى عند 8 ساعات، 16 ساعة، و24 ساعة على التوالي، بعد حقن البوبرينورفين الأول.
      ملاحظة: في 2-4 أسابيع بعد حقن الفيروس ، يتلقى الفأر إصابات الدماغ الرضية وزرع نافذة الجمجمة في نفس موقع حقن AAV.

2. إعطاء تحريض TBI المتكرر

ملاحظة: تم تعديل معلمات TBI من التقارير السابقة 7,8 ، حيث تم تسليم تأثير TBI مرة واحدة. يطبق البروتوكول هنا نفس المعلمة ، باستثناء زيادة رقم التأثير الإجمالي إلى 10.

  1. معدات TBI
    1. استخدم جهازا محمولا مصمما خصيصا لإدارة TBI مغلق الجمجمة (الشكل 2A) إلى رأس الماوس على الجانب الأيمن ، كما هو موضح في الشكل 2B.
  2. التحضير قبل الجراحة
    1. معدات جراحة الأوتوكلاف ، بما في ذلك المقص العادي ، والفرجار الجراحي ، ومقص الربيع الجراحي ، والملقط الجراحي ، وملقط البعوض ، وقطع عمود الرأس ، والشاش ، وأدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية.
    2. وزن وتسجيل وزن جسم الفأر 2 ساعة قبل الجراحة. لتقليل وذمة الدماغ أثناء زرع نافذة الجمجمة ، حقن ديكساميثازون فوسفات الصوديوم بجرعة 4.8 ملغ / كغ [2 ملغ / مل ، عادة ~ 70 ميكرولتر (تحتاج إلى الحقن في موقعين)] في عضلة رباعية الرؤوس باستخدام حقنة الأنسولين. بعد حقن ديكساميثازون ، ولكن قبل البدء في جراحة TBI ، قم بإعداد النوافذ الزجاجية كما هو موضح في الخطوة 3.1 لاستخدامها لاحقا.
    3. تطهير المرحلة الجراحية ومعدات إصابات الدماغ الرضية باستخدام 75٪ من الإيثانول ، وتوسيع الستارة الجراحية المعقمة التي تستخدم لمرة واحدة لتغطية مرحلة الجراحة على المنصة المجسمة. قم بتشغيل جهاز التسخين ومراقبة درجة الحرارة ، واضبط درجة الحرارة المستهدفة على 37 درجة مئوية.
    4. افتح صمام خزان الأكسجين واضبط تدفق الأكسجين على 1.5 لتر / دقيقة. افتح جهاز التخدير واضبط قيمة مستوى الأيزوفلوران على ثلاثة.
      ملاحظة: يمكن أن يساعد الأكسجين النقي بنسبة 100٪ الحيوان على النجاة من تأثيرات إصابات الدماغ الرضية.
    5. ضع الماوس في غرفة الحث واتركه لمدة 5 دقائق لتحقيق التخدير الكامل.
    6. بمجرد تخدير الفأر بالكامل (أي معدلات التنفس البطيئة ولكن الثابتة في دورة واحدة تقريبا لكل 2 ثانية ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل) ، قم بإزالة الماوس من غرفة الحث وضع رأس الماوس في الإطار المجسم.
    7. ضع مخروط أنف أنبوب التخدير فوق خطم الفأر.
    8. الحفاظ على التخدير باستخدام 1.5٪ إيزوفلوران ممزوج بأكسجين نقي 100٪ بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة حتى نهاية الجراحة. تحقق بشكل دوري من وتيرة التنفس ، وقم بقرص الذيل أو إصبع القدم كل 15 دقيقة على الأقل طوال الجراحة لتقييم التخدير المناسب. اضبط تركيز الأيزوفلوران حسب الاقتضاء للحفاظ على عمق التخدير المطلوب.
  3. جراحة إصابات الدماغ الرضية
    1. تطبيق البوبرينورفين (1 ملغ/كغ، تحت الجلد) باستخدام محاقن الأنسولين التي تستخدم لمرة واحدة وتطبيق مرهم العيون على عيون الفأر.
    2. قم بإزالة الشعر من أعلى الرأس عن طريق التشذيب بالمقص 1 ، ثم تطبيق عامل إزالة الشعر لمدة دقيقة واحدة.
      تنبيه: لا تضع منتج عامل إزالة الشعر لأكثر من 3 دقائق على فروة الرأس ، لأنه مهيج للجلد. تجنب وضع أي عامل مزيل للشعر على عيون الفأر.
    3. نظف جلد فروة الرأس عن طريق وضع أدوات تطبيق الشاش والقطن. ثم قم بتطهير الجلد باستخدام 75٪ إيثانول أولا ثم بيتادين. كرر هذا ثلاث مرات (أي الإيثانول متبوعا بالبيتادين) ، مع ترك التطبيق النهائي للبيتادين على الجلد.
    4. أعد التحقق من عمق التخدير للتأكد من أن الفأر مخدر بالكامل (أي معدلات تنفس بطيئة ولكن ثابتة في دورة واحدة تقريبا لكل 2 ثانية ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل). خيمة الجلد بالملقط الجراحي 3 ، وجعل شق خط الوسط بطول 12-15 مم يبدأ حوالي 3 مم من الخلف من العينين.
    5. استئصال الجلد على نصف الكرة الأيسر والأيمن من الجمجمة باستخدام مقص الربيع 2.
    6. بمجرد انكشاف الجمجمة ، قم بإزالة السمحاق عن طريق فركه برفق باستخدام قضيب معقم ذي رأس قطني وغسله بمحلول ملحي معقم.
    7. فحص حالة الجمجمة بصريا للتأكد من أنها سليمة ، باستثناء الثقبين الصغيرين ، اللذين تم إجراؤهما لجراحة حقن الفيروس السابقة.
    8. جفف منطقة الجمجمة وحدد موقع ارتطام TBI عند الإحداثيات التالية: 2.5 مم خلف Bregma و 2 مم جانبي من الدرز السهمي إلى اليمين (الشكل 2B).
    9. قم بإزالة الماوس بسرعة من الإطار التجسيمي وضع الرأس على وسادة العازلة أسفل جهاز TBI.
    10. قم بمحاذاة طرف الصدمة مع موقع الارتطام المحدد.
    11. ارفع العمود المعدني عن طريق سحب خيط النايلون المربوط إلى 15 سم فوق رأس الماوس ثم حرره ، مما يسمح للوزن بالسقوط بحرية على قضيب محول الطاقة ، الذي يتلامس مع قمة الجمجمة في موقع TBI. لا تلمس رأس الماوس عند توصيل تأثير TBI.
    12. حرك الماوس على بطانية التدفئة ، وضعه على ظهره أثناء مراقبة حالة التنفس.
    13. بمجرد أن يصحح الماوس نفسه من وضع الاستلقاء إلى وضعية الانبطاح ، ضع الماوس في غرفة تحريض الأيزوفلوران لمدة ~ 5 دقائق مع 3٪ إيزوفلوران ممزوج بأكسجين نقي 100٪ بمعدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة.
    14. بمجرد تخدير الفأر بالكامل (أي معدلات التنفس البطيئة ولكن الثابتة في دورة واحدة تقريبا لكل 2 ثانية ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل) ، كرر الخطوات 2.3.9-2.3.14 لتحقيق ما مجموعه 10 تأثيرات.
      ملاحظة: تم العثور على عشرة تأثيرات TBI للحث على النمط الظاهري القوي مع انخفاض معدل وفيات الفئران في دراستنا (البيانات لم تنشر بعد). يمكن تعديل المعلمات لتحقيق شدة مختلفة من إصابات الدماغ عن طريق زيادة أو تقليل عدد التأثيرات و / أو الارتفاع الذي يتم إطلاق الوزن منه. تخضع جميع المعلمات لموافقة IACUC المحلية.
    15. افحص الجمجمة تحت المجهر الجراحي ، وقم بإزالة الفأر من الدراسة إذا حدث كسر في الجمجمة.
    16. بالنسبة للجراحة الوهمية ، اتبع نفس الإجراءات الموضحة أعلاه ، بما في ذلك وضع الحيوان تحت الصدمة ، ولكن دون تقديم تأثيرات إصابات الدماغ الرضية.
    17. بعد حقوق الماوس نفسه من وضع ضعيف إلى وضع الانبطاح بعد تأثير TBI 10 ، ضع الماوس في غرفة تحريض isoflurane لمدة ~ 5 دقائق. اتبع الخطوات 2.2.6-2.2.8 لوضع رأس الماوس على الإطار التجسيمي لجراحة زرع نافذة الجمجمة الموضحة أدناه.

3. جراحة زرع نافذة الجمجمة

ملاحظة: تم اعتماد خطوات زرع نافذة الجمجمة أدناه من Goldey et al.9 ، وتم تطبيق مواصفاتها الخاصة بعمود الرأس وبئر التصوير هنا.

  1. إعداد النافذة
    ملاحظة: أكمل إعداد النافذة في الخطوة 2.2.2 قبل البدء في جراحة إصابات الدماغ الرضية. النافذة مصنوعة من غطاءين زجاجيين دائريين (أحدهما بقطر 3 مم والآخر 5 مم ، كما هو موضح في الشكل 2C) مرتبطان ببعضهما البعض بواسطة مادة لاصقة بصرية شفافة ، كما هو موضح أدناه.
    1. عقم أغطية الزجاج عن طريق غمرها في 75٪ إيثانول لمدة 15 دقيقة. أخرج الغطاء الزجاجي من الإيثانول واتركه حتى يجف على سطح معقم (أي غطاء صفيحة معقمة من 24 بئرا) لمدة ~ 10 دقائق.
    2. املأ حقنة الأنسولين بغراء بصري شفاف مع تجنب تكوين الفقاعة. تحت المجهر 1 (جدول المواد) عند تكبير 0.67x ، ضع قطرة صغيرة (~ 1 ميكرولتر) من الغراء البصري في وسط غطاء 5 مم. بعد ذلك ، ضع على الفور غطاء الغطاء مقاس 3 مم في الأعلى ، وقم بتوسيطه باستخدام غطاء 5 مم.
    3. اضغط برفق باستخدام ملقط ناعم لنشر الغراء بالتساوي. تخلص من النافذة الزجاجية إذا تشكلت فقاعة أو جدار حول انزلاق الغطاء مقاس 3 مم.
    4. لعلاج الغراء ، ضع أغطية الأغطية في صندوق الأشعة فوق البنفسجية لمدة 150 ثانية بقوة 20 × 100 μJ / سم2. تأكد من أن سلكي الغطاء مرتبطان بإحكام ، باستخدام ملقط 4 لدفع جانب الانزلاق 3 مم برفق. إذا تحرك غطاء الغطاء ، فضعه مرة أخرى في صندوق الأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 ثانية إضافية. قم بتخزين النافذة الزجاجية في لوحة معقمة من 24 بئرا لاستخدامها لاحقا.
  2. خشن سطح الجمجمة.
    ملاحظة: من الآن فصاعدا ، نفذ جميع الخطوات الواردة في القسم 3 تحت المجهر الجراحي. ابدأ ب 10x ، واضبط على التكبير المطلوب.
    1. قم بحفر سطح الجمجمة برفق وببطء باستخدام لقمة كربيد FG4 بسرعة دوارة منخفضة (أي رقم الإخراج مضبوط على ~ 1-2) لإزالة السمحاق المتبقي وإنشاء سطح جمجمة خشن ، بحيث يرتبط الأسمنت السني بإحكام مع الجمجمة. يمكن أيضا استخدام المشرط هنا بدلا من المثقاب كبديل.
    2. استخدم محلول ملحي لطرد وإزالة غبار العظام من سطح الجمجمة.
  3. افصل العضلات.
    ملاحظة: يعمل فصل العضلات على زيادة مساحة سطح عظم الجمجمة المكشوف الذي سيكون بمثابة نقطة اتصال لأسمنت الأسنان ، وبالتالي ضمان السلامة الهيكلية للزرع. عادة ما تكشف خطوة فصل العضلات هذه ~ 3 مم من صفيحة الجمجمة الصدغية.
    1. في حوالي 5 مم خلف العين ، حيث يوجد الخيط الذي يربط الجمجمة الجدارية والصدغية ، أدخل الأطراف الدقيقة المغلقة برفق (# 5/45 ملقط) لفصل العضلات الجانبية عن الجمجمة ، وحرك الأطراف المغلقة برفق في الاتجاه الخلفي حتى خياطة لامبويد.
    2. افصل العضلات الجانبية على الجانب الذي سيحدث فيه زرع نافذة الجمجمة.
      ملاحظة: احرص على عدم فصل العضلات قريبة جدا من العين, لتجنب إصابة الشريان العيني; خلاف ذلك ، قد يحدث نزيف حاد ومستمر. لا تفصل العضلات عن العظم القذالي ، لأن الفأر يتطلب هذه العضلات لرفع رأسه.
    3. اغسل الحطام من موقع الجراحة باستخدام محلول ملحي وجفف المنطقة بالشاش. يمكن تطبيق رغوة الجل على موقع الجراحة لوقف النزيف.
  4. زرع عمود الرأس.
    1. استخدم عمود رأس من التيتانيوم مصنوع خصيصا (الشكل 2 د) ، الموصوف في منشور سابق9 ، لإصلاح رأس الماوس بشكل آمن أثناء إجراء جراحة حج القحف ، وللتصوير اللاحق ثنائي الفوتون.
    2. استخدم قلم تحديد وفرجار جراحي لتتبع محيط حج القحف على الجمجمة النظيفة والجافة على الجانب الأيمن. النقطة المركزية للدائرة المتتبعة هي 2.5 مم خلف Bregma و 1.5 مم من الدرز السهمي في نصف الكرة الأيمن. يبلغ قطر الدائرة المتتبعة حوالي 3.2-3.5 مم ، وهو أكبر قليلا من الغطاء الزجاجي 3 مم. تأكد من أن دائرة حج القحف يمكن أن تغطي مواقع حقن الفيروس (يمكن استخدام الثقبين اللذين تم إجراؤهما أثناء حقن الفيروس كمرجع) وموقع TBI.
    3. قم بفك شريط الأذن وتدوير الرأس بحيث تكون طائرة حج القحف أفقية تماما ، ثم شد شريط الأذن مرة أخرى.
    4. استخدمي العصا الخشبية لأداة التطبيق ذات الرأس القطني لإضافة قطرتين صغيرتين من الغراء الفائق إلى الحافة الأمامية والخلفية لعمود الرأس.
    5. ضع عمود الرأس المصنوع من التيتانيوم فوق مركز حج القحف ، واضبطه بسرعة للراحة داخل نفس المستوى حيث سيتم زرع نافذة الجمجمة. ضع ضغطا خفيفا حتى يجف الغراء الفائق ؛ هذا عادة ما يستغرق ~ 30 ثانية.
    6. تحضير الأسمنت السني في طبق خلط سيراميك مبرد مسبقا (البقاء لمدة 10 دقائق على الأقل في الفريزر -20 درجة مئوية): يمزج 300 مجم من مسحوق الأسمنت وست قطرات من السائل الأساسي السريع وقطرة واحدة من المحفز ، ثم يقلب الخليط حتى يمتزج جيدا (~ 15 مرة).
      ملاحظة: يجب أن يكون الأسمنت فطيرا. إذا كان رقيقا جدا ، حرك القليل من مسحوق الأسمنت. إذا كان سميكا جدا ، قلبي في سائل قاعدة سريعة قطرة واحدة في كل مرة حتى يتحقق تناسق فطيرة.
    7. ضع كمية وفيرة من خليط الأسمنت السني بسرعة على المحيط الخارجي للمحيط المتتبع ، وقم بتغطية أي سطح عظمي مكشوف. ومع ذلك ، لا تغطي موقع حج القحف. اترك ~ 15 دقيقة حتى يجف الأسمنت السني ويتصلب قبل المتابعة.
    8. حرر قضيب الأذن وقم بتثبيت عمود الرأس بالإطار المعدني للتأكد من أن الرأس مستقر للحفر الدقيق على طول محيط حج القحف المحدد. إذا كان هناك أسمنت فوق موقع حج القحف ، فاستخدم لقمة كربيد FG4 لحفرها وإزالتها.
  5. حج القحف
    1. استخدم الفرجار الجراحي للتحقق من قطر الدائرة المحددة ، كما هو محدد في الخطوة 3.4.2. اضبط حسب الضرورة ، بحيث تتناسب نافذة الجمجمة بشكل مريح داخل حج القحف.
    2. باستخدام مثقاب الأسنان الكهربائي ، قم بحفر الجمجمة ورقفها على طول الجزء الخارجي من الدائرة المحددة ، باستخدام بت كربيد FG4 أولا (تم ضبط السرعة على الإخراج ~ 9-10). هذا يخلق "مسارا" يتم من خلاله ترقق الجمجمة.
      تنبيه: لتقليل الإصابة الحرارية وتحقيق مسار سلس ، استمر في تحريك لقمة الحفر. لا تحفر نفس المكان لأكثر من 2 ثانية.
    3. بشكل دوري ، توقف عن الحفر وقم بري المنطقة بأكملها بمحلول ملحي معقم ، لتقليل التسخين من المثقاب وغسل غبار العظام.
    4. استمر في ترقق الجمجمة باستخدام لقمة كربيد FG1 / 4 ، كما هو موضح في الخطوة 3.5.2 ، حتى تصبح الجمجمة رقيقة وشفافة.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي استخدام اليدين لحمل المثقاب إلى تسهيل التحكم في المثقاب وتجنب إدخال لقمة الحفر في الدماغ.
    5. أكمل ترقق الجمجمة باستخدام بت كربيد EF4. عندما يحدث صدع بين السديلة العظمية وعظم الجمجمة المحيط ، في بعض الأحيان يكون هناك إطلاق للسائل الشوكي الدماغي (CSF) ، مما يشير إلى أن الجمجمة قد تم حفرها بالكامل.
    6. استمر في التخفيف والحفر عبر بقية الجمجمة على طول المسار. تجنب الحفر من خلال النقطة التي تتقاطع فيها الأوعية الدموية الواضحة تحت الجمجمة لمنع النزيف.
    7. أدخل طرف ملقط ناعم (ملقط 1) ~ 0.5 مم من خلال المكان المتصدع ، وارفع رفرف العظم برفق لأعلى دون وضع مسافة بادئة للدماغ الأساسي.
    8. بعد إزالة رفرف العظام ، قم بري منطقة حج القحف بالمحلول الملحي. يمكن أن يكون سطح الدماغ أعلى بمقدار 1-2 مم من حافة حج القحف.
    9. بدءا من هذه الخطوة ، قم دائما بتغطية الدماغ المكشوف بمحلول ملحي لحماية أنسجة المخ.
    10. قد يحدث النزيف عند رفع رفرف العظم في مواقع حقن AAV الأصلية بسبب التصاق الأنسجة ونمو الأوعية الدموية بعد جراحة الحقن. إذا حدث هذا ، فاضغط برفق على الموقع باستخدام قضيب قطني جاف لمدة ~ 2 دقيقة (أو أطول حسب الحاجة). يمكن استخدام رغوة الجل لوقف النزيف. لا تستخدم المواد الكيميائية أو ملقط التدفئة لوقف النزيف ، لأن هذا يمكن أن يسبب إصابة.
    11. استخدم الملقط 1 لإزالة المادة العنكبوتية المرئية برفق.
  6. نافذة زجاجية مزروعة
    1. استخدم الملقط الجراحي 2 لالتقاط النافذة الزجاجية المعقمة ، مع توجيه الغطاء الزجاجي مقاس 3 مم لأسفل. ضع النافذة الزجاجية واضبطها فوق موقع حج القحف للتأكد من أن النافذة يمكن أن تتناسب بشكل مريح مع حافة حج القحف. الغطاء الزجاجي 5 مم في الأعلى.
    2. تحضير الأسمنت الأسنان على النحو التالي: الجمع بين 100 ملغ من مسحوق الأسمنت ، وقطرتين من السائل الأساسي السريع ، وقطرة واحدة من المحفز. حرك الخليط حتى يمتزج جيدا (~ 15 مرة). انتظر ~ 6 دقائق حتى يصبح الأسمنت فطيرة وسميكة. إذا كان الأسمنت رقيقا جدا ، فقد يتسرب إلى المساحة الموجودة أسفل النافذة في الخطوة 3.6.4 ويحجب النافذة.
    3. أثناء انتظار أن يصبح الأسمنت فطيرة وسميكة ، قم بتطبيق كمية كافية من الضغط على النافذة من خلال مناور تجسيمي ، للتحقق من أن الجمجمة يمكنها الاتصال بالنافذة الزجاجية بشكل آمن وإحكام. تأكد من أن سائل الأسمنت السني في الخطوة 3.6.4 لن يصل إلى المساحة الموجودة أسفل الزجاج وبالتالي يحجب النافذة.
    4. استخدم فرشاة تطبيق دقيقة قابلة للتعديل لإضافة كمية صغيرة من الأسمنت بجانب حافة النافذة لإغلاق النافذة الزجاجية بالجمجمة. انتظر لمدة ~ 10 دقائق حتى يجف الأسمنت تماما ، ثم حرر المناور برفق وقم بإزالته أعلى النافذة. اعتبارا من هذه الخطوة ، يستغرق الأمر ~ 4 ساعات لإنهاء تأثيرات 10 TBI وزرع عمود الرأس ونافذة الجمجمة.
    5. قم بقص الأسمنت السني باستخدام مثقاب الأسنان باستخدام لقمة كربيد FG4 إذا كان هناك أسمنت زائد يغطي النافذة.
      ملاحظة: قد يمنع الأسمنت المفرط حول النافذة العدسات الشيئية ثنائية الفوتون من الاقتراب من سطح النافذة.
  7. زرع بئر التصوير
    ملاحظة: بئر التصوير (الشكل 2D) عبارة عن حلقة مطاطية بقطر خارجي ~ 1.6 سم ، تتطابق مع السطح العلوي لعمود الرأس وتحمل الماء فوق نافذة الجمجمة للتصوير ثنائي الفوتون.
    1. بعد اكتمال عملية زرع النافذة ، قم بحفر حطام الأسمنت السني على السطح العلوي للعمود الأمامي ، ونظف المنطقة باستخدام شاش جراحي مبلل. اترك المنطقة تجف لمدة ~ 3 دقائق.
    2. استخدمي أداة تطبيق قطنية لغمس كمية صغيرة من الغراء الفائق ولصقها على السطح العلوي لعمود الرأس. ضع الحلقة المطاطية بسرعة على عمود الرأس. ضع ضغطا متوسطا على الحلقة المطاطية لمدة ~ 2 دقيقة لضمان الاتصال الوثيق بعمود الرأس. استخدم superglue باعتدال ، وإلا فإنه يمكن أن يلتصق بالنافذة الزجاجية ويحجب التصوير ثنائي الفوتون.
  8. إعطاء المسكنات والمضادات الحيوية
    1. مباشرة بعد زرع التصوير جيدا، ولكن قبل التوقف عن تناول الأيزوفلوران، يتم تطبيق سيفازولين [500 ملغ/كغ (333 ملغ/مل، عادة ~45 ميكرولتر)، في العضل]، وميلوكسيكام (5 ملغ/كغ، تحت الجلد) باستخدام محاقن الأنسولين التي تستخدم لمرة واحدة.
    2. بعد تناول الدواء ، توقف عن التخدير ، وحرر الماوس من الإطار التجسيمي ، وأعد الماوس إلى قفصه المنزلي ، الموجود فوق بطانية التدفئة.
    3. راقب الماوس عن كثب لمدة ~ 15 دقيقة حتى يصبح متنقلا.
      ملاحظة: إيواء الفئران بشكل فردي ، لأنها قد تعض بئر التصوير المطاطي للفئران الأخرى. توفير الغذاء وهلام الماء بالقرب من الماوس في القفص للوصول إلى ad libitum.
    4. تطبيق البوبرينورفين (1 ملغ/كغ، تحت الجلد) وميلوكسيكام (5 ملغ/كغ، تحت الجلد) مرة أخرى كل 8 ساعات بعد الجرعة السابقة حتى 48 ساعة بعد جراحة زرع نافذة الجمجمة.

4. التصوير ثنائي الفوتون داخل الجسم

  1. استخدم المجهر 2 (جدول المواد) ، المجهز بليزر متعدد الفوتونات متماسك قابل للضبط وهدف تكبير 20x (NA 1.0 ؛ غمر الماء) ، للتصوير داخل الجسم18. المرشح المستخدم لإشارة EGFP هو "BP 500-550".
  2. إعداد الماوس نافذة الجمجمة للتصوير داخل الجسم.
    1. بدءا من يوم الجراحة (المحدد في اليوم 0) ، قم بإجراء تصوير ثنائي الفوتون في نقاط زمنية مصممة بعد إصابات الدماغ الرضية. ضع فأرة النافذة القحفية في غرفة تحريض التخدير ، وقم بتطبيق 3٪ إيزوفلوران ممزوج بالغاز الناقل بمعدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: يمكن أن يكون الغاز الناقل إما هواء الغرفة أو أكسجين 100٪.
    2. بمجرد تخدير الفأر بالكامل (أي معدلات التنفس البطيئة ولكن الثابتة في دورة واحدة تقريبا لكل 2 ثانية ، إلى جانب عدم وجود منعكس قرصة الذيل) ، قم بإزالة الماوس من غرفة الحث وقم بتثبيت عمود الرأس بسرعة على قوس. دع جذع الماوس يوضع على صفيحة بلاستيكية مستديرة (قطرها 19 سم) مزودة بالحامل.
      ملاحظة: تم وضع وسادة دافئة يدويا أسفل جذع الماوس لتوفير الدعم الحراري أثناء التصوير داخل الجسم.
    3. ضع مرهم مزلق للعين على عيون الفأر وضع مخروط أنف أنبوب التخدير فوق خطم الفأر. الحفاظ على التخدير باستخدام 1.5٪ إيزوفلوران مع الغاز الناقل بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة.
    4. تحقق بشكل دوري من وتيرة التنفس ، وقم بقرص الذيل أو إصبع القدم كل 15 دقيقة على الأقل طوال التصوير لتقييم التخدير المناسب. اضبط تركيز الأيزوفلوران حسب الاقتضاء للحفاظ على عمق التخدير المطلوب.
    5. قم بمحاذاة رأس الماوس للتأكد من أن نافذة الجمجمة تقع مباشرة أسفل العدسة الشيئية ثنائية الفوتون. أضف بعض الماء إلى التصوير فوق نافذة الجمجمة. خفض الهدف بحيث يتم غمرها في الماء.
  3. التصوير داخل الجسم لفئران النافذة داخل الجمجمة
    1. قم بتشغيل مصباح الزئبق النطاقي. عرض الدماغ مع epifluorescence من خلال العين أولا.
      ملاحظة: تظهر الأوعية الدموية باللون الأسود. حدد منطقة تكون فيها النافذة واضحة. قم بإيقاف تشغيل epifluorescence ، واضبط الطول الموجي لليزر على 860 نانومتر لإشارة EGFP ، واضبط إعداد الليزر للحصول على إشارة مثالية (أي ساطعة ولكن غير مشبعة).
    2. اضبط وضع المسح الضوئي على Frame وخطوة الخط على 1. اضبط متوسط الرقم على 16 ، وعمق البت على 8 بت ، والوضع على أنه خط ، والطريقة على أنها متوسط.
    3. استخدم نمط الأوعية الدموية ك "خريطة مرجعية" لتصوير نفس منطقة الدماغ للتصوير الطولي اللاحق. تخيل المستوى السطحي (الطبقة الأولى ، أقل من 100 ميكرومتر من سطح السحائي) لثلاث مستويات حيث تهيمن الأوعية الدموية القشرية من خلال وضع z-stack ، مع فاصل زمني بين المستويات يبلغ 10 ميكرومتر ، كما هو موضح في الشكل 3A.
    4. صورة ست طائرات على المستوى العميق (الطبقة الرابعة والخامسة ، ~ 400 ميكرومتر أعمق من المستوى السطحي) ، من خلال وضع z-stack كما هو موضح في الشكل 3A ، مع فاصل زمني بين المستويات يبلغ 10 ميكرومتر وسرعة مسح 8.
    5. بعد الانتهاء من التصوير (~ 20 دقيقة لكل ماوس) ، توقف عن التخدير ، وحرر الماوس من الإطارات ، وأعده إلى قفصه المنزلي الموجود فوق بطانية التدفئة. راقب الماوس على التوالي حتى يصبح متنقلا ، والذي يستغرق عادة ~ 7 دقائق.
    6. قم بتصوير الماوس طوليا في اليوم 0 و 1 أسبوع و 4 أشهر بعد جراحة إصابات الدماغ الرضية.

النتائج

كدليل على مفهوم هذا البروتوكول ، تم حقن الجسيمات الفيروسية التي تعبر عن AAV-Syn1-EGFP في قشرة الدماغ لذكور الفئران TDP-43 Q331K/ Q331K (خلفية C57BL / 6J) 19 في عمر 3 أشهر. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن أيضا استخدام الحيوانات البرية C57BL / 6J ، ولكن تم إجراء هذه الدراسة في الفئران TDP-43 Q331K/ Q331K لأن ...

Discussion

في هذه الدراسة ، تم الجمع بين حقن AAV ، وإدارة TBI ، وعمود الرأس مع زرع نافذة الجمجمة لتحليل التصوير الطولي للخلايا العصبية التي تحمل علامة EGFP داخل قشرة دماغ الفأر (الطبقات الرابعة والخامسة) لمراقبة آثار TBI على الخلايا العصبية القشرية. تشير هذه الدراسة إلى أن موقع TBI المختار هنا ، فوق الحصين ، ي...

Disclosures

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر الدكتور ميغيل سينا إستيفيس من كلية الطب بجامعة ماساتشوستس تشان لإهدائه فيروس AAV (PHP.eB) -Syn1-EGFP ، وديبرا كاميرون في كلية الطب بجامعة ماساتشوستس تشان لرسم رسم جمجمة الفئران. كما نشكر الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبرات Bosco و Schafer و Henninger على اقتراحاتهم ودعمهم. تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الدفاع (W81XWH202071 / PRARP) إلى DAB و DS و NH.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adjustable Precision Applicator BrushesParkellS379
BD insulin syringeBDNDC/HRI#08290-3284-385/16" x 31G
BetadinePurdueNDC67618-151-17including 7.5% povidone iodine
BuprenorphinePAR PharmaceuticalNDC 42023-179-05
CefazolinHIKMA PharmaceuticalNDC 0143-9924-90
Ceramic Mixing DishParkellSKU: S387For dental cement preparation
Cotton Tipped ApplicatorsZOROcatlog #: G9531702
CatalystParkellS371full name: "C" Universal TBB Catalyst
Dental cement powderParkellS396Radiopaque L-Powder for C&B Metabond
Dental drillForedomH.MH-130
Dental drill controllerForedomHP4-310
DexamethasonePhoenixNDC 57319-519-05
EF4 carbide bitMicrocopyLot# C150113Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2
EthonalFisher Scientific04355223EA75%
FG1/4 carbide bitMicrocopyLot# C150413Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4
FG4 carbide bitMicrocopyLot# C150309Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1
HeadpostN/AN/ACustom-manufactured
Heating apparatusCWETC-1000 Mouseequiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery
Heating blanketCVS pharmacyE12107extra heating device and be used after surgery
IsofluranePivetalNDC 46066-755-03
Isoflurane induction chamberVetequip89012-688induction chamber for short
Isoflurane volatilizing machineVetequip911103
Isoflurane volatilizing machine holderVetequip901801
Leica surgical microscopeLeicaLEICA 10450243
Lubricant ophthalmic ointmentPicetalNDC 46066-753-55
Marker penDelascoSMP-BK
MeloxicamNorbrookNDC 55529-040-10
Microinjection pump and its controllerWorld Precision Instrumentsmicro4 and UMP3
Microliter syringeHamiltonHamilton 800141701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3
Mosquito forcepsCAROLINAItem #:625314Stainless Steel, Curved, 5 in
Depilatory agentMcKesson CorporationN/ANair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion
Microscope 1NikonSMZ745Nikon microscope for cranial window preparation
Microscope 2ZeissLSM 7 MPtwo-photon microscope
Multiphoton laserCoherentChameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18Wlaser for two-photon microscopy
Non-absorbable surgical sutureHarvard Apparatuscatlog# 59-68606-0, with round needle
Norland Optical Adhesive 81Norland ProductsNOA 81
No-Snag Needle HolderCAROLINAItem #: 567912
Quick base liquidParkellS398"B" Quick Base For C&B Metabond
Regular scissor 1Eurostateurostat es5-300
Regular scissor 2World Precision InstrumentsNo. 501759-G
Round cover glass 1Warner instrumentsCS-5R Cat# 64-0700for 5 mm of diameter
Round cover glass 2Warner instrumentsCS-3R Cat# 64-0720for 3 mm of diameter
Rubber ringsOrings-OnlineItem # OO-014-70-50O-Rings
SalineBioworldL19102411PR
Spring scissor 1World Precision InstrumentsNo. 91500-09tip straight
Spring scissor 2World Precision InstrumentsNo. 91501-09tip curved
Stereotaxic platformKOPFModel 900LS
Super glueHenkelItem #: 1647358
surgical CaliperWorld Precision InstrumentsNo. 501200
Surgical forceps 1ELECTRON MICROSCOPY SCIENCESCatlog# 0508-5/45-POstyle 5/45, curved
Surgical forceps 2ELECTRON MICROSCOPY SCIENCEScatlog# 0103-5-POstyle 5, straight
Surgical forceps 3ELECTRON MICROSCOPY SCIENCEScatlog# 72912
Surgical forceps 4ELECTRON MICROSCOPY SCIENCESCatlog# 0508-5/45-POstyle 5/45, curved
Surgical gauzeZOROcatlog #: G0593801
Surgical lampLeicaLeica KL300 LED
UV boxSpectrolinkerXL-1000also called UV crosslinker
VaporguardVetequip931401
Vetbond Tissue Adhesive3M Animal CarePart Number:014006

References

  1. Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
  2. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. . Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).
  3. Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
  4. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  5. Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
  6. McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
  7. Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
  8. Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
  9. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  10. Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
  11. von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
  12. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
  15. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  17. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
  18. Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
  19. White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
  20. Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
  21. Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
  22. Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
  23. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  24. Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
  25. Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
  26. Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
  27. Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
  28. Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601 (2020).
  29. Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
  30. Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

AAV EGFP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved