Imagerie intravitale de l’expression de protéines fluorescentes chez des souris présentant un traumatisme crânien à crâne fermé et une fenêtre crânienne à l’aide d’un microscope à deux photons

Résumé

Cette étude démontre l’administration d’un traumatisme crânien répétitif à des souris et l’implantation simultanée d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie intravitale ultérieure d’un EGFP exprimé par neurone à l’aide de la microscopie à deux photons.

Résumé

L’objectif de ce protocole est de démontrer comment visualiser longitudinalement l’expression et la localisation d’une protéine d’intérêt dans des types cellulaires spécifiques du cerveau d’un animal, lors d’une exposition à des stimuli exogènes. Ici, l’administration d’un traumatisme crânien (TCC) à crâne fermé et l’implantation simultanée d’une fenêtre crânienne pour une imagerie intravitale longitudinale ultérieure chez la souris sont montrées. Des souris sont injectées par voie intracrânienne avec un virus adéno-associé (AAV) exprimant une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) sous un promoteur neuronal spécifique. Après 2 à 4 semaines, les souris sont soumises à un traumatisme crânien répétitif à l’aide d’un dispositif de perte de poids au-dessus de l’emplacement d’injection de l’AAV. Au cours de la même séance chirurgicale, les souris sont implantées avec une tige de tête en métal, puis une fenêtre crânienne en verre sur le site d’impact du TCC. L’expression et la localisation cellulaire de l’EGFP sont examinées à l’aide d’un microscope à deux photons dans la même région du cerveau exposée à un traumatisme pendant des mois.

Introduction

Les traumatismes crâniens (TCC), qui peuvent résulter de blessures sportives, de collisions de véhicules et de combats militaires, sont un problème de santé mondial. Les traumatismes crâniens peuvent entraîner des déficits physiologiques, cognitifs et comportementaux, ainsi qu’une invalidité ou une mortalité à vie ^1,2. La gravité des traumatismes crâniens peut être classée comme légère, modérée et sévère, la grande majorité étant un traumatisme crânien léger (75 % à 90 %)³. Il est de plus en plus reconnu que les traumatismes crâniens, en particulier les occurrences répétitives de traumatismes crâniens, peuvent favoriser la dégénérescence neuronale et servir de facteurs de risque pour plusieurs maladies neurodégénératives, notamment la maladie d’Alzheimer (MA), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la démence frontotemporale (DFT) et l’encéphalopathie traumatique chronique (ETC)^4,5,6. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents à la neurodégénérescence induite par les TCC restent flous et représentent donc un domaine d’étude actif. Pour mieux comprendre comment les neurones réagissent et se rétablissent d’un traumatisme crânien, une méthode de surveillance des protéines d’intérêt marquées par fluorescence, en particulier dans les neurones, par imagerie intravitale longitudinale chez la souris après un traumatisme crânien est décrite ici.

À cette fin, cette étude montre comment combiner une intervention chirurgicale pour l’administration d’un traumatisme crânien fermé qui est similaire à ce qui a été rapporté précédemment^7,8, avec une procédure chirurgicale pour l’implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie intravitale en aval^, telle que décrite par Goldey et al⁹. Notamment, il n’est pas possible d’implanter d’abord une fenêtre crânienne et d’effectuer ensuite un TCC dans la même région, car l’impact de la perte de poids qui induit le TCC est susceptible d’endommager la fenêtre et de causer des dommages irréparables à la souris. Par conséquent, ce protocole a été conçu pour administrer le traumatisme crânien, puis implanter la fenêtre crânienne directement sur le site d’impact, le tout au cours de la même séance chirurgicale. L’un des avantages de combiner à la fois le traumatisme crânien et l’implantation de la fenêtre crânienne en une seule séance chirurgicale est la réduction du nombre de fois qu’une souris est soumise à une intervention chirurgicale. De plus, il permet de surveiller la réponse immédiate (c’est-à-dire sur une échelle de temps de quelques heures) à un traumatisme crânien, par opposition à l’implantation de la fenêtre lors d’une séance chirurgicale ultérieure (c’est-à-dire l’imagerie initiale commençant sur une échelle de temps de plusieurs jours après le traumatisme crânien). La fenêtre crânienne et la plateforme d’imagerie intravitale offrent également des avantages par rapport à la surveillance des protéines neuronales par des méthodes conventionnelles telles que l’immunomarquage des tissus fixés. Par exemple, moins de souris sont nécessaires pour l’imagerie intravitale, car la même souris peut être étudiée à plusieurs moments, par opposition à des cohortes distinctes de souris nécessaires pour des points temporels discrets. De plus, les mêmes neurones peuvent être surveillés au fil du temps, ce qui permet de suivre des événements biologiques ou pathologiques spécifiques au sein de la même cellule.

À titre de preuve de concept, l’expression neuronale spécifique de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) sous le promoteur de synapsine est démontrée ici¹⁰. Cette approche peut être étendue à 1) différents types de cellules cérébrales en utilisant d’autres promoteurs spécifiques au type cellulaire, tels que le promoteur de la protéine de base de la myéline (MBP) pour les oligodendrocytes et le promoteur de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) pour les astrocytes,¹¹, 2) différentes protéines cibles d’intérêt en fusionnant leurs gènes avec le gène EGFP, et 3) co-exprimant plusieurs protéines fusionnées à différents fluorophores. Ici, l’EGFP est conditionné et exprimé par l’administration d’un virus adéno-associé (AAV) par injection intracrânienne. Un traumatisme crânien fermé est administré à l’aide d’un dispositif de perte de poids, suivi de l’implantation d’une fenêtre crânienne. La visualisation de l’EGFP neuronal est réalisée à travers la fenêtre crânienne, en utilisant la microscopie à deux photons pour détecter la fluorescence de l’EGFP in vivo. Avec le laser à deux photons, il est possible de pénétrer plus profondément dans le tissu cortical avec un minimum de photodommages, ce qui permet une imagerie longitudinale répétée des mêmes régions corticales au sein d’une souris individuelle pendant des jours et jusqu’aux mois^12,13,14,15. En somme, cette approche combinant une chirurgie de traumatisme crânien avec l’imagerie intravitale vise à faire progresser la compréhension des événements moléculaires qui contribuent à la pathologie de la maladie induite par le TCC^16,17.

Protocole

Tous les protocoles relatifs aux animaux ont été mis en œuvre conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publié par le Comité du National Research Council (États-Unis). Les protocoles ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Chan Medical School (UMMS) de l’Université du Massachusetts (numéro de permis 202100057). En bref, comme le montre le schéma de l’étude (Figure 1), l’animal reçoit une injection virale, un traumatisme crânien, une implantation par fenêtre, puis une imagerie intravitale dans une séquence temporelle.

REMARQUE : Les termes commerciaux ont été supprimés. Veuillez vous référer au tableau des matériaux pour connaître l’équipement spécifique utilisé.

1. Injection intracrânienne d’AAV à l’aide d’un dispositif stéréotaxique

1. AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
   1. Utilisez un titre viral de 1 x 10¹³ génomes viraux par millilitre (vg/mL). Syn1 fait référence à Synapsin1, qui est un promoteur neuronal spécifique permettant une expression virale restreinte dans les neurones. Le virus peut être préparé en interne ou externalisé.
2. Préparation à la chirurgie d’injection stéréotaxique pour l’administration d’AAV
   1. Autoclavez des ciseaux ordinaires, un pied à coulisse chirurgical, des ciseaux à ressort chirurgicaux, des pinces chirurgicales, des pinces à moustiques, de la gaze, un applicateur à embout en coton et une seringue en verre d’un microlitre.
   2. Désinfectez la zone de chirurgie en utilisant de l’éthanol à 75 %. Élargissez le champ chirurgical stérile jetable pour couvrir la région chirurgicale sur la plate-forme stéréotaxique.
      REMARQUE : Pour maintenir la température corporelle de l’animal pendant la chirurgie d’injection, utilisez un appareil de chauffage régulé par rétroaction.
   3. Pesez et notez le poids corporel de la souris.
   4. Ouvrez le robinet du réservoir d’oxygène et réglez le débit d’oxygène à 1,5 L/min. Ouvrez l’appareil d’anesthésie et réglez la valeur du niveau d’isoflurane sur trois.
      REMARQUE : Le gaz vecteur peut être soit de l’air ambiant, soit de l’oxygène à 100% dans cette étape.
   5. Placez la souris dans la chambre d’induction et laissez-la reposer pendant 5 minutes pour obtenir une anesthésie complète.
   6. Une fois que la souris est complètement anesthésiée (c’est-à-dire que la fréquence respiratoire est lente mais régulière à environ un cycle toutes les 2 s, associée à l’absence d’un réflexe de pincement de la queue), retirez la souris de la chambre d’induction et placez la tête de souris dans le cadre stéréotaxique.
   7. Placez le cône nasal de la tubulure d’anesthésie sur le museau de la souris.
   8. Maintenir l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 1,5 %, avec un gaz vecteur à un débit de 1 L/min jusqu’à la fin de la chirurgie. Vérifiez périodiquement la fréquence respiratoire et effectuez un pincement de la queue ou des orteils au moins toutes les 15 minutes tout au long de la chirurgie pour évaluer l’anesthésie appropriée. Ajustez la concentration d’isoflurane au besoin pour maintenir la profondeur d’anesthésie souhaitée.
   9. Remplissez une seringue d’un microlitre (10 μL) avec la solution virale. Ensuite, fixez la seringue sur la pompe à micro-injecteur adaptée du dispositif stéréotaxique.
3. Chirurgie d’injection
   1. Administrer de la buprénorphine (1 mg/kg, par voie sous-cutanée) à l’aide d’une seringue à insuline jetable et appliquer une pommade ophtalmique lubrifiante sur les yeux de la souris.
   2. Retirez les cheveux du cuir chevelu sur le dessus de la tête en les coupant avec des ciseaux ordinaires 1.
   3. Nettoyez la peau du cuir chevelu avec de la gaze et des applicateurs à embout en coton. Désinfectez la peau en utilisant d’abord de l’éthanol à 75 %, puis de la bétadine. Répétez cette opération trois fois (c’est-à-dire à l’éthanol suivi de la bétadine), en laissant l’application finale de la bétadine sur la peau.
   4. Vérifiez à nouveau la profondeur de l’anesthésie pour vous assurer que la souris est complètement anesthésiée (c’est-à-dire que la fréquence respiratoire est lente mais régulière à environ un cycle toutes les 2 s, associée à l’absence de réflexe de pincement de la queue). Faites une incision de ~1 cm à l’aide de ciseaux ordinaires 2 le long de la ligne médiane pour exposer le crâne pariétal droit, et retirez le périoste à l’aide d’un applicateur à embout en coton.
   5. Marquez deux points sur le crâne à l’aide d’un marqueur aux coordonnées suivantes : point A : 2,5 mm en arrière du Bregma et 1 mm latéralement à la ligne médiane au-dessus de l’hémisphère droit ; point B : 2,5 mm en arrière du Bregma et 2 mm latéralement à la ligne médiane au-dessus de l’hémisphère droit.
   6. Percez soigneusement deux trous à travers le crâne aux coordonnées marquées à l’aide d’une perceuse dentaire électrique avec une mèche en carbure EF4 fine.
      REMARQUE : Veillez à ne pas endommager le tissu cérébral.
   7. Ajustez le cadre stéréotaxique pour aligner l’extrémité de l’aiguille de la seringue microlitre sur le trou du crâne qui est à 1 mm latéralement de la ligne médiane.
   8. Abaissez l’aiguille de la seringue pour qu’elle touche la surface du cerveau, puis définissez cet emplacement comme point zéro (pour l’axe z). Abaissez la pointe de l’aiguille dans le cortex cérébral à une profondeur de 0,5 mm et perfusez lentement 1 μL de la solution virale à une vitesse de 200 nL/min.
   9. Attendez 5 minutes après que la solution virale soit complètement injectée dans le tissu cérébral avant de retirer l’aiguille pour éviter le reflux de la solution.
   10. Retirez lentement l’aiguille de la seringue. Répétez l’injection à l’autre endroit. Suturez l’incision à l’aide d’une suture chirurgicale stérile et non résorbable (calibre 6-0).
   11. Administrer de la céfazoline [500 mg/kg (333 mg/mL, habituellement ~45 μL), par voie intramusculaire] et du méloxicam (5 mg/kg, par voie sous-cutanée) après la chirurgie alors que l’animal est encore anesthésié.
   12. Libérez la souris du cadre stéréotaxique et arrêtez l’anesthésie. Placez la souris dans une cage propre au-dessus d’une couverture chauffante et surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il soit ambulatoire (environ 15 min). Ensuite, transférez-vous dans la cage d’accueil.
   13. Administrer à nouveau de la buprénorphine (1 mg/kg, par voie sous-cutanée) et du méloxicam (5 mg/kg, par voie sous-cutanée) à 8 h, 16 h et 24 h, respectivement, après la première injection de buprénorphine.
       REMARQUE : 2 à 4 semaines après l’injection du virus, la souris reçoit un TCC et une implantation de la fenêtre crânienne au même site que l’injection d’AAV.

2. Administration d’une induction répétitive d’un traumatisme crânien

NOTA : Les paramètres du TCC sont ajustés par rapport aux rapports précédents^7,8, dans lesquels l’impact du TCC n’a été communiqué qu’une seule fois. Le protocole applique ici le même paramètre, sauf que le nombre total d’impact est porté à 10.

1. Équipement TBI
   1. Utiliser un appareil portatif conçu sur mesure pour l’administration d’un traumatisme crânien à crâne fermé (figure 2A) à la tête de la souris sur le côté droit, comme indiqué à la figure 2B.
2. Préparation avant la chirurgie
   1. Équipement chirurgical en autoclave, y compris des ciseaux ordinaires, un pied à coulisse chirurgical, des ciseaux chirurgicaux à ressort, des pinces chirurgicales, des pinces à moustiques, des pièces de poteau de tête, de la gaze et des applicateurs à embout en coton.
   2. Pesez et notez le poids corporel de la souris 2 h avant l’opération. Pour minimiser l’œdème cérébral lors de l’implantation de la fenêtre crânienne, injecter du phosphate sodique de dexaméthasone à une dose de 4,8 mg / kg [2 mg / mL, généralement ~ 70 μl (nécessité d’injecter à deux sites)] dans le muscle quadriceps à l’aide d’une seringue à insuline. Après l’injection de dexaméthasone, mais avant de commencer la chirurgie du traumatisme crânien, préparez les fenêtres en verre comme indiqué à l’étape 3.1 pour une utilisation ultérieure.
   3. Désinfectez l’appareil chirurgical et le matériel de TCC en utilisant de l’éthanol à 75 % et élargissez le champ chirurgical stérile jetable pour couvrir l’étage chirurgical sur la plate-forme stéréotaxique. Allumez l’appareil de chauffage et le moniteur de température en réglant la température cible à 37 °C.
   4. Ouvrez le robinet du réservoir d’oxygène et réglez le débit d’oxygène à 1,5 L/min. Ouvrez l’appareil d’anesthésie et réglez la valeur du niveau d’isoflurane sur trois.
      REMARQUE : L’oxygène pur à 100 % peut aider l’animal à survivre aux impacts du traumatisme crânien.
   5. Placez la souris dans la chambre d’induction et laissez-la reposer pendant 5 minutes pour obtenir une anesthésie complète.
   6. Une fois que la souris est complètement anesthésiée (c’est-à-dire que la fréquence respiratoire est lente mais régulière à environ un cycle toutes les 2 s, associée à l’absence d’un réflexe de pincement de la queue), retirez la souris de la chambre d’induction et placez la tête de souris dans le cadre stéréotaxique.
   7. Placez le cône nasal de la tubulure d’anesthésie sur le museau de la souris.
   8. Maintenir l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 1,5 % mélangé à de l’oxygène pur à 100 % à un débit de 1 L/min jusqu’à la fin de la chirurgie. Vérifiez périodiquement la fréquence respiratoire et effectuez un pincement de la queue ou des orteils au moins toutes les 15 minutes tout au long de la chirurgie pour évaluer l’anesthésie appropriée. Ajustez la concentration d’isoflurane au besoin pour maintenir la profondeur d’anesthésie souhaitée.
3. Chirurgie d’un traumatisme crânien
   1. Administrer de la buprénorphine (1 mg/kg, par voie sous-cutanée) à l’aide de seringues à insuline jetables et appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux de la souris.
   2. Retirez les poils du haut de la tête en les coupant avec des ciseaux 1, puis en appliquant un agent dépilatoire pendant 1 min.
      ATTENTION : Ne pas appliquer le produit dépilatoire pendant plus de 3 min sur le cuir chevelu, car il s’agit d’un irritant cutané. Évitez de mettre de l’agent dépilatoire sur les yeux de la souris.
   3. Nettoyez la peau du cuir chevelu en appliquant de la gaze et des applicateurs à embout de coton. Ensuite, désinfectez la peau, en utilisant d’abord de l’éthanol à 75%, puis de la bétadine. Répétez cette opération trois fois (c’est-à-dire à l’éthanol suivi de la bétadine), en laissant l’application finale de la bétadine sur la peau.
   4. Vérifiez à nouveau la profondeur de l’anesthésie pour vous assurer que la souris est complètement anesthésiée (c’est-à-dire que la fréquence respiratoire est lente mais régulière à environ un cycle toutes les 2 s, associée à l’absence de réflexe de pincement de la queue). Tentez la peau avec une pince chirurgicale 3 et faites une incision médiane de 12 à 15 mm de long à partir d’environ 3 mm en arrière des yeux.
   5. Appliquez l’effet sur la peau sur les hémisphères gauche et droit du crâne à l’aide de ciseaux à ressort 2.
   6. Une fois le crâne exposé, retirez le périoste en frottant doucement avec un applicateur stérile à embout en coton et en rinçant avec une solution saline stérile.
   7. Inspectez visuellement l’état du crâne pour vous assurer qu’il est intact, à l’exception des deux petits trous, qui ont été faits pour la chirurgie d’injection de virus précédente.
   8. Séchez la zone du crâne et marquez le site d’impact du TCC aux coordonnées suivantes : 2,5 mm en arrière du Bregma et 2 mm latéralement de la suture sagittale vers la droite (Figure 2B).
   9. Retirez rapidement la souris du cadre stéréotaxique et placez la tête sur le coussin tampon sous le dispositif TBI.
   10. Alignez la pointe de l’impacteur avec le site d’impact marqué.
   11. Soulevez la colonne métallique en tirant sur la corde en nylon attachée à 15 cm au-dessus de la tête de la souris, puis relâchez-la, en laissant le poids tomber librement sur la tige du transducteur, qui est en contact avec le sommet du crâne à l’endroit du traumatisme crânien. Ne touchez pas la tête de la souris lors de l’impact du TBI.
   12. Déplacez la souris sur la couverture chauffante et placez-la sur le dos tout en surveillant l’état respiratoire.
   13. Une fois que la souris est passée d’une position couchée sur le dos à une position couchée, placez-la dans la chambre d’induction d’isoflurane pendant ~5 min avec 3 % d’isoflurane mélangé à de l’oxygène pur à 100 % à un débit de 1,5 L/min.
   14. Une fois que la souris est complètement sédatée (c’est-à-dire que la fréquence respiratoire est lente mais régulière à environ un cycle toutes les 2 s, associée à l’absence d’un réflexe de pincement de la queue), répétez les étapes 2.3.9 à 2.3.14 pour obtenir un total de 10 impacts.
       REMARQUE : Dix impacts de traumatismes crâniens ont été trouvés pour induire un phénotype robuste avec une faible mortalité des souris dans notre étude (données non encore publiées). Les paramètres peuvent être ajustés pour obtenir une gravité différente de la lésion cérébrale en augmentant ou en diminuant le nombre d’impacts et/ou la hauteur à partir de laquelle le poids est libéré. Tous les paramètres sont soumis à l’approbation de l’IACUC local.
   15. Examinez le crâne au microscope chirurgical et retirez la souris de l’étude si une fracture du crâne s’est produite.
   16. Dans le cas d’une chirurgie simulée, suivez les mêmes procédures que celles décrites ci-dessus, y compris le placement de l’animal sous l’impacteur, mais sans lui infliger les effets du traumatisme crânien.
   17. Une fois que la souris est passée d’une position couchée sur le dos à une position couchée sur le ventre après le 10^e impact du TCC, placez-la dans la chambre d’induction de l’isoflurane pendant ~5 min. Suivez les étapes 2.2.6 à 2.2.8 pour placer la tête de la souris sur le cadre stéréotaxique pour la chirurgie d’implantation de la fenêtre crânienne décrite ci-dessous.

3. Chirurgie d’implantation de la fenêtre crânienne

NOTE : Les étapes d’implantation de la fenêtre crânienne ci-dessous ont été adoptées de Goldey et ^al.9, et leurs spécifications du poteau de tête et du puits d’imagerie ont été appliquées ici.

1. Préparation des fenêtres
   REMARQUE : Terminez la préparation de la fenêtre à l’étape 2.2.2 avant de commencer la chirurgie du TCC. La fenêtre est constituée de deux lamelles de verre rondes (l’une de 3 mm et l’autre de 5 mm de diamètre, comme l’indique la figure 2C) qui sont reliées entre elles par un adhésif optique transparent, comme décrit ci-dessous.
   1. Désinfectez les lamelles de verre en les immergeant dans de l’éthanol à 75 % pendant 15 min. Sortez les lamelles en verre de l’éthanol et laissez-les sécher sur une surface stérile (c’est-à-dire le couvercle d’une plaque stérile à 24 puits) pendant ~10 min.
   2. Remplissez une seringue à insuline de colle optique transparente tout en évitant la formation de bulles. Sous le microscope 1 (Table des matériaux) à un grossissement de 0,67x, placez une petite goutte (~1 μL) de colle optique au centre de la lamelle de 5 mm. Ensuite, placez immédiatement la lamelle de 3 mm sur le dessus et centrez-la avec la lamelle de 5 mm.
   3. Appliquez une pression douce à l’aide d’une pince fine pour étaler la colle uniformément. Jetez la vitre si une bulle ou un mur se forme autour de la lamelle de 3 mm.
   4. Pour durcir la colle, placez les lamelles dans une boîte UV pendant 150 s à une puissance de 20 x 100 μJ/cm². Vérifiez que les deux lamelles sont bien collées, à l’aide de la pince 4, pour pousser doucement le côté de la lamelle de 3 mm. Si la lamelle bouge, remettez-la dans la boîte UV pendant 60 s supplémentaires. Rangez la fenêtre en verre dans une plaque stérile à 24 puits pour une utilisation ultérieure.
2. Rugueux à la surface du crâne.
   REMARQUE : À partir de là, effectuez toutes les étapes de la section 3 sous un microscope chirurgical. Commencez par 10x et ajustez au grossissement souhaité.
   1. Percez doucement et lentement la surface du crâne à l’aide d’un foret en carbure FG4 à une faible vitesse de rotor (c’est-à-dire un numéro de sortie réglé sur ~1-2) pour enlever le périoste restant et créer une surface crânienne rugueuse, de sorte que le ciment dentaire se lie solidement au crâne. Un scalpel peut également être utilisé ici à la place d’une perceuse comme alternative.
   2. Utilisez une solution saline pour rincer et éliminer la poussière osseuse de la surface du crâne.
3. Séparez les muscles.
   REMARQUE : La séparation musculaire sert à augmenter la surface de l’os du crâne exposé qui servira de point de contact pour le ciment dentaire, assurant ainsi l’intégrité structurelle de l’implant. Cette étape de séparation musculaire expose généralement ~3 mm de la plaque crânienne temporale.
   1. À environ 5 mm en arrière de l’œil, là où se trouve la suture reliant le crâne pariétal et temporal, insérez doucement les pointes fines fermées (pince #5/45) pour séparer les muscles latéraux du crâne, et déplacez doucement les pointes fermées dans la direction postérieure jusqu’à la suture lambdoïde.
   2. Séparez les muscles latéraux du côté où l’implantation de la fenêtre crânienne se produira.
      REMARQUE : Veillez à ne pas séparer les muscles trop près de l’œil, pour éviter de blesser l’artère ophtalmique ; sinon, des saignements graves et persistants peuvent survenir. Ne séparez pas les muscles de l’os occipital, car la souris a besoin de ces muscles pour lever la tête.
   3. Lavez les débris du site chirurgical à l’aide d’une solution saline et séchez la zone avec de la gaze. De la mousse de gel peut être appliquée sur le site chirurgical pour arrêter le saignement.
4. Implantez la tige de tête.
   1. Utilisez une tige de tête en titane sur mesure (Figure 2D), décrite dans une publication précédente⁹, pour fixer solidement la tête de la souris lors de la chirurgie de craniotomie et pour l’imagerie à deux photons subséquente.
   2. À l’aide d’un marqueur et d’un pied à coulisse chirurgical, tracez la circonférence de la craniotomie sur le crâne propre et sec du côté droit. Le point central du cercle tracé est à 2,5 mm en arrière du Bregma et à 1,5 mm de la suture sagittale de l’hémisphère droit. Le diamètre du cercle tracé est d’environ 3,2 à 3,5 mm, légèrement plus grand que la lamelle de verre de 3 mm. Assurez-vous que le cercle de craniotomie peut couvrir les sites d’injection du virus (les deux trous faits lors de l’injection du virus peuvent être utilisés comme référence) et le site du TCC.
   3. Desserrez la barre auriculaire et faites pivoter la tête de manière à ce que le plan de la craniotomie soit parfaitement horizontal, puis serrez à nouveau la barre auriculaire.
   4. À l’aide du bâton de bois d’un applicateur à embout en coton, ajoutez deux petites gouttes de superglue sur les bords avant et arrière de la tête de tête.
   5. Positionnez la tige de tête en titane sur le centre de la craniotomie et ajustez-la rapidement pour qu’elle repose dans le même plan que celui où la fenêtre crânienne sera implantée. Appliquez une légère pression jusqu’à ce que la superglue soit sèche ; Cela prend généralement ~30 s.
   6. Préparez le ciment dentaire dans un plat de mélange en céramique pré-refroidi (en restant au moins 10 min dans un congélateur à -20 °C) : mélangez 300 mg de poudre de ciment, six gouttes de liquide de base rapide et une goutte de catalyseur, puis remuez le mélange jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé (~15 fois).
      REMARQUE : Le ciment doit être pâteux. S’il est trop fin, ajoutez un peu plus de poudre de ciment. S’il est trop épais, incorporer le liquide de base rapide une goutte à la fois jusqu’à l’obtention d’une consistance pâteuse.
   7. Appliquez rapidement une quantité généreuse de mélange de ciment dentaire sur le périmètre extérieur de la circonférence tracée et couvrez toute surface osseuse exposée. Cependant, ne couvrez pas le site de la craniotomie. Attendez ~15 min pour que le ciment dentaire sèche et durcisse avant de continuer.
   8. Relâchez la barre d’oreille et fixez la tige de tête au cadre métallique pour vous assurer que la tête est stable pour un perçage précis le long de la circonférence de craniotomie marquée. S’il y a du ciment sur le site de la craniotomie, utilisez le foret en carbure FG4 pour percer et retirer.
5. Craniotomie
   1. Utilisez un pied à coulisse chirurgical pour vérifier le diamètre du cercle marqué, tel que défini à l’étape 3.4.2. Ajustez si nécessaire, de sorte que la fenêtre crânienne s’adapte parfaitement à l’intérieur de la craniotomie.
   2. À l’aide d’une perceuse dentaire électrique, gravez et amincissez le crâne le long de l’extérieur du cercle marqué, en utilisant d’abord une mèche en carbure FG4 (vitesse réglée sur une sortie ~9-10). Cela crée une « piste » à l’intérieur de laquelle amincir le crâne.
      ATTENTION : Pour minimiser les blessures dues à la chaleur et obtenir une piste lisse, continuez à déplacer le foret. Ne percez pas au même endroit pendant plus de 2 s.
   3. Périodiquement, arrêtez de forer et irriguez toute la zone avec une solution saline stérile, afin de réduire l’échauffement de la perceuse et d’éliminer la poussière d’os.
   4. Continuez à amincir le crâne à l’aide d’une mèche en carbure FG1/4, comme décrit à l’étape 3.5.2, jusqu’à ce que le crâne soit mince comme du papier et transparent.
      REMARQUE : L’utilisation des deux mains pour tenir la perceuse peut faciliter le contrôle de la perceuse et éviter d’insérer le foret dans le cerveau.
   5. Complétez l’éclaircissage du crâne à l’aide d’une mèche en carbure EF4. Lorsqu’une fissure se produit entre le lambeau osseux et l’os du crâne environnant, il y a parfois une libération de liquide céphalo-rachidien (LCR), indiquant que le crâne a été complètement percé.
   6. Continuez à éclaircir et à percer le reste du crâne le long de la piste. Évitez de percer à l’endroit où un système vasculaire évident traverse sous le crâne pour éviter les saignements.
   7. Insérez une pointe fine de pince (pince 1) ~0,5 mm à travers l’endroit fissuré et soulevez doucement le lambeau osseux vers le haut sans indenter le cerveau sous-jacent.
   8. Une fois le lambeau osseux retiré, irriguer la zone de craniotomie avec une solution saline. La surface du cerveau peut être de 1 à 2 mm plus haute que le bord de la craniotomie.
   9. À partir de cette étape, couvrez toujours le cerveau exposé avec une solution saline pour protéger le tissu cérébral.
   10. Des saignements peuvent survenir lors du soulèvement du lambeau osseux aux sites d’injection d’AAV d’origine en raison de l’adhérence tissulaire et de la croissance de la vascularisation après la chirurgie d’injection. Si cela se produit, appuyez doucement sur le site avec un applicateur à embout en coton sec pendant ~2 min (ou plus longtemps au besoin). De la mousse de gel peut être utilisée pour arrêter le saignement. N’utilisez pas de produits chimiques ou de pinces chauffantes pour arrêter le saignement, car cela pourrait causer des blessures.
   11. Utilisez la pince 1 pour retirer délicatement la matière arachnoïdienne visible.
6. Fenêtre en verre d’implant
   1. Utilisez la pince chirurgicale 2 pour saisir la fenêtre en verre stérile, avec la lamelle en verre de 3 mm vers le bas. Placez et ajustez la fenêtre en verre au-dessus du site de la craniotomie pour vous assurer que la fenêtre peut s’adapter parfaitement au bord de la craniotomie. La lamelle en verre de 5 mm se trouve sur le dessus.
   2. Préparez le ciment dentaire comme suit : mélangez 100 mg de poudre de ciment, deux gouttes de liquide de base rapide et une goutte de catalyseur. Remuez le mélange jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé (~15 fois). Attendez ~6 min jusqu’à ce que le ciment devienne pâteux et épais. Si le ciment est trop fin, il peut s’infiltrer dans l’espace sous la fenêtre à l’étape 3.6.4 et obscurcir la fenêtre.
   3. En attendant que le ciment devienne pâteux et épais, appliquez une pression adéquate sur la fenêtre à l’aide d’un manipulateur stéréotaxique, pour vérifier que le crâne peut entrer en contact avec la vitre de manière sûre et serrée. Assurez-vous que le liquide de ciment dentaire de l’étape 3.6.4 n’atteindra pas l’espace sous le verre et ne masquera pas ainsi la fenêtre.
   4. Utilisez un pinceau applicateur de précision réglable pour ajouter une petite quantité de ciment le long du bord de la fenêtre afin de sceller la fenêtre en verre avec le crâne. Attendez ~10 min pour laisser le ciment sécher complètement, puis relâchez doucement et retirez le manipulateur au-dessus de la fenêtre. À partir de cette étape, il faut ~4 h pour terminer les 10 impacts du TCC et implanter la tête et la fenêtre crânienne.
   5. Coupez le ciment dentaire à l’aide de la perceuse dentaire avec une mèche en carbure FG4 s’il y a un excès de ciment recouvrant la fenêtre.
      REMARQUE : Un excès de ciment autour de la fenêtre peut empêcher les lentilles d’objectif à deux photons de s’approcher de la surface de la fenêtre.
7. Implanter le puits d’imagerie
   REMARQUE : Un puits d’imagerie (Figure 2D) est un anneau en caoutchouc d’un diamètre extérieur de ~1,6 cm, qui correspond à la surface supérieure du poteau de tête et retient l’eau au-dessus de la fenêtre crânienne pour l’imagerie à deux photons.
   1. Une fois l’implantation de la fenêtre terminée, percez les débris de ciment dentaire sur la surface supérieure du poteau de tête et nettoyez la zone à l’aide d’une gaze chirurgicale humide. Laissez sécher la zone pendant ~3 min.
   2. Utilisez un applicateur à embout en coton pour tremper une petite quantité de superglue et collez-la sur la surface supérieure de la tige de tête. Placez rapidement l’anneau en caoutchouc sur la tige de tête. Appliquez une pression moyenne sur l’anneau en caoutchouc pendant ~2 min pour assurer un contact étroit avec la tête d’affiche. Utilisez la superglue avec parcimonie, sinon elle peut adhérer à la vitre et obscurcir l’imagerie à deux photons.
8. Administration d’analgésiques et d’antibiotiques
   1. Immédiatement après l’implantation du puits d’imagerie, mais avant d’arrêter l’isoflurane, administrer de la céfazoline [500 mg/kg (333 mg/mL, habituellement ~45 μL), par voie intramusculaire] et du méloxicam (5 mg/kg, par voie sous-cutanée) à l’aide de seringues à insuline jetables.
   2. Après l’administration du médicament, arrêtez l’anesthésie, libérez la souris du cadre stéréotaxique et ramenez la souris dans sa cage d’origine, qui se trouve au-dessus d’une couverture chauffante.
   3. Surveillez de près la souris pendant ~15 min jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire.
      REMARQUE : Hébergez les souris individuellement, car elles peuvent mordre le puits d’imagerie en caoutchouc d’autres souris. Fournissez de la nourriture et de l’eau à la souris dans la cage pour qu’elle puisse y accéder ad libitum.
   4. Administrer à nouveau de la buprénorphine (1 mg/kg, par voie sous-cutanée) et du méloxicam (5 mg/kg, par voie sous-cutanée) toutes les 8 h après la dose précédente jusqu’à 48 h après la chirurgie d’implantation de la fenêtre crânienne.

4. Imagerie intravitale à deux photons

1. Utiliser le microscope 2 (Table des matériaux), équipé d’un laser multiphotonique cohérent accordable et d’un objectif à grossissement 20x (NA 1.0 ; immersion dans l’eau), pour l’imagerie intravitale¹⁸. Le filtre utilisé pour le signal EGFP est « BP 500-550 ».
2. Préparez la souris à fenêtre crânienne pour l’imagerie intravitale.
   1. À partir du jour de la chirurgie (désigné comme jour 0), effectuez une imagerie à deux photons aux points de temps prévus après le traumatisme crânien. Placez la souris crânienne dans la chambre d’induction de l’anesthésie et administrez 3 % d’isoflurane mélangé à du gaz vecteur à un débit de 1,5 L/min pendant 5 min.
      REMARQUE : Le gaz vecteur peut être soit de l’air ambiant, soit de l’oxygène à 100%.
   2. Une fois que la souris est complètement anesthésiée (c’est-à-dire que le rythme respiratoire est lent mais régulier à environ un cycle toutes les 2 s, associé à l’absence d’un réflexe de pincement de la queue), retirez la souris de la chambre d’induction et fixez rapidement la tige de tête à un support. Laissez reposer le torse de la souris sur une plaque ronde en plastique (19 cm de diamètre) équipée du support.
      REMARQUE : Un coussinet chaud pour les mains a été placé sous le torse de la souris pour fournir un soutien thermique pendant l’imagerie intravitale.
   3. Appliquez une pommade ophtalmique lubrifiante sur les yeux de la souris et placez le cône nasal de la tubulure d’anesthésie sur le museau de la souris. Maintenir l’anesthésie en utilisant de l’isoflurane à 1,5 % avec du gaz vecteur à un débit de 1 L/min.
   4. Vérifiez périodiquement la fréquence respiratoire et effectuez un pincement de la queue ou des orteils au moins toutes les 15 minutes tout au long de l’imagerie pour évaluer l’anesthésie appropriée. Ajustez la concentration d’isoflurane au besoin pour maintenir la profondeur d’anesthésie souhaitée.
   5. Alignez la tête de la souris pour vous assurer que la fenêtre crânienne se trouve directement sous la lentille de l’objectif à deux photons. Ajoutez un peu d’eau dans le puits d’imagerie au-dessus de la fenêtre crânienne. Abaissez l’objectif de manière à ce qu’il soit immergé dans l’eau.
3. Imagerie intravitale de souris fenêtre intracrânienne
   1. Allumez la lampe au mercure de l’oscilloscope. Visualisez d’abord le cerveau avec l’épifluorescence à travers l’oculaire.
      REMARQUE : Le système vasculaire apparaît noir. Sélectionnez une zone où la fenêtre est dégagée. Désactivez l’épifluorescence, réglez la longueur d’onde du laser sur 860 nm pour le signal EGFP et ajustez le réglage du laser pour un signal optimal (c’est-à-dire lumineux mais pas saturé).
   2. Définissez le mode de numérisation sur Image et le pas de ligne sur 1. Définissez le nombre de moyenne sur 16, la profondeur de bits sur 8 bits, le mode sur Line et la méthode sur Mean.
   3. Utilisez le modèle vasculaire comme « carte de référence » pour imager la même région du cerveau pour l’imagerie longitudinale ultérieure. Imagez le niveau superficiel (couche I, à moins de 100 μm de la surface méningée) pour trois plans où le système vasculaire cortical domine par un mode z-stack, avec un intervalle interplan de 10 μm, comme indiqué à la figure 3A.
   4. Imagez six plans à un niveau profond (couches IV et V, ~400 μm plus profond que le niveau superficiel), à travers un mode z-stack comme indiqué à la figure 3A, avec un intervalle interplan de 10 μm et une vitesse de balayage de 8.
   5. Après avoir terminé l’imagerie (~20 min par souris), arrêtez l’anesthésie, libérez la souris des cadres et remettez-la dans sa cage d’origine qui se trouve au-dessus d’une couverture chauffante. Surveillez la souris consécutivement jusqu’à ce qu’elle soit ambulatoire, ce qui prend généralement ~7 min.
   6. Imagez longitudinalement la souris au jour 0, 1 semaine et 4 mois après la chirurgie du traumatisme crânien.

Résultats

Comme preuve de concept pour ce protocole, des particules virales exprimant AAV-Syn1-EGFP ont été injectées dans le cortex cérébral de souris mâles TDP-43 Q331K/^Q331K (fond C57BL/6J)¹⁹ à l’âge de 3 mois. Il est à noter que les animaux C57BL/6J de type sauvage peuvent également être utilisés, mais cette étude a été réalisée sur des souris TDP-43^Q331K/Q331K car le laboratoire se concentre sur la recherche sur les maladies neurodégénératives. Une chirurgie ...

Discussion

Dans cette étude, l’injection d’AAV, l’administration d’un TBI et un poste de tête avec implantation de fenêtre crânienne ont été combinés pour une analyse d’imagerie longitudinale des neurones marqués à l’EGFP dans le cortex cérébral de la souris (couches IV et V) afin d’observer les effets du TBI sur les neurones corticaux. Cette étude note que le site du TCC choisi ici, au-dessus de l’hippocampe, offre une surface relativement plane et large pour l’implantation de la fenêtre crânienne. ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Precision Applicator Brushes	Parkell	S379
BD insulin syringe	BD	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16" x 31G
Betadine	Purdue	NDC67618-151-17	including 7.5% povidone iodine
Buprenorphine	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
Cefazolin	HIKMA Pharmaceutical	NDC 0143-9924-90
Ceramic Mixing Dish	Parkell	SKU: S387	For dental cement preparation
Cotton Tipped Applicators	ZORO	catlog #: G9531702
Catalyst	Parkell	S371	full name: "C" Universal TBB Catalyst
Dental cement powder	Parkell	S396	Radiopaque L-Powder for C&B Metabond
Dental drill	Foredom	H.MH-130
Dental drill controller	Foredom	HP4-310
Dexamethasone	Phoenix	NDC 57319-519-05
EF4 carbide bit	Microcopy	Lot# C150113	Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2
Ethonal	Fisher Scientific	04355223EA	75%
FG1/4 carbide bit	Microcopy	Lot# C150413	Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4
FG4 carbide bit	Microcopy	Lot# C150309	Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1
Headpost	N/A	N/A	Custom-manufactured
Heating apparatus	CWE	TC-1000 Mouse	equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery
Heating blanket	CVS pharmacy	E12107	extra heating device and be used after surgery
Isoflurane	Pivetal	NDC 46066-755-03
Isoflurane induction chamber	Vetequip	89012-688	induction chamber for short
Isoflurane volatilizing machine	Vetequip	911103
Isoflurane volatilizing machine holder	Vetequip	901801
Leica surgical microscope	Leica	LEICA 10450243
Lubricant ophthalmic ointment	Picetal	NDC 46066-753-55
Marker pen	Delasco	SMP-BK
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10
Microinjection pump and its controller	World Precision Instruments	micro4 and UMP3
Microliter syringe	Hamilton	Hamilton 80014	1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3
Mosquito forceps	CAROLINA	Item #:625314	Stainless Steel, Curved, 5 in
Depilatory agent	McKesson Corporation	N/A	Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion
Microscope 1	Nikon	SMZ745	Nikon microscope for cranial window preparation
Microscope 2	Zeiss	LSM 7 MP	two-photon microscope
Multiphoton laser	Coherent	Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W	laser for two-photon microscopy
Non-absorbable surgical suture	Harvard Apparatus	catlog# 59-6860	6-0, with round needle
Norland Optical Adhesive 81	Norland Products	NOA 81
No-Snag Needle Holder	CAROLINA	Item #: 567912
Quick base liquid	Parkell	S398	"B" Quick Base For C&B Metabond
Regular scissor 1	Eurostat	eurostat es5-300
Regular scissor 2	World Precision Instruments	No. 501759-G
Round cover glass 1	Warner instruments	CS-5R Cat# 64-0700	for 5 mm of diameter
Round cover glass 2	Warner instruments	CS-3R Cat# 64-0720	for 3 mm of diameter
Rubber rings	Orings-Online	Item # OO-014-70-50	O-Rings
Saline	Bioworld	L19102411PR
Spring scissor 1	World Precision Instruments	No. 91500-09	tip straight
Spring scissor 2	World Precision Instruments	No. 91501-09	tip curved
Stereotaxic platform	KOPF	Model 900LS
Super glue	Henkel	Item #: 1647358
surgical Caliper	World Precision Instruments	No. 501200
Surgical forceps 1	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	Catlog# 0508-5/45-PO	style 5/45, curved
Surgical forceps 2	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	catlog# 0103-5-PO	style 5, straight
Surgical forceps 3	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	catlog# 72912
Surgical forceps 4	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	Catlog# 0508-5/45-PO	style 5/45, curved
Surgical gauze	ZORO	catlog #: G0593801
Surgical lamp	Leica	Leica KL300 LED
UV box	Spectrolinker	XL-1000	also called UV crosslinker
Vaporguard	Vetequip	931401
Vetbond Tissue Adhesive	3M Animal Care	Part Number:014006