使用双光子显微镜对闭合颅骨创伤性脑损伤和颅窗小鼠荧光蛋白表达进行活体成像

摘要

这项研究表明，向小鼠提供重复性创伤性脑损伤，并同时植入颅窗，以便随后使用双光子显微镜对神经元表达的 EGFP 进行活体成像。

摘要

该协议的目标是演示在暴露于外源性刺激后，如何纵向可视化动物大脑特定细胞类型中目标蛋白的表达和定位。在这里，显示了闭合颅骨创伤性脑损伤（TBI）的施用和同时植入颅窗以进行随后的小鼠纵向活体成像。向小鼠颅内注射在神经元特异性启动子下表达增强绿色荧光蛋白（EGFP）的腺相关病毒（AAV）。2至4周后，在AAV注射位置使用体重下降装置对小鼠进行重复TBI。在同一手术过程中，将小鼠植入金属头柱，然后在TBI撞击部位植入玻璃颅窗。使用双光子显微镜在暴露于创伤的同一大脑区域检查EGFP的表达和细胞定位，历时数月。

引言

创伤性脑损伤 （TBI） 可由运动损伤、车辆碰撞和军事战斗引起，是一个全球性的健康问题。TBI 可导致生理、认知和行为缺陷，以及终身残疾或死亡 ^1,2。TBI 的严重程度可分为轻度、中度和重度，绝大多数为轻度 TBI （75%-90%）³。人们越来越认识到，TBI，特别是TBI的重复发生，可以促进神经元变性，并成为多种神经退行性疾病的危险因素，包括阿尔茨海默病（AD），肌萎缩侧索硬化症（ALS），额颞叶痴呆（FTD）和慢性创伤性脑病（CTE）^4,5,6.然而，TBI诱导的神经退行性变的分子机制仍不清楚，因此是一个活跃的研究领域。为了深入了解神经元如何对 TBI 做出反应并从中恢复，本文描述了一种在 TBI 后通过纵向活体成像在小鼠中监测荧光标记的目标蛋白的方法，特别是在神经元内。

为此，本研究展示了如何将用于闭合颅骨 TBI 的外科手术（类似于之前报道的^7,8）与植入颅内窗口的外科手术相结合^，用于下游活体成像，如 Goldey 等人所述⁹.值得注意的是，先植入颅窗，然后在同一区域进行TBI是不可行的，因为诱发TBI的体重下降的影响可能会损坏颅窗并对小鼠造成无法弥补的伤害。因此，该方案旨在在同一手术过程中进行 TBI，然后将颅窗直接植入撞击部位。在一次手术中结合 TBI 和颅窗植入的一个优点是减少了小鼠接受手术的次数。此外，它允许人们监测对 TBI 的即时反应（即，在小时的时间尺度上），而不是在以后的手术过程中植入窗口（即，在 TBI 后几天的时间尺度上开始初始成像）。与通过固定组织免疫染色等传统方法监测神经元蛋白相比，颅窗和活体成像平台也具有优势。例如，活体成像需要较少的小鼠，因为同一只小鼠可以在多个时间点进行研究，而不是在离散时间点需要单独的小鼠队列。此外，可以随着时间的推移监测相同的神经元，从而允许跟踪同一细胞内的特定生物学或病理事件。

作为概念证明，这里证明了突触蛋白启动子下增强的绿色荧光蛋白 （EGFP） 的神经元特异性表达¹⁰。这种方法可以扩展到 1） 通过利用其他细胞类型特异性启动子来扩展不同的脑细胞类型，例如少突胶质细胞的髓鞘碱性蛋白 （MBP） 启动子和星形胶质细胞的神经胶质纤维酸性蛋白 （GFAP） 启动子¹¹ ，2） 通过将其基因与 EGFP 基因融合不同的目标蛋白，以及 3） 共表达融合到不同荧光团的多种蛋白质。在这里，EGFP 通过颅内注射通过腺相关病毒 （AAV） 递送进行包装和表达。使用减重装置进行闭合性颅骨 TBI，然后植入颅窗。神经元EGFP的可视化是通过颅窗实现的，使用双光子显微镜检测体内的EGFP荧光。使用双光子激光，可以以最小的光损伤更深入地穿透皮质组织，从而可以对单个小鼠内的相同皮质区域进行数天至数月的重复纵向成像12,13,14,15。总之，这种将 TBI 手术与活体成像相结合的方法旨在促进对导致 TBI 诱发疾病病理学的分子事件的理解^16,17。

研究方案

所有与动物相关的方案均按照美国国家研究委员会（US）委员会发布的《实验动物护理和使用指南》进行。该协议已获得马萨诸塞大学陈医学院（UMMS）机构动物护理和使用委员会的批准（许可证编号202100057）。简而言之，如研究示意图（图1）所示，动物接受病毒注射、TBI、窗口植入，然后按时间顺序进行活体成像。

注意:商业条款已被删除。有关使用的具体设备，请参阅 材料表 。

1. 使用立体定位装置颅内注射 AAV

1. AAV（PHP.eB）-Syn1-EGFP
   1. 使用每毫升 1 x^{10 13} 个病毒基因组 （vg/mL） 的病毒滴度。Syn1 是指 Synapsin1，它是一种神经元特异性启动子，允许限制神经元中病毒的表达。该病毒可以在内部制备，也可以外包。
2. 用于 AAV 给药的立体定位注射手术的准备
   1. 高压灭菌器:普通剪刀、手术卡尺、手术弹簧剪、手术钳、蚊钳、纱布、棉尖涂抹器和玻璃微升注射器。
   2. 使用 75% 乙醇对手术区域进行消毒。扩大一次性无菌手术单，以覆盖立体定位平台上的手术区域。
      注意:为了在注射手术期间保持动物体温，请使用反馈调节加热装置。
   3. 称重并记录小鼠体重。
   4. 打开氧气罐阀门，将氧气流量调节至1.5 L/min。打开麻醉机，将异氟烷水平值设置为三。
      注意:在此步骤中，载气可以是室内空气或 100% 氧气。
   5. 将鼠标放入诱导室，静置5分钟以达到完全麻醉。
   6. 一旦小鼠完全麻醉（即，缓慢但稳定的呼吸频率，大约每2秒一个周期，加上没有尾部捏反射），将鼠标从诱导室中取出并将鼠标头部置于立体定位框架中。
   7. 将麻醉管鼻锥放在鼠标的鼻子上。
   8. 使用 1.5% 异氟醚维持麻醉，载气以 1 L/min 的流速保持麻醉，直到手术结束。定期检查呼吸频率，并在整个手术过程中至少每 15 分钟捏一次尾巴或脚趾，以评估适当的麻醉效果。适当调整异氟烷浓度以维持所需的麻醉深度。
   9. 用病毒溶液填充微升注射器（10μL）。然后，将注射器固定在立体定位装置的匹配显微注射器泵上。
3. 注射手术
   1. 使用一次性胰岛素注射器给予丁丙诺啡（1mg / kg，皮下注射），并将润滑剂眼膏涂抹在小鼠的眼睛上。
   2. 用普通剪刀修剪，去除头顶头皮上的毛发 1.
   3. 用纱布和棉签涂抹器清洁头皮皮肤。首先使用75%乙醇对皮肤进行消毒，然后使用倍他定。重复此操作三次（即乙醇后加甜菜碱），将甜菜碱的最后涂抹留在皮肤上。
   4. 重新检查麻醉深度以确保小鼠完全麻醉（即，缓慢但稳定的呼吸频率大约每 2 秒一个周期，加上没有尾捏反射）。使用常规剪刀 2 沿中线切开 ~1 厘米的切口，露出右侧顶骨，并使用棉尖涂抹器去除骨膜。
   5. 使用记号笔在颅骨上标记以下坐标上的两个点:A 点:右半球前囟后方 2.5 毫米，中线外侧 1 毫米;B 点:哟后方 2.5 mm，右半球中线外侧 2 mm。
   6. 使用带有细EF4硬质合金钻头的电动牙钻小心地在标记的坐标处在颅骨上钻两个孔。
      注意:注意不要损坏脑组织。
   7. 调整立体定位框架，将微升注射器针尖对准距中线外侧 1 毫米的颅骨孔。
   8. 降低注射器针头以接触脑表面，然后将该位置设置为零点（用于 z 轴）。将针尖降低到脑皮层的深度为0.5mm，并以200nL / min的速度缓慢输注1μL病毒溶液。
   9. 在病毒溶液完全注入脑组织后等待5分钟，然后拔出针头以防止溶液回流。
   10. 慢慢抽出注射器针头。在另一个部位重复注射。用无菌、不可吸收的手术缝合线（6-0 号）缝合切口。
   11. 手术后给予头孢唑啉 [500 mg/kg（333 mg/mL，通常为 ~45 μL），肌内注射]和美洛昔康（5 mg/kg，皮下注射），而动物仍处于麻醉状态。
   12. 将鼠标从立体定位框架中释放并停止麻醉。将鼠标放在加热毯上方的干净笼子中，并监视动物直到它可以走动（约15分钟）。然后，转移到家庭笼子里。
   13. 在第一次丁丙诺啡注射后，分别在8小时，16小时和24小时再次给予丁丙诺啡（1mg / kg，皮下注射）和美洛昔康（5mg / kg，皮下注射）。
       注意:在病毒注射后2-4周，小鼠在与AAV注射相同的部位接受TBI和颅窗植入。

2. 重复性 TBI 诱导的管理

注意:TBI 参数是从以前的报告^7,8 调整而来的^，其中 TBI 影响传递了一次。此处的协议应用相同的参数，只是将总影响数增加到 10。

1. TBI设备
   1. 使用定制的便携式设备将闭合的颅骨TBI（图2A）施用于右侧的鼠标头部，如图 2B所示。
2. 术前准备
   1. 高压灭菌手术设备，包括普通剪刀、手术卡尺、手术弹簧剪刀、手术钳、蚊钳、头柱片、纱布和棉头涂抹器。
   2. 在手术前2小时称重并记录小鼠的体重。为了尽量减少颅窗植入期间的脑水肿，使用胰岛素注射器将剂量为 4.8 mg/kg [2 mg/mL，通常 ~70 μl（需要在两个部位注射）] 的地塞米松磷酸钠注射到股四头肌中。注射地塞米松后，但在开始TBI手术之前，按照步骤3.1中的指示准备玻璃窗以备后用。
   3. 使用75%乙醇对手术台和TBI设备进行消毒，并在立体定位平台上展开一次性无菌手术单以覆盖手术台。打开加热设备和温度监视器，将目标温度设置为 37 °C。
   4. 打开氧气罐阀门，将氧气流量调节至1.5 L/min。打开麻醉机，将异氟烷水平值设置为三。
      注意:100%纯氧可以帮助动物在TBI冲击中幸存下来。
   5. 将鼠标放入诱导室，静置5分钟以达到完全麻醉。
   6. 一旦小鼠完全麻醉（即，缓慢但稳定的呼吸频率，大约每2秒一个周期，加上没有尾部捏反射），将鼠标从诱导室中取出并将鼠标头部置于立体定位框架中。
   7. 将麻醉管鼻锥放在鼠标的鼻子上。
   8. 使用 1.5% 异氟醚与 100% 纯氧以 1 L/min 的流速混合维持麻醉，直至手术结束。定期检查呼吸频率，并在整个手术过程中至少每 15 分钟捏一次尾巴或脚趾，以评估适当的麻醉效果。适当调整异氟烷浓度以维持所需的麻醉深度。
3. TBI手术
   1. 使用一次性胰岛素注射器给予丁丙诺啡（1mg / kg，皮下注射），并将眼药膏涂抹在小鼠的眼睛上。
   2. 用剪刀1修剪，然后使用脱毛剂1分钟，从头顶去除头发。
      注意:不要在头皮上涂抹脱毛剂产品超过 3 分钟，因为它会刺激皮肤。避免将任何脱毛剂沾到鼠标的眼睛上。
   3. 使用纱布和棉签涂抹器清洁头皮皮肤。然后，对皮肤进行消毒，首先使用75%乙醇，然后使用betadine。重复此操作三次（即乙醇后加甜菜碱），将甜菜碱的最后涂抹留在皮肤上。
   4. 重新检查麻醉深度以确保小鼠完全麻醉（即，缓慢但稳定的呼吸频率大约每 2 秒一个周期，加上没有尾捏反射）。用手术镊子 3 包住皮肤，并从眼睛后方约 3 毫米处切开一个 12-15 毫米长的中线切口。
   5. 使用弹簧剪刀 2 切除颅骨左右半球的皮肤。
   6. 颅骨暴露后，用无菌棉签轻轻擦拭并用无菌生理盐水冲洗，去除骨膜。
   7. 目视检查头骨的状况，以确保其完好无损，除了两个小孔，这是为之前的病毒注射手术制作的。
   8. 干燥颅骨区域并在以下坐标处标记TBI撞击部位:前囟后方2.5 mm，矢状缝向右侧外侧2 mm（图2B）。
   9. 快速将鼠标从立体定位框架中取出，并将头部放在 TBI 设备下方的缓冲垫上。
   10. 将撞击器尖端与标记的撞击部位对齐。
   11. 通过将系留的尼龙绳拉到鼠标头部上方 15 厘米处来抬起金属柱，然后松开它，让重量自由落到换能杆上，换能杆与 TBI 部位的颅骨顶部接触。施加 TBI 冲击时请勿触摸鼠标头。
   12. 将鼠标移到加热毯上，将其放在加热毯上，同时监测呼吸状态。
   13. 一旦鼠标从仰卧位到俯卧位，将鼠标放入异氟烷诱导室~5分钟，以1.5L / min的流速将3%异氟烷与100%纯氧混合。
   14. 一旦小鼠完全镇静（即，缓慢但稳定的呼吸频率，大约每2秒一个周期，加上没有尾捏反射），重复步骤2.3.9-2.3.14以实现总共10次撞击。
       注:在我们的研究中，已发现十种 TBI 影响可诱导小鼠死亡率低的稳健表型（数据尚未发表）。可以通过增加或减少撞击次数和/或释放重量的高度来调整参数以达到不同严重程度的脑损伤。所有参数均须经当地IACUC批准。
   15. 在手术显微镜下检查颅骨，如果发生颅骨骨折，则将鼠标从研究中移出。
   16. 对于假手术，请遵循与上述相同的程序，包括将动物放置在撞击器下，但不提供 TBI 冲击。
   17. 在第10^次 TBI撞击后，小鼠从仰卧位到俯卧位后，将小鼠放入异氟烷诱导室~5分钟。按照步骤 2.2.6-2.2.8 将鼠标头放在立体定位框架上，进行下述颅窗植入手术。

3. 颅窗植入手术

注:以下颅窗植入步骤采用Goldey等人⁹，其头柱和成像孔的规格应用于此处。

1. 窗口准备
   注意:在开始 TBI 手术之前，请完成步骤 2.2.2 中的窗口准备。窗口由两个圆形玻璃盖玻片（一个直径为 3 毫米，一个直径为 5 毫米，如图 2C 所示）制成，它们通过透明光学粘合剂连接在一起，如下所述。
   1. 通过将玻璃盖玻片浸入75%乙醇中15分钟来消毒玻璃盖玻片。将玻璃盖玻片从乙醇中取出，并在无菌表面（即无菌24孔板的盖子）上干燥~10分钟。
   2. 用透明光学胶填充胰岛素注射器，同时避免气泡形成。在显微镜1（材料表）下，以0.67倍放大倍率，在5mm盖玻片的中心滴一小滴（~1μL）光学胶。然后，立即将 3 毫米盖玻片放在顶部，并用 5 毫米盖玻片居中。
   3. 用细镊子轻轻按压，使胶水均匀涂抹。如果 3 毫米盖玻片周围形成气泡或墙壁，请丢弃玻璃窗。
   4. 要固化胶水，将盖玻片以 20 x 100 μJ/cm² 的功率放入 UV 盒中 150 秒。使用镊子 4 轻轻轻推 3 毫米盖玻片的侧面，检查两个盖玻片是否牢固粘合。如果盖玻片移动，请将其放回紫外线盒中再放置 60 秒。将玻璃窗口存放在无菌的 24 孔板中以备后用。
2. 粗糙的头骨表面。
   注意:从这里开始，在手术显微镜下执行第 3 节中的所有步骤。从 10 倍开始，然后调整到所需的放大倍率。
   1. 使用FG4硬质合金钻头以低转子速度（即输出数设置为~1-2）轻轻缓慢地钻孔颅骨表面，以去除剩余的骨膜并形成粗糙的颅骨表面，使牙水泥与颅骨牢固结合。这里也可以使用手术刀代替钻头作为替代品。
   2. 使用生理盐水冲洗并清除颅骨表面的骨灰。
3. 分离肌肉。
   注意:肌肉分离有助于增加暴露颅骨的表面积，该颅骨将作为牙骨水泥的接触点，从而确保植入物的结构完整性。这个肌肉分离步骤通常暴露 ~3 毫米的颞颅骨板。
   1. 在眼睛后方约 5 毫米处，连接顶骨和颞颅骨的缝合线所在的位置，轻轻插入闭合的细尖端（#5/45 镊子）以将侧肌与颅骨分开，然后轻轻地向后移动闭合的尖端，直到 Lambdoid 缝合线。
   2. 将发生颅窗植入的一侧的侧肌分开。
      注意:注意不要将肌肉分开太靠近眼睛，以免伤害眼动脉;否则，可能会发生严重和持续的出血。不要将肌肉与枕骨分开，因为老鼠需要这些肌肉才能抬起头。
   3. 用生理盐水洗掉手术部位的碎屑，并用纱布擦干该区域。凝胶泡沫可以涂在手术部位以止血。
4. 植入头柱。
   1. 使用先前出版物⁹中描述的定制钛头柱（图2D）在进行开颅手术时牢固地固定小鼠头，并用于随后的双光子成像。
   2. 使用记号笔和手术卡尺在右侧干净干燥的头骨上描摹开颅手术的周长。追踪圆的中心点位于前囟后方 2.5 毫米处，距离右半球矢状缝线 1.5 毫米处。描摹圆的直径约为3.2-3.5毫米，略大于3毫米的玻璃盖玻片。确保开颅圆可以覆盖病毒注射部位（注射病毒时打的两个孔可以作为参考）和TBI部位。
   3. 松开耳杆并旋转头部，使开颅手术平面完全水平，然后再次拧紧耳杆。
   4. 使用棉尖涂抹器的木棒在头柱的前后边缘添加两小滴强力胶。
   5. 将钛头柱放在开颅手术的中心上方，并快速调整它以使其与颅窗植入位置位于同一平面内。轻轻按压，直到强力胶干燥;这通常需要 ~30 秒。
   6. 在预冷的陶瓷混合皿中制备牙科水泥（在-20°C冰箱中停留至少10分钟）:将300mg水泥粉，6滴快速基础液和1滴催化剂混合，然后搅拌混合物直至充分混合（~15次）。
      注意:水泥必须是糊状的。如果太稀，再加入一点水泥粉。如果太稠，请一次一滴地加入快速基础液，直到达到糊状稠度。
   7. 快速将大量牙科水泥混合物涂抹在描摹周的外周，并覆盖任何暴露的骨骼表面。但是，不要覆盖开颅手术的部位。在继续之前，等待 ~15 分钟让牙粘剂干燥和硬化。
   8. 松开耳杆并将头柱固定在金属框架上，以确保头部稳定，以便沿着标记的开颅手术周进行精确钻孔。如果开颅部位有水泥，请使用 FG4 硬质合金钻头钻孔并将其移除。
5. 颅骨切开术
   1. 使用手术卡尺验证标记圆圈的直径，如步骤 3.4.2 中所定义。根据需要进行调整，使颅窗紧贴开颅手术内。
   2. 使用电动牙钻，首先使用FG4硬质合金钻头（速度设置为输出~9-10）沿标记圆圈的外侧蚀刻和稀释颅骨。这创造了一个"轨道"，在其中使头骨变薄。
      注意: 为尽量减少热损伤并获得平稳的轨道，请继续移动钻头。不要在同一位置钻孔超过 2 秒。
   3. 定期停止钻孔并用无菌盐水冲洗整个区域，以减少钻头的热量并洗去骨灰。
   4. 如步骤3.5.2所述，继续使用FG1 / 4硬质合金钻头使头骨变薄，直到头骨薄如纸且透明。
      注意: 用两只手握住钻头可以更容易地控制钻头，避免将钻头插入大脑。
   5. 使用EF4硬质合金钻头完成颅骨变薄。当骨瓣和周围颅骨之间出现裂缝时，有时会有脑脊液（CSF）的释放，表明颅骨已被完全钻穿。
   6. 继续变薄并沿着轨道钻穿头骨的其余部分。避免钻穿明显的脉管系统穿过颅骨下方的点，以防止出血。
   7. 将细镊子尖端（镊子 1）~0.5 毫米穿过破裂的地方，轻轻向上提起骨瓣，而不会压入下面的大脑。
   8. 取出骨瓣后，用生理盐水冲洗开颅手术区域。脑表面可能比开颅边缘高 1-2 毫米。
   9. 从这一步开始，始终用生理盐水覆盖暴露的大脑，以保护脑组织。
   10. 由于注射手术后的组织粘附和脉管系统生长，在原始AAV注射部位提起骨瓣时可能会发生出血。如果发生这种情况，请用干棉头涂抹器轻轻按压该部位~2 分钟（或根据需要更长时间）。凝胶泡沫可用于止血。不要使用化学品或加热钳来止血，因为这会造成伤害。
   11. 使用镊子 1 轻轻去除可见的蛛网膜物质。
6. 植入玻璃窗
   1. 使用手术钳 2 拾取无菌玻璃窗，将 3 毫米玻璃盖玻片朝下。将玻璃窗放置在开颅部位上方并调整，以确保该窗口可以紧贴开颅手术边缘。5 毫米玻璃盖玻片位于顶部。
   2. 按如下方式制备牙科水泥:将100毫克水泥粉、两滴快速基液和一滴催化剂混合。搅拌混合物直至充分混合（~15 次）。等待~6分钟，直到水泥变得糊状和粘稠。如果水泥太薄，它可能会渗入步骤3.6.4中窗户下方的空间并遮挡窗户。
   3. 在等待水泥变得糊状和厚实的同时，通过立体定位机械手对窗户施加足够的压力，以检查头骨是否可以牢固地紧密地接触玻璃窗。确保步骤 3.6.4 中的牙科水泥液不会到达玻璃下方的空间，从而遮挡窗户。
   4. 使用可调节的精密涂抹刷在窗边添加少量水泥，以将玻璃窗与头骨密封。等待~10分钟，让水泥完全干燥，然后轻轻松开并取下窗户上方的机械手。截至此步骤，完成 10 次 TBI 冲击并植入头柱和颅窗需要 ~4 小时。
   5. 如果窗户上有多余的水泥，请使用带有 FG4 硬质合金钻头的牙钻修剪牙科水泥。
      注意: 窗户周围过多的水泥可能会阻止双光子物镜接近窗户表面。
7. 植入成像井
   注:成像孔（图2D）是一个外径为~1.6cm的橡胶圈，与头柱顶面相匹配，并将水保持在颅窗上方，用于双光子成像。
   1. 窗户植入完成后，钻掉头柱顶面上的牙水泥碎屑，并用湿手术纱布清洁该区域。让该区域干燥 ~3 分钟。
   2. 使用棉尖涂抹器蘸上少量强力胶并将其粘贴在头柱顶面上。快速将橡胶圈放在头柱上。在橡胶圈上施加中等压力~2分钟，以确保与头柱紧密接触。少用强力胶，否则会粘附在玻璃窗上，遮挡双光子成像。
8. 镇痛药和抗生素给药
   1. 植入成像井后，但在停用异氟醚之前，立即使用一次性胰岛素注射器给予头孢唑林 [500 mg/kg（333 mg/mL，通常为 ~45 μL），肌内注射]和美洛昔康（5 mg/kg，皮下注射）。
   2. 给药后，停止麻醉，将小鼠从立体定位框架中释放出来，并将小鼠放回加热毯上方的家笼。
   3. 密切监视鼠标~15分钟，直到它可以走动。
      注意:单独饲养小鼠，因为它们可能会咬住其他小鼠的橡胶成像井。在笼子里靠近老鼠的地方提供食物和水凝胶，以便 随意接触。
   4. 在上一次给药后每 8 小时再次给予丁丙诺啡（1 mg/kg，皮下注射）和美洛昔康（5 mg/kg，皮下注射），直至颅窗植入手术后 48 小时。

4. 活体双光子成像

1. 使用配备可调谐相干多光子激光器和 20 倍放大倍率物镜（NA 1.0;水浸）的显微镜 2（材料表）进行活体成像¹⁸。用于EGFP信号的滤波器为"BP 500-550"。
2. 准备颅窗鼠标进行活体成像。
   1. 从手术日（指定为第 0 天）开始，在 TBI 后的设计时间点进行双光子成像。将颅窗鼠标放入麻醉诱导室中，并以1.5L / min的流速给予3%异氟醚与载气混合5分钟。
      注意: 载气可以是室内空气或 100% 氧气。
   2. 一旦鼠标完全麻醉（即，缓慢但稳定的呼吸频率，大约每2秒一个周期，加上没有尾捏反射），将鼠标从诱导室中取出并迅速将头柱夹在支架上。让鼠标的躯干放在装有支架的圆形塑料板（直径 19 厘米）上。
      注意:在小鼠躯干下方放置一个手温垫，以在活体成像期间提供热支持。
   3. 将润滑剂眼膏涂抹在小鼠的眼睛上，并将麻醉管鼻锥放在小鼠的鼻子上。使用 1.5% 异氟醚和载气以 1 L/min 的流速维持麻醉。
   4. 定期检查呼吸频率，并在整个成像过程中至少每 15 分钟捏一次尾巴或脚趾，以评估适当的麻醉。适当调整异氟烷浓度以维持所需的麻醉深度。
   5. 对齐鼠标头部以确保颅窗位于双光子物镜的正下方。在颅窗上方的成像中加入一些水。降低物镜，使其浸入水中。
3. 颅内窗小鼠的活体成像
   1. 打开示波器汞灯。首先通过肉眼用落射荧光观察大脑。
      注意:脉管系统呈黑色。选择窗口清晰的区域。关闭落射荧光，将EGFP信号的激光波长设置为860 nm，然后调整激光设置以获得最佳（即明亮但不饱和）信号。
   2. 将扫描模式设置为 "帧 "，将行步长设置为"1"。将平均数设置为 16，将位深度设置为 8 位，将模式设置为" 线"，将方法设置为 "平均值"。
   3. 使用脉管系统模式作为"参考图"，对同一大脑区域进行成像，以便进行后续纵向成像。 如图3A所示，对皮质脉管系统通过z-stack模式占主导地位的三个平面的浅表水平（第一层，距脑膜表面小于100μm）进行成像，平面间间隔为10μm。
   4. 如图3A所示，通过z-stack模式在深层（IV层和V层，比浅层深~400μm）对六个平面进行成像，面间间隔为10μm，扫描速度为8。
   5. 完成成像（每只小鼠~20分钟）后，停止麻醉，将鼠标从框架中释放出来，并将其放回加热毯上方的笼子中。连续监视鼠标，直到它可以走动，这通常需要 ~7 分钟。
   6. 在TBI手术后第0天，1周和4个月对小鼠进行纵向成像。

结果

作为该协议的概念证明，在3个月大时将表达AAV-Syn1-EGFP的病毒颗粒注射到雄性TDP-43^{Q331K / Q331K小鼠}（C57BL / 6J背景）¹⁹的大脑皮层中。值得注意的是，也可以使用野生型 C57BL/6J 动物，但这项研究是在 TDP-43 Q331K^{/Q331K 小鼠}中进行的，因为该实验室专注于神经退行性疾病研究。注射 AAV 后 4 周进行 TBI 手术。在相同的手术环境中，植入了头柱和颅窗。在TBI手术后第0天，1周...

讨论

在这项研究中，将 AAV 注射、TBI 给药和颅窗植入头柱相结合，对小鼠大脑皮层（IV 层和 V 层）内 EGFP 标记的神经元进行纵向成像分析，以观察 TBI 对皮层神经元的影响。这项研究指出，这里选择的 TBI 部位，在海马体上方，为颅窗植入提供了一个相对平坦和宽阔的表面。相反，颅骨在该部位的前方相对较窄，因此很难确保头柱能够有效地接触颅骨表面。虽然本研究中仅使用了TDP-43^{Q331K / Q331K}...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Precision Applicator Brushes	Parkell	S379
BD insulin syringe	BD	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16" x 31G
Betadine	Purdue	NDC67618-151-17	including 7.5% povidone iodine
Buprenorphine	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
Cefazolin	HIKMA Pharmaceutical	NDC 0143-9924-90
Ceramic Mixing Dish	Parkell	SKU: S387	For dental cement preparation
Cotton Tipped Applicators	ZORO	catlog #: G9531702
Catalyst	Parkell	S371	full name: "C" Universal TBB Catalyst
Dental cement powder	Parkell	S396	Radiopaque L-Powder for C&B Metabond
Dental drill	Foredom	H.MH-130
Dental drill controller	Foredom	HP4-310
Dexamethasone	Phoenix	NDC 57319-519-05
EF4 carbide bit	Microcopy	Lot# C150113	Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2
Ethonal	Fisher Scientific	04355223EA	75%
FG1/4 carbide bit	Microcopy	Lot# C150413	Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4
FG4 carbide bit	Microcopy	Lot# C150309	Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1
Headpost	N/A	N/A	Custom-manufactured
Heating apparatus	CWE	TC-1000 Mouse	equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery
Heating blanket	CVS pharmacy	E12107	extra heating device and be used after surgery
Isoflurane	Pivetal	NDC 46066-755-03
Isoflurane induction chamber	Vetequip	89012-688	induction chamber for short
Isoflurane volatilizing machine	Vetequip	911103
Isoflurane volatilizing machine holder	Vetequip	901801
Leica surgical microscope	Leica	LEICA 10450243
Lubricant ophthalmic ointment	Picetal	NDC 46066-753-55
Marker pen	Delasco	SMP-BK
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10
Microinjection pump and its controller	World Precision Instruments	micro4 and UMP3
Microliter syringe	Hamilton	Hamilton 80014	1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3
Mosquito forceps	CAROLINA	Item #:625314	Stainless Steel, Curved, 5 in
Depilatory agent	McKesson Corporation	N/A	Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion
Microscope 1	Nikon	SMZ745	Nikon microscope for cranial window preparation
Microscope 2	Zeiss	LSM 7 MP	two-photon microscope
Multiphoton laser	Coherent	Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W	laser for two-photon microscopy
Non-absorbable surgical suture	Harvard Apparatus	catlog# 59-6860	6-0, with round needle
Norland Optical Adhesive 81	Norland Products	NOA 81
No-Snag Needle Holder	CAROLINA	Item #: 567912
Quick base liquid	Parkell	S398	"B" Quick Base For C&B Metabond
Regular scissor 1	Eurostat	eurostat es5-300
Regular scissor 2	World Precision Instruments	No. 501759-G
Round cover glass 1	Warner instruments	CS-5R Cat# 64-0700	for 5 mm of diameter
Round cover glass 2	Warner instruments	CS-3R Cat# 64-0720	for 3 mm of diameter
Rubber rings	Orings-Online	Item # OO-014-70-50	O-Rings
Saline	Bioworld	L19102411PR
Spring scissor 1	World Precision Instruments	No. 91500-09	tip straight
Spring scissor 2	World Precision Instruments	No. 91501-09	tip curved
Stereotaxic platform	KOPF	Model 900LS
Super glue	Henkel	Item #: 1647358
surgical Caliper	World Precision Instruments	No. 501200
Surgical forceps 1	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	Catlog# 0508-5/45-PO	style 5/45, curved
Surgical forceps 2	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	catlog# 0103-5-PO	style 5, straight
Surgical forceps 3	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	catlog# 72912
Surgical forceps 4	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	Catlog# 0508-5/45-PO	style 5/45, curved
Surgical gauze	ZORO	catlog #: G0593801
Surgical lamp	Leica	Leica KL300 LED
UV box	Spectrolinker	XL-1000	also called UV crosslinker
Vaporguard	Vetequip	931401
Vetbond Tissue Adhesive	3M Animal Care	Part Number:014006