Прижизненная визуализация экспрессии флуоресцентных белков у мышей с закрытой черепно-мозговой травмой и краниальным окном с использованием двухфотонного микроскопа

Резюме

Это исследование демонстрирует доставку повторяющейся черепно-мозговой травмы мышам и одновременную имплантацию краниального окна для последующей прижизненной визуализации нейрон-экспрессируемого EGFP с помощью двухфотонной микроскопии.

Аннотация

Целью этого протокола является демонстрация того, как лонгитюдно визуализировать экспрессию и локализацию интересующего белка в определенных типах клеток мозга животного при воздействии экзогенных стимулов. Здесь показано введение закрытой черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и одновременная имплантация краниального окна для последующей продольной прижизненной визуализации у мышей. Мышам внутричерепно вводят аденоассоциированный вирус (AAV), экспрессирующий усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) под действием нейронно-специфического промотора. Через 2-4 недели мышей подвергают повторной ЧМТ с использованием устройства для сброса веса над местом инъекции AAV. Во время одного хирургического сеанса мышам имплантируют металлический подголовник, а затем стеклянное краниальное окно над местом удара ЧМТ. Экспрессия и клеточная локализация EGFP исследуется с помощью двухфотонного микроскопа в одной и той же области мозга, подвергшейся травме в течение нескольких месяцев.

Введение

Черепно-мозговая травма (ЧМТ), которая может возникнуть в результате спортивных травм, столкновений транспортных средств и военных действий, является проблемой здравоохранения во всем мире. ЧМТ может привести к физиологическим, когнитивным и поведенческим нарушениям, а также к пожизненной инвалидности или смертности ^1,2. Тяжесть ЧМТ можно классифицировать как легкую, умеренную и тяжелую, в подавляющем большинстве случаев это легкая ЧМТ (75%-90%)³. Все чаще признается, что ЧМТ, особенно повторяющиеся случаи ЧМТ, могут способствовать дегенерации нейронов и служить факторами риска развития....

протокол

Все протоколы, связанные с животными, были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным Комитетом Национального исследовательского совета (США). Протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинской школы Чана Массачусетского университета (UMMS) (разрешение No 202100057). Вкратце, как показано на схеме исследования (рис. 1), животное получает инъекцию вируса, ЧМТ, имплантацию окна, а затем прижизненную визуализацию во временной последовательности.

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие условия были удалены. Пожалуйста, обратитесь к

Результаты

В качестве доказательства концепции этого протокола вирусные частицы, экспрессирующие AAV-Syn1-EGFP, были введены в кору головного мозга самцов мышей TDP-43^Q331K/Q331K (C57BL/6J фон)¹⁹ в возрасте 3 месяцев. Отмечается, что животные дикого типа C57BL/6J также могут быть использованы, однако ?.......

Обсуждение

В этом исследовании инъекция AAV, введение ЧМТ и имплантация краниального окна были объединены для анализа продольной визуализации EGFP-меченных нейронов в коре головного мозга мыши (слои IV и V) для наблюдения за влиянием ЧМТ на нейроны коры головного мозга. В этом исследовании отмечается, .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Precision Applicator Brushes	Parkell	S379
BD insulin syringe	BD	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16" x 31G
Betadine	Purdue	NDC67618-151-17	including 7.5% povidone iodine
Buprenorphine	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
Cefazolin	HIKMA Pharmaceutical	NDC 0143-9924-90
Ceramic Mixing Dish	Parkell	SKU: S387	For dental cement preparation
Cotton Tipped Applicators	ZORO	catlog #: G9531702
Catalyst	Parkell	S371	full name: "C" Universal TBB Catalyst
Dental cement powder	Parkell	S396	Radiopaque L-Powder for C&B Metabond
Dental drill	Foredom	H.MH-130
Dental drill controller	Foredom	HP4-310
Dexamethasone	Phoenix	NDC 57319-519-05
EF4 carbide bit	Microcopy	Lot# C150113	Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2
Ethonal	Fisher Scientific	04355223EA	75%
FG1/4 carbide bit	Microcopy	Lot# C150413	Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4
FG4 carbide bit	Microcopy	Lot# C150309	Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1
Headpost	N/A	N/A	Custom-manufactured
Heating apparatus	CWE	TC-1000 Mouse	equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery
Heating blanket	CVS pharmacy	E12107	extra heating device and be used after surgery
Isoflurane	Pivetal	NDC 46066-755-03
Isoflurane induction chamber	Vetequip	89012-688	induction chamber for short
Isoflurane volatilizing machine	Vetequip	911103
Isoflurane volatilizing machine holder	Vetequip	901801
Leica surgical microscope	Leica	LEICA 10450243
Lubricant ophthalmic ointment	Picetal	NDC 46066-753-55
Marker pen	Delasco	SMP-BK
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10
Microinjection pump and its controller	World Precision Instruments	micro4 and UMP3
Microliter syringe	Hamilton	Hamilton 80014	1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3
Mosquito forceps	CAROLINA	Item #:625314	Stainless Steel, Curved, 5 in
Depilatory agent	McKesson Corporation	N/A	Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion
Microscope 1	Nikon	SMZ745	Nikon microscope for cranial window preparation
Microscope 2	Zeiss	LSM 7 MP	two-photon microscope
Multiphoton laser	Coherent	Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W	laser for two-photon microscopy
Non-absorbable surgical suture	Harvard Apparatus	catlog# 59-6860	6-0, with round needle
Norland Optical Adhesive 81	Norland Products	NOA 81
No-Snag Needle Holder	CAROLINA	Item #: 567912
Quick base liquid	Parkell	S398	"B" Quick Base For C&B Metabond
Regular scissor 1	Eurostat	eurostat es5-300
Regular scissor 2	World Precision Instruments	No. 501759-G
Round cover glass 1	Warner instruments	CS-5R Cat# 64-0700	for 5 mm of diameter
Round cover glass 2	Warner instruments	CS-3R Cat# 64-0720	for 3 mm of diameter
Rubber rings	Orings-Online	Item # OO-014-70-50	O-Rings
Saline	Bioworld	L19102411PR
Spring scissor 1	World Precision Instruments	No. 91500-09	tip straight
Spring scissor 2	World Precision Instruments	No. 91501-09	tip curved
Stereotaxic platform	KOPF	Model 900LS
Super glue	Henkel	Item #: 1647358
surgical Caliper	World Precision Instruments	No. 501200
Surgical forceps 1	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	Catlog# 0508-5/45-PO	style 5/45, curved
Surgical forceps 2	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	catlog# 0103-5-PO	style 5, straight
Surgical forceps 3	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	catlog# 72912
Surgical forceps 4	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	Catlog# 0508-5/45-PO	style 5/45, curved
Surgical gauze	ZORO	catlog #: G0593801
Surgical lamp	Leica	Leica KL300 LED
UV box	Spectrolinker	XL-1000	also called UV crosslinker
Vaporguard	Vetequip	931401
Vetbond Tissue Adhesive	3M Animal Care	Part Number:014006