Imagem Intravital da Expressão de Proteínas Fluorescentes em Camundongos com Traumatismo Cranioencefálico de Crânio Fechado e Janela Craniana Usando um Microscópio de Dois Fótons

Resumo

Este estudo demonstra a entrega de um traumatismo cranioencefálico repetitivo em camundongos e o implante simultâneo de uma janela craniana para posterior imagem intravital de um EGFP expresso por neurônio usando microscopia de dois fótons.

Resumo

O objetivo deste protocolo é demonstrar como visualizar longitudinalmente a expressão e localização de uma proteína de interesse dentro de tipos celulares específicos do cérebro de um animal, mediante exposição a estímulos exógenos. Aqui, a administração de um traumatismo cranioencefálico (TCE) fechado e o implante simultâneo de uma janela craniana para subsequentes imagens intravitais longitudinais em camundongos são mostrados. Camundongos são injetados intracranialmente com um vírus adenoassociado (AAV) expressando proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) sob um promotor neuronal específico. Após 2 a 4 semanas, os camundongos são submetidos a um TCE repetitivo usando um dispositivo de queda de peso sobre o local de injeção do AAV. Dentro da mesma sessão cirúrgica, os camundongos são implantados com um cabeçote de metal e, em seguida, uma janela craniana de vidro sobre o local do TCE. A expressão e a localização celular do EGFP são examinadas usando um microscópio de dois fótons na mesma região cerebral exposta a trauma ao longo de meses.

Introdução

O traumatismo cranioencefálico (TCE), que pode resultar de lesões esportivas, colisões de veículos e combates militares, é um problema de saúde mundial. O TCE pode levar a déficits fisiológicos, cognitivos e comportamentais, além de incapacidade ou mortalidade^ao longo da vida ^1,2. A gravidade do TCE pode ser classificada em leve, moderada e grave, sendo a grande maioria TCE leve (75%-90%)³. É cada vez mais reconhecido que o TCE, particularmente as ocorrências repetitivas de TCE, pode promover degeneração neuronal e servir como fatores de risco para várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer (DA), esclerose lateral amiotrófica (ELA), demência frontotemporal (DFT) e encefalopatia traumática crônica (ETC)^4,5,6. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes à neurodegeneração induzida por TCE permanecem obscuros e, portanto, representam uma área ativa de estudo. Para obter informações sobre como os neurônios respondem e se recuperam do TCE, um método para monitorar proteínas fluorescentemente marcadas de interesse, especificamente dentro dos neurônios, por imagens intravitais longitudinais em camundongos após TCE é descrito aqui.

Para tanto, este estudo mostra como combinar um procedimento cirúrgico para a administração de TCE de crânio fechado semelhante ao relatado anteriormente^7,8, juntamente com um procedimento cirúrgico para implante de janela craniana para imagem intravital a jusante^, como descrito por Goldey e cols.9. Notadamente, é inviável implantar uma janela craniana primeiro e, posteriormente, realizar um TCE na mesma região, pois o impacto da queda de peso que induz o TCE é suscetível de danificar a janela e causar danos irreparáveis ao camundongo. Portanto, esse protocolo foi desenhado para administrar o TCE e, em seguida, implantar a janela craniana diretamente sobre o local do impacto, tudo dentro da mesma sessão cirúrgica. Uma vantagem de combinar o TCE e o implante de janela craniana em uma única sessão cirúrgica é a redução do número de vezes que um camundongo é submetido à cirurgia. Além disso, permite monitorar a resposta imediata (ou seja, na escala de tempo de horas) ao TCE, em vez de implantar a janela em uma sessão cirúrgica posterior (ou seja, imagens iniciais iniciadas em uma escala de tempo de dias pós-TCE). A janela craniana e a plataforma de imagem intravital também oferecem vantagens sobre a monitorização de proteínas neuronais por métodos convencionais, como a imunomarcação de tecidos fixos. Por exemplo, menos camundongos são necessários para imagens intravitais, já que o mesmo camundongo pode ser estudado em vários pontos de tempo, em oposição a coortes separadas de camundongos necessárias para pontos de tempo discretos. Além disso, os mesmos neurônios podem ser monitorados ao longo do tempo, permitindo rastrear eventos biológicos ou patológicos específicos dentro da mesma célula.

Como prova de conceito, a expressão neurônio-específica da proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) sob o promotor de sinapsina é demonstrada aqui¹⁰. Essa abordagem pode ser estendida para 1) diferentes tipos de células cerebrais utilizando outros promotores específicos de tipos celulares, como promotor de proteína básica de mielina (MBP) para oligodendrócitos e promotor de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) para astrócitos¹¹ , 2) diferentes proteínas-alvo de interesse pela fusão de seus genes com o gene EGFP e 3) co-expressão de múltiplas proteínas fundidas a diferentes fluoróforos. Aqui, o EGFP é embalado e expresso através da administração de vírus adenoassociado (AAV) através de uma injeção intracraniana. Um TCE de crânio fechado é administrado usando um dispositivo de queda de peso, seguido pelo implante de uma janela craniana. A visualização do EGFP neuronal é obtida através da janela craniana, usando microscopia de dois fótons para detectar a fluorescência do EGFP in vivo. Com o laser de dois fótons, é possível penetrar mais profundamente no tecido cortical com o mínimo de fotodano, permitindo repetidas imagens longitudinais das mesmas regiões corticais dentro de um camundongo individual por dias e até meses^12,13,14,15. Em suma, essa abordagem de combinação de cirurgia de TCE com imagem intravital visa avançar no entendimento dos eventos moleculares que contribuem para a patologia da doença induzida por TCE^16,17.

Protocolo

Todos os protocolos relacionados aos animais foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publicado pelo Comitê do National Research Council (US). Os protocolos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da University of Massachusetts Chan Medical School (UMMS) (Permit Number 202100057). Resumidamente, como mostra o esquema do estudo (Figura 1), o animal recebe uma injeção viral, um TCE, um implante de janela e, em seguida, imagens intravitais em uma sequência temporal.

NOTA: Os termos comerciais foram removidos. Consulte a Tabela de Materiais para o equipamento específico utilizado.

1. Injeção intracraniana de AAV com dispositivo estereotáxico

1. AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
   1. Use um título viral de 1 x 10¹³ genomas virais por mililitro (vg/mL). Syn1 refere-se a Synapsin1, que é um promotor neuronal específico que permite a expressão viral restrita em neurônios. O vírus pode ser preparado internamente ou terceirizado.
2. Preparação para cirurgia de injeção estereotáxica para administração de AAV
   1. Tesoura regular de autoclave, paquímetro cirúrgico, tesoura de mola cirúrgica, pinça cirúrgica, pinça mosquiteira, gaze, aplicador com ponta de algodão e seringa de microlitro de vidro.
   2. Higienizar a área cirúrgica com etanol 75%. Expandir o pano cirúrgico estéril descartável para cobrir a região da cirurgia na plataforma estereotáxica.
      NOTA: Para manter a temperatura corporal do animal durante a cirurgia de injeção, use um aparelho de aquecimento regulado por realimentação.
   3. Pese e registre o peso corporal do mouse.
   4. Abra a válvula do tanque de oxigênio e ajuste o fluxo de oxigênio para 1,5 L/min. Abra o aparelho de anestesia e defina o valor do nível de isoflurano para três.
      NOTA: O gás transportador pode ser ar ambiente ou 100% de oxigênio nesta etapa.
   5. Coloque o rato na câmara de indução e deixe-o permanecer durante 5 minutos para obter anestesia total.
   6. Uma vez que o mouse esteja totalmente anestesiado (ou seja, taxas de respiração lentas, mas constantes, de aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça na cauda), remova o mouse da câmara de indução e coloque a cabeça do mouse no quadro estereotáxico.
   7. Coloque o cone do nariz da tubulação de anestesia sobre o focinho do rato.
   8. Manter a anestesia com isoflurano a 1,5%, com gás carreador a 1 L/min até o final da cirurgia. Verifique periodicamente a frequência respiratória e dê uma pinça na cauda ou nos dedos dos pés pelo menos a cada 15 minutos durante toda a cirurgia para avaliar a anestesia apropriada. Ajustar a concentração de isoflurano conforme apropriado para manter a profundidade de anestesia desejada.
   9. Encha uma seringa de microlitro (10 μL) com a solução de vírus. Em seguida, fixe a seringa na bomba microinjetora correspondente do dispositivo estereotáxico.
3. Cirurgia de injeção
   1. Administrar buprenorfina (1 mg/kg, por via subcutânea) utilizando uma seringa de insulina descartável e aplicar pomada oftálmica lubrificante nos olhos do rato.
   2. Retire o cabelo do couro cabeludo no topo da cabeça, aparando com tesoura regular 1.
   3. Limpe a pele do couro cabeludo com gaze e aplicadores com ponta de algodão. Desinfete a pele usando etanol 75% primeiro e depois betadina. Repita isso três vezes (ou seja, etanol seguido de betadina), deixando a aplicação final de betadina na pele.
   4. Verifique novamente a profundidade anestésica para garantir que o mouse esteja totalmente anestesiado (ou seja, taxas respiratórias lentas, mas constantes, de aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça na cauda). Faça uma incisão de ~1 cm usando tesoura regular 2 ao longo da linha média para expor o crânio parietal direito e remova o periósteo usando um aplicador com ponta de algodão.
   5. Marque dois pontos do crânio com caneta marcadora nestas coordenadas: ponto A: 2,5 mm posterior ao Bregma e 1 mm lateral à linha média sobre o hemisfério direito; ponto B: 2,5 mm posterior ao Bregma e 2 mm lateral à linha média sobre o hemisfério direito.
   6. Faça cuidadosamente dois furos através do crânio nas coordenadas marcadas usando uma broca dental elétrica com uma broca fina de carboneto EF4.
      NOTA: Tenha cuidado para não danificar o tecido cerebral.
   7. Ajuste a armação estereotáxica para alinhar a ponta da agulha da seringa de microlitro ao orifício do crânio que está 1 mm lateral à linha média.
   8. Abaixe a agulha da seringa para tocar a superfície do cérebro e, em seguida, defina esse local como o ponto zero (para o eixo z). Abaixe a ponta da agulha no córtex cerebral até uma profundidade de 0,5 mm e infunda lentamente 1 μL da solução viral a uma velocidade de 200 nL/min.
   9. Aguarde 5 minutos após a solução de vírus ser completamente injetada no tecido cerebral antes de retirar a agulha para evitar o refluxo da solução.
   10. Retire lentamente a agulha da seringa. Repita a injeção no outro local. Sutura da incisão com sutura cirúrgica estéril e inabsorvível (calibre 6-0).
   11. Administrar cefazolina [500 mg/kg (333 mg/mL, geralmente ~45 μL), por via intramuscular] e meloxicam (5 mg/kg, por via subcutânea) após a cirurgia enquanto o animal ainda estiver anestesiado.
   12. Solte o mouse do quadro estereotáxico e interrompa a anestesia. Coloque o rato em uma gaiola limpa acima de uma manta de aquecimento e monitore o animal até que ele esteja deambulando (aproximadamente 15 min). Em seguida, transfira para a gaiola de casa.
   13. Administrar novamente buprenorfina (1 mg/kg, por via subcutânea) e meloxicam (5 mg/kg, por via subcutânea) às 8 h, 16 h e 24 h, respectivamente, após a primeira injeção de buprenorfina.
       NOTA: Em 2-4 semanas após a injeção do vírus, o camundongo recebe TCE e implante de janela craniana no mesmo local que a injeção de AAV.

2. Administração de uma indução de TCE repetitivo

NOTA: Os parâmetros do TCE são ajustados a partir de relatórios anteriores^7,8, nos quais o impacto do TCE foi entregue uma vez. O protocolo aqui aplica o mesmo parâmetro, exceto aumentando o número total de impacto para 10.

1. Equipamento TBI
   1. Use um dispositivo portátil personalizado para a administração de um TCE de crânio fechado (Figura 2A) na cabeça do mouse do lado direito, conforme indicado na Figura 2B.
2. Preparo antes da cirurgia
   1. Equipamento para cirurgia de autoclave, incluindo tesoura comum, paquímetro cirúrgico, tesoura de mola cirúrgica, pinça cirúrgica, pinça de mosquito, cabeceira, gaze e aplicadores com ponta de algodão.
   2. Pesar e registrar o peso corporal do camundongo 2 h antes da cirurgia. Para minimizar o edema cerebral durante o implante da janela craniana, injetar fosfato sódico de dexametasona na dose de 4,8 mg/kg [2 mg/mL, geralmente ~70 μl (necessidade de injeção em dois locais)] no músculo quadríceps usando uma seringa de insulina. Após a injeção de dexametasona, mas antes de iniciar a cirurgia de TCE, prepare as janelas de vidro conforme indicado no passo 3.1 para uso posterior.
   3. Desinfetar o estádio cirúrgico e o equipamento de TCE com etanol 75% e expandir o pano cirúrgico estéril descartável para cobrir o estágio cirúrgico na plataforma estereotáxica. Ligue o aparelho de aquecimento e o monitor de temperatura, ajustando a temperatura alvo para 37 °C.
   4. Abra a válvula do tanque de oxigênio e ajuste o fluxo de oxigênio para 1,5 L/min. Abra o aparelho de anestesia e defina o valor do nível de isoflurano para três.
      NOTA: O oxigênio 100% puro pode ajudar o animal a sobreviver aos impactos do TCE.
   5. Coloque o rato na câmara de indução e deixe-o permanecer durante 5 minutos para obter anestesia total.
   6. Uma vez que o mouse esteja totalmente anestesiado (ou seja, taxas de respiração lentas, mas constantes, de aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça na cauda), remova o mouse da câmara de indução e coloque a cabeça do mouse no quadro estereotáxico.
   7. Coloque o cone do nariz da tubulação de anestesia sobre o focinho do rato.
   8. Manter a anestesia com isoflurano a 1,5% misturado com oxigênio puro a 100% com fluxo de 1 L/min até o final da cirurgia. Verifique periodicamente a frequência respiratória e dê uma pinça na cauda ou nos dedos dos pés pelo menos a cada 15 minutos durante toda a cirurgia para avaliar a anestesia apropriada. Ajustar a concentração de isoflurano conforme apropriado para manter a profundidade de anestesia desejada.
3. Cirurgia de TCE
   1. Administrar buprenorfina (1 mg/kg, por via subcutânea) utilizando seringas de insulina descartáveis e aplicar pomada oftálmica nos olhos do rato.
   2. Retire o cabelo do topo da cabeça aparando com tesoura 1 e, em seguida, aplicando agente depilatório por 1 min.
      CUIDADO: Não aplique o produto depilatório por mais de 3 min no couro cabeludo, pois é irritante para a pele. Evite colocar qualquer agente depilatório nos olhos do rato.
   3. Limpe a pele do couro cabeludo aplicando gaze e aplicadores com ponta de algodão. Em seguida, desinfete a pele, usando etanol 75% primeiro e depois betadina. Repita isso três vezes (ou seja, etanol seguido de betadina), deixando a aplicação final de betadina na pele.
   4. Verifique novamente a profundidade anestésica para garantir que o mouse esteja totalmente anestesiado (ou seja, taxas respiratórias lentas, mas constantes, de aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça na cauda). Tenda a pele com pinça cirúrgica 3 e, fazer uma incisão mediana de 12-15 mm de comprimento iniciando aproximadamente 3 mm posterior aos olhos.
   5. Excisar a pele sobre os hemisférios esquerdo e direito do crânio usando tesoura de mola 2.
   6. Uma vez exposto o crânio, remova o periósteo esfregando suavemente com um aplicador estéril com ponta de algodão e lavando com soro fisiológico estéril.
   7. Inspecione visualmente a condição do crânio para garantir que ele esteja intacto, exceto pelos dois pequenos orifícios, que foram feitos para a cirurgia de injeção de vírus anterior.
   8. Secar a área do crânio e marcar o local do TCE nas seguintes coordenadas: 2,5 mm posterior ao Bregma e 2 mm lateral da sutura sagital à direita (Figura 2B).
   9. Remova rapidamente o mouse do quadro estereotáxico e coloque a cabeça na almofada do buffer sob o dispositivo TBI.
   10. Alinhe a ponta do pêndulo com o local de impacto marcado.
   11. Levante a coluna de metal puxando a corda de nylon presa a 15 cm acima da cabeça do mouse e, em seguida, solte-a, permitindo que o peso caia livremente sobre a haste do transdutor, que está em contato com a parte superior do crânio no local do TCE. Não toque na cabeça do mouse ao causar o impacto do TCE.
   12. Mova o mouse sobre a manta de aquecimento e coloque-o de costas enquanto monitora o estado respiratório.
   13. Uma vez que o camundongo se ajeita de uma posição supina para uma posição prona, coloque o camundongo na câmara de indução de isoflurano por ~5 min com isoflurano a 3% misturado com oxigênio 100% puro a uma taxa de fluxo de 1,5 L/min.
   14. Uma vez que o rato esteja totalmente sedado (ou seja, taxas de respiração lentas, mas constantes, de aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça na cauda), repita os passos 2.3.9-2.3.14 para obter um total de 10 impactos.
       NOTA: Dez impactos do TCE induziram fenótipo robusto com baixa mortalidade em camundongos em nosso estudo (dados ainda não publicados). Os parâmetros podem ser ajustados para atingir uma gravidade diferente da lesão cerebral, aumentando ou diminuindo o número de impactos e/ou a altura a partir da qual o peso é liberado. Todos os parâmetros estão sujeitos à aprovação da IACUC local.
   15. Verifique o crânio sob um microscópio cirúrgico e remova o camundongo do estudo se ocorreu uma fratura no crânio.
   16. Para uma cirurgia simulada, siga os mesmos procedimentos descritos acima, incluindo a colocação do animal sob o impactor, mas sem entregar os impactos do TCE.
   17. Depois que o camundongo se ajeitar de uma posição supina para uma posição prona após o impacto do^10º TCE, coloque o camundongo na câmara de indução de isoflurano por ~5 min. Siga os passos 2.2.6-2.2.8 para colocar a cabeça do mouse na estrutura estereotáxica para a cirurgia de implante de janela craniana descrita abaixo.

3. Cirurgia de implante de janela craniana

NOTA: As etapas de implantação da janela craniana abaixo foram adotadas por Goldey et ^al.9, e suas especificações do cabeçote e do poço de imagem foram aplicadas aqui.

1. Preparação de janelas
   NOTA: Conclua a preparação da janela na etapa 2.2.2 antes de iniciar a cirurgia de TCE. A janela é feita de duas lamínulas redondas de vidro (uma de 3 mm e outra de 5 mm de diâmetro, como indicado pela Figura 2C) que são unidas por adesivo óptico transparente, conforme descrito abaixo.
   1. Higienizar as tampas de vidro submergindo-as em etanol 75% por 15 min. Retire as tampas de vidro do etanol e deixe-as secar em uma superfície estéril (ou seja, a tampa de uma placa estéril de 24 poços) por ~10 min.
   2. Encha uma seringa de insulina com cola óptica transparente, evitando a formação de bolhas. Sob o microscópio 1 (Tabela de Materiais) com aumento de 0,67x, coloque uma pequena gota (~1 μL) de cola óptica no centro da lamínula de 5 mm. Em seguida, coloque imediatamente a lamínula de 3 mm por cima e centralize-a com a lamínula de 5 mm.
   3. Aplique pressão suavemente usando pinças finas para espalhar a cola uniformemente. Descarte a janela de vidro se uma bolha ou parede se formar ao redor da tampa de 3 mm.
   4. Para curar a cola, coloque as lamínulas em uma caixa UV por 150 s a uma potência de 20 x 100 μJ/cm². Verifique se as duas lamínulas estão firmemente ligadas, usando a pinça 4 para empurrar suavemente a lateral do deslizamento de 3 mm. Se a tampa se mover, coloque-a de volta na caixa UV por mais 60 s. Guarde a janela de vidro em uma placa estéril de 24 poços para uso posterior.
2. Áspero a superfície do crânio.
   NOTA: A partir de agora, execute todas as etapas da seção 3 sob um microscópio cirúrgico. Comece com 10x e ajuste para a ampliação desejada.
   1. Perfure suave e lentamente a superfície do crânio usando uma broca de carboneto FG4 a uma velocidade de rotor baixa (ou seja, número de saída definido como ~1-2) para remover o periósteo restante e criar uma superfície craniana áspera, de modo que o cimento dental se ligue firmemente ao crânio. Um bisturi também pode ser usado aqui em vez de uma broca como alternativa.
   2. Use soro fisiológico para limpar e limpar a poeira óssea da superfície do crânio.
3. Separe os músculos.
   OBS: A separação muscular serve para aumentar a área de superfície do osso craniano exposto que servirá como ponto de contato para o cimento dentário, garantindo assim a integridade estrutural do implante. Esta etapa de separação muscular geralmente expõe ~3 mm da placa temporal do crânio.
   1. Aproximadamente 5 mm posterior ao olho, onde está localizada a sutura que conecta o crânio parietal e temporal, insira suavemente as pontas finas fechadas (pinça #5/45) para separar os músculos laterais do crânio e mova suavemente as pontas fechadas no sentido posterior até a sutura lambdoide.
   2. Separe os músculos laterais do lado onde ocorrerá a implantação da janela craniana.
      OBS: Cuidado para não separar os músculos muito próximos ao olho, para evitar lesar a artéria oftálmica; caso contrário, pode ocorrer sangramento grave e persistente. Não separe os músculos do osso occipital, pois o camundongo precisa que esses músculos levantem a cabeça.
   3. Lave os detritos do sítio cirúrgico com soro fisiológico e seque a área com gaze. Espuma de gel pode ser aplicada no local cirúrgico para parar o sangramento.
4. Implante a cabeceira.
   1. Use um headpost de titânio feito sob medida (Figura 2D), descrito em uma publicação anterior⁹, para fixar a cabeça do mouse com segurança durante a realização da cirurgia de craniotomia e para imagens subsequentes de dois fótons.
   2. Use uma caneta marcador e um paquímetro cirúrgico para traçar a circunferência da craniotomia no crânio limpo e seco do lado direito. O ponto central do círculo traçado está 2,5 mm posterior ao Bregma e a 1,5 mm da sutura sagital no hemisfério direito. O diâmetro do círculo traçado é de cerca de 3,2-3,5 mm, ligeiramente maior do que a tampa de vidro de 3 mm. Certifique-se de que o círculo de craniotomia possa cobrir os locais de injeção do vírus (os dois orifícios feitos durante a injeção do vírus podem ser usados como referência) e o local do TCE.
   3. Solte a barra da orelha e gire a cabeça para que o plano da craniotomia fique perfeitamente horizontal e, em seguida, aperte a barra da orelha novamente.
   4. Use o bastão de madeira de um aplicador com ponta de algodão para adicionar duas pequenas gotas de supercola na borda frontal e traseira do poste da cabeça.
   5. Posicione a cabeceira de titânio sobre o centro da craniotomia e ajuste-a rapidamente para repousar no mesmo plano onde a janela craniana será implantada. Aplicar leve pressão até que a supercola esteja seca; Isso geralmente leva ~30 s.
   6. Prepare o cimento dental em uma placa de mistura de cerâmica pré-resfriada (ficando pelo menos 10 min em um freezer de -20 °C): misture 300 mg de cimento em pó, seis gotas de líquido de base rápida e uma gota de catalisador e, em seguida, mexa a mistura até misturar completamente (~15 vezes).
      OBS: O cimento precisa ser pastoso. Se estiver muito fino, mexa um pouco mais de cimento em pó. Se estiver muito grosso, misture o líquido de base rápida uma gota de cada vez até obter uma consistência pastosa.
   7. Aplique rapidamente uma quantidade generosa de mistura de cimento dental no perímetro externo da circunferência traçada e cubra qualquer superfície óssea exposta. No entanto, não cobrir o local da craniotomia. Deixe ~15 min para o cimento dental secar e endurecer antes de prosseguir.
   8. Solte a barra auricular e prenda o cabeçote à estrutura metálica para garantir que a cabeça seja estável para uma perfuração precisa ao longo da circunferência marcada da craniotomia. Se houver cimento sobre o local da craniotomia, use a broca de carboneto FG4 para perfurá-la e removê-la.
5. Craniotomia
   1. Utilizar um paquímetro cirúrgico para verificar o diâmetro do círculo marcado, conforme definido no passo 3.4.2. Ajuste conforme necessário, para que a janela craniana se encaixe confortavelmente dentro da craniotomia.
   2. Usando uma broca odontológica elétrica, condicione e afine o crânio ao longo da parte externa do círculo marcado, usando um bit de carboneto FG4 primeiro (velocidade definida para uma de saída ~9-10). Isso cria uma "trilha" dentro da qual afinar o crânio.
      CUIDADO: Para minimizar a lesão por calor e obter uma trilha suave, continue movendo a broca. Não perfure o mesmo local por mais de 2 s.
   3. Periodicamente, pare de perfurar e irrige toda a área com soro fisiológico estéril, para reduzir o aquecimento da broca e lavar o pó ósseo.
   4. Continue a afinar o crânio usando um bit de carboneto FG1/4, conforme descrito na etapa 3.5.2, até que o crânio fique fino e transparente.
      NOTA: Usar duas mãos para segurar a broca pode facilitar o controle da broca e evitar a inserção da broca no cérebro.
   5. Complete o afinamento do crânio usando um bit de carboneto EF4. Quando ocorre uma fissura entre o retalho ósseo e o osso craniano circundante, às vezes há uma liberação de líquido cefalorraquidiano (LCR), indicando que o crânio foi completamente perfurado.
   6. Continue afinando e perfurando o resto do crânio ao longo da trilha. Evite perfurar o ponto onde uma vasculatura óbvia cruza sob o crânio para evitar sangramento.
   7. Insira uma ponta de pinça fina (pinça 1) ~0,5 mm através do local rachado e levante o retalho ósseo suavemente para cima sem recuar o cérebro subjacente.
   8. Após a retirada do retalho ósseo, irrigar a área da craniotomia com soro fisiológico. A superfície cerebral poderia ser 1-2 mm mais alta que a borda da craniotomia.
   9. A partir desta etapa, cubra sempre o cérebro exposto com soro fisiológico para proteger o tecido cerebral.
   10. Pode ocorrer sangramento ao levantar o retalho ósseo nos locais originais de injeção do AAV devido à adesão tecidual e ao crescimento da vasculatura após a cirurgia de injeção. Se isso acontecer, pressione suavemente o local com um aplicador de algodão seco por ~2 min (ou mais, conforme necessário). A espuma de gel pode ser usada para parar o sangramento. Não use produtos químicos ou pinças de aquecimento para parar o sangramento, pois isso pode causar lesões.
   11. Use a pinça 1 para remover suavemente a matéria aracnoide visível.
6. Janela de vidro do implante
   1. Use a pinça cirúrgica 2 para pegar a janela de vidro estéril, com a tampa de vidro de 3 mm voltada para baixo. Coloque e ajuste a janela de vidro acima do local da craniotomia para garantir que a janela possa se encaixar perfeitamente na borda da craniotomia. A tampa de vidro de 5 mm está na parte superior.
   2. Prepare o cimento dental da seguinte forma: combine 100 mg de cimento em pó, duas gotas de líquido de base rápida e uma gota de catalisador. Mexa a mistura até misturar completamente (~15 vezes). Aguarde ~6 min até que o cimento fique pastoso e grosso. Se o cimento for demasiado fino, pode infiltrar-se no espaço sob a janela no passo 3.6.4 e obscurecer a janela.
   3. Enquanto espera que o cimento se torne pastoso e espesso, aplique uma quantidade adequada de pressão na janela através de um manipulador estereotáxico, para verificar se o crânio pode entrar em contato seguro e firmemente com a janela de vidro. Certifique-se de que o líquido de cimento dentário do passo 3.6.4 não atingirá o espaço sob o vidro e, assim, obscurecerá a janela.
   4. Use uma escova aplicadora de precisão ajustável para adicionar uma pequena quantidade de cimento ao lado da borda da janela para selar a janela de vidro com o crânio. Aguarde ~10 min para deixar o cimento secar completamente e, em seguida, solte e remova suavemente o manipulador acima da janela. A partir desta etapa, são necessárias ~4 h para terminar os impactos dos 10 TCE e implantar o cabeçote e a janela craniana.
   5. Corte o cimento dentário usando a broca dental com uma broca de metal duro FG4 se houver excesso de cimento cobrindo a janela.
      NOTA: O excesso de cimento ao redor da janela pode impedir que as lentes objetivas de dois fótons se aproximem da superfície da janela.
7. Implantando bem a imagem
   NOTA: Um poço de imagem (Figura 2D) é um anel de borracha com um diâmetro externo de ~1,6 cm, que corresponde à superfície superior da cabeceira e retém água acima da janela craniana para imagens de dois fótons.
   1. Após o término do implante da janela, perfure os restos de cimento dentário na superfície superior do poste e limpe a área com gaze cirúrgica úmida. Deixe a área secar por ~3 min.
   2. Use um aplicador com ponta de algodão para mergulhar uma pequena quantidade de supercola e cole-a na superfície superior da cabeceira. Coloque rapidamente o anel de borracha no cabeçote. Aplique pressão média no anel de borracha por ~2 min para garantir um contato próximo com o cabeçote. Use supercola com moderação, caso contrário, ela pode aderir à janela de vidro e obscurecer a imagem de dois fótons.
8. Administração de analgésicos e antibióticos
   1. Imediatamente após o implante da imagem, mas antes da suspensão do isoflurano, administrar cefazolina [500 mg/kg (333 mg/mL, geralmente ~45 μL), por via intramuscular] e meloxicam (5 mg/kg, por via subcutânea) com seringas de insulina descartáveis.
   2. Após a administração da droga, interrompa a anestesia, solte o rato da estrutura estereotáxica e devolva o rato à sua gaiola doméstica, que está acima de uma manta de aquecimento.
   3. Monitore de perto o mouse por ~15 min até que ele esteja deambulando.
      NOTA: Abrigar os ratos individualmente, pois eles podem morder bem a imagem de borracha de outros camundongos. Forneça gel de água e comida perto do rato na gaiola para acesso ad libitum.
   4. Administrar novamente buprenorfina (1 mg/kg, por via subcutânea) e meloxicam (5 mg/kg, por via subcutânea) novamente a cada 8 h após a dose anterior até 48 h após a cirurgia de implante de janela craniana.

4. Imagem intravital de dois fótons

1. Utilizar microscópio 2 (Tabela de Materiais), equipado com laser multifóton coerente sintonizável e objetiva de aumento de 20x (NA 1.0; imersão em água), para obtenção de imagens intravitais18. O filtro usado para o sinal EGFP é "BP 500-550".
2. Prepare o mouse da janela craniana para imagens intravitais.
   1. A partir do dia da cirurgia (designado como dia 0), realizar imagens de dois fótons em momentos projetados pós-TCE. Coloque o mouse da janela craniana na câmara de indução da anestesia e administre isoflurano a 3% misturado com gás carreador a uma taxa de fluxo de 1,5 L/min por 5 minutos.
      NOTA: O gás transportador pode ser ar ambiente ou 100% oxigênio.
   2. Uma vez que o rato esteja totalmente anestesiado (ou seja, taxas respiratórias lentas, mas constantes, de aproximadamente um ciclo por 2 s, juntamente com a ausência de um reflexo de pinça na cauda), remova o rato da câmara de indução e prenda rapidamente o poste da cabeça a um suporte. Deixe o torso do mouse deitado em uma placa de plástico redonda (19 cm de diâmetro) que está equipada com o suporte.
      NOTA: Uma almofada aquecida para a mão foi colocada sob o tronco do mouse para fornecer suporte térmico durante a aquisição de imagens intravitais.
   3. Aplique pomada oftálmica lubrificante nos olhos do rato e coloque o cone do nariz da tubulação de anestesia sobre o focinho do rato. Manter a anestesia usando isoflurano a 1,5% com gás carreador a uma taxa de fluxo de 1 L/min.
   4. Verifique periodicamente a frequência respiratória e aplique uma pinça na cauda ou no dedo do pé pelo menos a cada 15 minutos durante toda a imagem para avaliar a anestesia apropriada. Ajustar a concentração de isoflurano conforme apropriado para manter a profundidade de anestesia desejada.
   5. Alinhe a cabeça do mouse para garantir que a janela craniana esteja diretamente abaixo da lente objetiva de dois fótons. Adicione um pouco de água na imagem bem acima da janela craniana. Abaixe a objetiva para que ela fique imersa na água.
3. Imagem intravital de camundongos com janela intracraniana
   1. Ligue a lâmpada de mercúrio do escopo. Veja o cérebro com epifluorescência através da ocular primeiro.
      NOTA: A vasculatura aparece preta. Selecione uma área onde a janela esteja limpa. Desligue a epifluorescência, ajuste o comprimento de onda do laser para 860 nm para o sinal EGFP e ajuste a configuração do laser para o sinal ideal (ou seja, brilhante, mas não saturado).
   2. Defina o modo de varredura como Quadro e a etapa de linha como 1. Defina o número médio como 16, a profundidade de bits como 8 bits, o modo como Linha e o método como Média.
   3. Use o padrão de vasculatura como um "mapa de referência" para obter imagens da mesma região cerebral para imagens longitudinais subsequentes. Imagem do nível superficial (camada I, a menos de 100 μm da superfície meníngea) para três planos onde a vasculatura cortical domina através do modo z-stack, com intervalo interplano de 10 μm, conforme indicado na Figura 3A.
   4. Imagem de seis planos em nível profundo (camada IV e V, ~400 μm mais profundo que o nível superficial), através de um modo z-stack como indicado na Figura 3A, com intervalo interplano de 10 μm e velocidade de varredura de 8.
   5. Depois de terminar a imagem (~20 min por mouse), interrompa a anestesia, solte o mouse dos quadros e devolva-o à sua gaiola doméstica que está acima de uma manta de aquecimento. Monitore o mouse consecutivamente até que ele esteja deambulando, o que geralmente leva ~7 min.
   6. Imagem longitudinal do camundongo no dia 0, 1 semana e 4 meses após a cirurgia de TCE.

Resultados

Como prova de conceito para este protocolo, partículas virais expressando AAV-Syn1-EGFP foram injetadas no córtex cerebral de camundongos machos TDP-43 Q331K/^Q331K (fundo C57BL/6J)¹⁹ com a idade de 3 meses. Nota-se que animais selvagens C57BL/6J também podem ser usados, no entanto, este estudo foi realizado em camundongos TDP-43 Q331K^/Q331K porque o laboratório é focado na pesquisa de doenças neurodegenerativas. Uma cirurgia de TCE foi realizada 4 semanas após a injeç...

Discussão

Neste estudo, a injeção de AAV, a administração de TCE e um cabeçote com implante de janela craniana foram combinados para análise de imagem longitudinal de neurônios marcados com EGFP dentro do córtex cerebral de camundongos (camadas IV e V) para observar os efeitos do TCE nos neurônios corticais. Este estudo observa que o local do TCE aqui escolhido, acima do hipocampo, fornece uma superfície relativamente plana e ampla para a implantação da janela craniana. Por outro lado, o crânio é relativamente estrei...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable Precision Applicator Brushes	Parkell	S379
BD insulin syringe	BD	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16" x 31G
Betadine	Purdue	NDC67618-151-17	including 7.5% povidone iodine
Buprenorphine	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
Cefazolin	HIKMA Pharmaceutical	NDC 0143-9924-90
Ceramic Mixing Dish	Parkell	SKU: S387	For dental cement preparation
Cotton Tipped Applicators	ZORO	catlog #: G9531702
Catalyst	Parkell	S371	full name: "C" Universal TBB Catalyst
Dental cement powder	Parkell	S396	Radiopaque L-Powder for C&B Metabond
Dental drill	Foredom	H.MH-130
Dental drill controller	Foredom	HP4-310
Dexamethasone	Phoenix	NDC 57319-519-05
EF4 carbide bit	Microcopy	Lot# C150113	Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2
Ethonal	Fisher Scientific	04355223EA	75%
FG1/4 carbide bit	Microcopy	Lot# C150413	Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4
FG4 carbide bit	Microcopy	Lot# C150309	Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1
Headpost	N/A	N/A	Custom-manufactured
Heating apparatus	CWE	TC-1000 Mouse	equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery
Heating blanket	CVS pharmacy	E12107	extra heating device and be used after surgery
Isoflurane	Pivetal	NDC 46066-755-03
Isoflurane induction chamber	Vetequip	89012-688	induction chamber for short
Isoflurane volatilizing machine	Vetequip	911103
Isoflurane volatilizing machine holder	Vetequip	901801
Leica surgical microscope	Leica	LEICA 10450243
Lubricant ophthalmic ointment	Picetal	NDC 46066-753-55
Marker pen	Delasco	SMP-BK
Meloxicam	Norbrook	NDC 55529-040-10
Microinjection pump and its controller	World Precision Instruments	micro4 and UMP3
Microliter syringe	Hamilton	Hamilton 80014	1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3
Mosquito forceps	CAROLINA	Item #:625314	Stainless Steel, Curved, 5 in
Depilatory agent	McKesson Corporation	N/A	Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion
Microscope 1	Nikon	SMZ745	Nikon microscope for cranial window preparation
Microscope 2	Zeiss	LSM 7 MP	two-photon microscope
Multiphoton laser	Coherent	Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W	laser for two-photon microscopy
Non-absorbable surgical suture	Harvard Apparatus	catlog# 59-6860	6-0, with round needle
Norland Optical Adhesive 81	Norland Products	NOA 81
No-Snag Needle Holder	CAROLINA	Item #: 567912
Quick base liquid	Parkell	S398	"B" Quick Base For C&B Metabond
Regular scissor 1	Eurostat	eurostat es5-300
Regular scissor 2	World Precision Instruments	No. 501759-G
Round cover glass 1	Warner instruments	CS-5R Cat# 64-0700	for 5 mm of diameter
Round cover glass 2	Warner instruments	CS-3R Cat# 64-0720	for 3 mm of diameter
Rubber rings	Orings-Online	Item # OO-014-70-50	O-Rings
Saline	Bioworld	L19102411PR
Spring scissor 1	World Precision Instruments	No. 91500-09	tip straight
Spring scissor 2	World Precision Instruments	No. 91501-09	tip curved
Stereotaxic platform	KOPF	Model 900LS
Super glue	Henkel	Item #: 1647358
surgical Caliper	World Precision Instruments	No. 501200
Surgical forceps 1	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	Catlog# 0508-5/45-PO	style 5/45, curved
Surgical forceps 2	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	catlog# 0103-5-PO	style 5, straight
Surgical forceps 3	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	catlog# 72912
Surgical forceps 4	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	Catlog# 0508-5/45-PO	style 5/45, curved
Surgical gauze	ZORO	catlog #: G0593801
Surgical lamp	Leica	Leica KL300 LED
UV box	Spectrolinker	XL-1000	also called UV crosslinker
Vaporguard	Vetequip	931401
Vetbond Tissue Adhesive	3M Animal Care	Part Number:014006