طرق دراسة مساهمات الرحم في تأسيس الحمل في نموذج فأر استئصال المبيض

Summary

تأسيس الحمل هو عملية ديناميكية تنطوي على تداخل معقد بين الجنين والرحم. ولا تزال المساهمات الدقيقة لبيئة رحم الأم في هذه العمليات مجالا نشطا للتحقيق. هنا ، يتم توفير بروتوكولات مفصلة للمساعدة في تصميم نماذج حيوانية في الجسم الحي لمعالجة هذه الأسئلة البحثية.

Abstract

لإثبات الحمل، يجب أن تتفاعل الكيسة الأريمية القابلة للحياة بنجاح مع بطانة الرحم المستقبلة (بطانة الرحم) لتسهيل الزرع وتكوين المشيمة وتمكين الحمل المستمر. إن القيود المفروضة على نجاح الحمل الناجمة عن العيوب الجنينية معروفة جيدا وقد تم التغلب عليها إلى حد كبير في العقود الأخيرة مع ظهور الإخصاب في المختبر (IVF) وتقنيات الإنجاب المساعدة. ومع ذلك ، حتى الآن ، لم يتغلب المجال على القيود الناجمة عن بطانة الرحم غير المتقبلة بشكل كاف ، مما أدى إلى ركود معدلات نجاح التلقيح الاصطناعي. تتشابك وظائف المبيض وبطانة الرحم بشكل وثيق ، حيث أن الهرمونات التي ينتجها المبيض هي المسؤولة عن الدورة الشهرية في بطانة الرحم. على هذا النحو ، عند استخدام نماذج القوارض للحمل ، قد يكون من الصعب التأكد مما إذا كانت النتيجة الملحوظة ناتجة عن عجز المبيض أو الرحم. للتغلب على هذا ، تم تطوير نموذج فأر استئصال المبيض مع نقل الأجنة أو إزالة الترسيب الاصطناعي للسماح بدراسة المساهمات الخاصة بالرحم في الحمل. ستوفر هذه المقالة إرشادات حول كيفية إجراء استئصال المبيض وتقدم رؤى حول التقنيات المختلفة لتزويد الهرمونات الخارجية لدعم عملية إزالة الترسبات الاصطناعية الناجحة أو الحمل بعد نقل الأجنة من متبرعين أصحاء. وتشمل هذه التقنيات الحقن تحت الجلد ، والكريات بطيئة الإطلاق ، والمضخات الصغيرة التناضحية. ستتم مناقشة المزايا والعيوب الرئيسية لكل طريقة ، مما يمكن الباحثين من اختيار أفضل تصميم دراسة لسؤالهم البحثي المحدد.

Introduction

مع الاستخدام المتزايد للتقنيات الإنجابية المساعدة في العقود الأخيرة ، تم التغلب على العديد من الحواجز التي تحول دون الحمل ، مما سمح للعديد من الأزواج بتكوين أسر على الرغم من مشاكل الخصوبة¹. غالبا ما يمكن تجاوز عجز البويضات أو الحيوانات المنوية باستخدام الإخصاب في المختبر أو حقن الحيوانات المنوية داخل الهيولي. ومع ذلك ، تظل القضايا المتعلقة بالرحم وتقبل بطانة الرحم "صندوقا أسود" بعيد المنال للإمكانات الإنجابية².

يتم تأسيس الحمل عندما يتفاعل الجنين عالي الجودة بنجاح مع بطانة الرحم المستقبلة (بطانة الرحم). فرص نجاح الحمل في أي دورة شهرية منخفضة ، عند حوالي 30٪ ^3,4. من بين تلك التي نجحت ، يتقدم 50٪ -60٪ فقط بعد 20 أسبوعا من الحمل ، مع فشل الزرع المسؤول عن 75٪ من حالات الحمل التي لا تصل إلى 20 أسبوعا³. على الرغم من هذه الأرقام التي يعود تاريخها إلى أواخر تسعينيات القرن العشرين ، فإن المجال لم يتغلب بعد على القيود الناجمة عن بطانة الرحم غير المتقبلة بشكل كاف. وقد أدى ذلك إلى ركود - وأحيانا انخفاض - معدلات نجاح التلقيح الاصطناعي في السنوات الأخيرة ^5,6.

غالبا ما يكون لدى النساء المصابات بالعقم غير المبرر نافذة نازحة من التقبل أو غير قادرات على تحقيق التقبل لأسباب غير معروفة. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير مجموعة تقبل بطانة الرحم ، والتي تقيم التعبير عن مئات الجينات بهدف تكييف توقيت نقل الأجنة مع نافذة تقبل الفرد⁷،^8،9. ومع ذلك ، لا يزال الحقل يفتقر إلى فهم التسبب في مضاعفات الحمل التي تظهر بعد اكتمال عملية الزرع.

الجهاز التناسلي للأنثى ديناميكي للغاية ويخضع لرقابة هرمونية مشددة. يتحكم محور ما تحت المهاد والغدة النخامية والغدد التناسلية (HPG) في إفراز الهرمون اللوتيني والهرمون المنبه للجريب ، والذي ينظم جوانب دورة المبيض ، بما في ذلك نضوج الجريب ونشاط الإستروجين والبروجسترون. في المقابل ، يتم تنظيم الدورة الشهرية الرحمية عن طريق هرمون الاستروجين والبروجستيرون^10,11. وبالتالي ، فإن دراسة الآليات البيولوجية الرحمية معقدة بسبب تأثير المبيض. على سبيل المثال ، عند دراسة كيفية تأثير علاجات السرطان على الرحم ، قد يكون من الصعب التمييز بين ما إذا كان أي نمط ظاهري للرحم لوحظ (مثل فقدان الحمل أو عدم حدة الحيض) هو نتيجة لإهانة مباشرة للرحم أو تأثير تبعي من تلف المبايض.

لفهم الخصوبة بشكل شامل ، يجب تمييز مساهمات الرحم في الحمل. الأهم من ذلك ، يجب أن يمتد هذا الفهم إلى ما وراء وظيفة الرحم تحت سيطرة المبيض. هذا لا يمكن دراسته في البشر. لذلك ، غالبا ما يتم استخدام النماذج الحيوانية. على هذا النحو ، يستخدم استئصال المبيض (OVX) بشكل شائع لتمكين الباحثين من تنظيم دورات القوارض الشحمية (مماثلة لدورة الحيض) عن طريق توفير الهرمونات خارجيا. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح OVX بدراسة استجابات الرحم بشكل مستقل عن تأثير المبيض¹². ومع ذلك ، إذا لم يتم توفير الهرمونات على الفور بعد OVX ، فسوف يحدث النمط الظاهري لانقطاع الطمث ، والذي يحتاج إلى دراسة بعناية من قبل الباحثين.

كثيرا ما يستخدم OVX في نماذج القوارض¹³،14،¹⁵،^16،17 ومن السهل نسبيا القيام به بعد التدريب الكافي. تختلف الطرق اعتمادا على ما إذا كان المبيض وحده أو المبيض وقناة البيض ، وكذلك اعتمادا على عمر الحيوان (الحيوانات البالغة ، التي يتم ركوب الدراجات لها مبايض أكبر مع جسم أصفر مرئي على سطحها ، مما يعني أن المبايض أسهل في التصور). وبالمثل ، توجد العديد من طرق التكميل الهرموني ، بما في ذلك الحقن تحت الجلد¹⁴ ، والكريات بطيئة الإطلاق 15 ، والمضخات الصغيرة التناضحية¹⁸ ، وتطعيم المبيض.

في هذه المقالة ، يتم توفير تعليمات مفصلة حول كيفية إجراء استئصال المبيض وإعداد ثلاثة أنواع من مكملات الهرمونات ، بما في ذلك الحقن تحت الجلد ، والكريات بطيئة الإطلاق ، والمضخات الصغيرة التناضحية. يتم توفير بروتوكولين مفصلين لنقاط النهاية التجريبية التي تستفيد من OVX تليها مكملات الهرمونات الخارجية (نقل الأجنة وإزالة الترسيب الاصطناعي). تناقش هذه المقالة نقاط القوة والضعف في كل نهج بهدف توجيه الباحثين فيما يتعلق بكيفية إجراء دراسات لعزل التأثيرات على الرحم ، وتحديدا في مجالات أبحاث الحمل والخصوبة.

Protocol

تم إيواء جميع الحيوانات في مرافق عالية الحاجز يتم التحكم في درجة حرارتها (مختبر أبحاث الحيوانات بجامعة موناش) مع وصول مجاني للطعام والماء ودورة 12 ساعة من الضوء والظلام. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لموافقة لجنة أخلاقيات منصة موناش لأبحاث الحيوان (# 21908 ، 17971) وتم تنفيذها وفقا لمدونة ممارسات المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية لرعاية الحيوانات واستخدامها.

1. التحضير الجراحي

1. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية والشاش والمناشف الورقية اللازمة للإجراءات على دورة البضائع الصلبة / الجافة عند 121 درجة مئوية مع وقت تعليق 30 دقيقة ووقت تجفيف 30 دقيقة.
2. وضع وسادة مقعد معقمة لمساحة العمل الجراحية وإعداد المسكنات.
   1. يتم تخفيف كاربروفين في محلول ملحي معقم إلى 1 ملغ / مل ، وتخفيف بوبيفاكايين في محلول ملحي معقم إلى محلول 0.5٪ (وزن / حجم).
   2. أضف 3.5 مل من ميلوكسيكام إلى زجاجة ماء قفص سعة 400 مل.
3. قم بتسخين وسادة (ضمادات) الحرارة مسبقا لأقفاص الاسترداد ، وقم بإعداد مصابيح حرارية لتسليط ضوء غير مباشر على الحيوانات التي تتعافى.
4. تأكد من ارتداء جميع معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك شبكة الشعر وقناع الوجه والرداء والقفازات.
5. مارس تقنية معقمة جيدة ، بما في ذلك رش القفازات بانتظام بالإيثانول والسماح لها بالتبخر قبل التعامل مع الأدوات الحيوانية أو الجراحية لتجنب تلوث الإيثانول.

2. إجراء استئصال المبيض

1. باستخدام آلة تخدير الغاز مع الأيزوفلوران ، املأ صندوق الحث مسبقا لمدة 3-5 دقائق عند 5٪ إيزوفلوران مع ضبط معدل التدفق على 4 لتر / دقيقة.
2. ضع الماوس داخل صندوق الحث ، وبمجرد فقدانه للوعي ، انقله إلى مخروط الأنف وقلل معدل التدفق إلى 0.4 لتر / دقيقة ، مع ضبط مبخر الأيزوفلوران على ~ 2.5٪.
   ملاحظة: تختلف النسبة المئوية للأيزوفلوران المستخدم لبقية الإجراء بناء على سلالة الفئران والعمر والتعرض للعلاجات (مثل العلاج الكيميائي) ويجب تعديلها بناء على تقييم دقيق لأنماط تنفس كل على حدة. يجب أن تظل أنماط التنفس بمثابة أنفاس البطن العادية. قد تشير الأنفاس الصدرية السريعة إلى أنه لم يتم الوصول إلى طائرة جراحية عميقة أو صيانتها. في هذه الحالة ، اضبط نسبة مبخر الأيزوفلوران حسب الضرورة.
3. ضع مزلق العين بسخاء عن طريق الضغط على الأنبوب وربت العين برفق.
4. احلق منطقة صغيرة (2 سم × 2 سم) عند وأسفل حدس العمود الفقري.
5. تطبيق 5 ملغ/ كغ كاربروفين من محلول مخفف عيار 1 ملغ/ مل تحت الجلد عند قشرة الرقبة.
6. اختبر عمق التخدير باستخدام منعكس قرصة إصبع القدم عن طريق الضغط على إصبع القدم الخلفي للماوس. إذا لم يكن هناك رد فعل قرصة إصبع القدم ، يكون الحيوان في المستوى الجراحي العميق ، ويمكن أن يستمر الإجراء.
7. ضع البيتادين على المنطقة الجراحية ، وقم بتغطيته بستارة جراحية (شاش مع نافذة 2 سم × 2 سم).
8. باستخدام ملقط ذو أسنان الفئران ، اسحب الجلد عند حدس الظهر لأعلى ، وقم بعمل شق طولي ~ 5 مم.
   ملاحظة: يعد شق الجلد عند هذا الارتفاع على ظهر الحيوان هو الأفضل لوضع المشبك الجراحي لتقليل فرصة إزالة الحيوان للمشابك وطلب إصلاحات المشبك.
9. باستخدام ملقط حاد ، تابع تشريح الجلد بشكل حاد بعيدا عن طبقة العضلات الأساسية ، والتحرك لأسفل وإلى جانب واحد نحو الكلى.
10. التعرف على وسادة الدهون في الكلى والمبيض والمبيض بصريا من خلال جدار العضلات.
    ملاحظة: ستظهر الكلية بلون أحمر غامق ، وستظهر وسادة الدهون بيضاء ناصعة ، وإذا كانت مرئية ، سيبدو المبيض كنقطة وردية صغيرة داخل وسادة الدهون.
11. باستخدام ملقط ، والاستيلاء على ورفع طبقة العضلات. قم بعمل شق ~ 0.5-1 سم بمقص جراحي حاد. استمر في إمساك جدار العضلات بالملقط ، وقم بالتغيير من المقص إلى الملقط الحاد لسحب وسادة دهون المبيض من خلال الشق.
12. باستخدام حامل إبرة منحني ، قم بالتثبيت أسفل المبيض وقناة البيض في الطرف البعيد من قرن الرحم.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن إزالة المبيض وحده ، وترك قناة البيض سليمة. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مجهر تشريح لتصور دقيق للتمييز بين المبيض وقناة البيض.
13. إزالة المبيض بمقص أو مشرط. استمر في التثبيت لمدة 30 ثانية لتجنب النزيف المفرط.
14. قم بإزالة المشبك ، وربت بشاش معقم إذا لزم الأمر.
15. لإغلاق شق جدار العضلات ، استخدم ملقط لرفع الجزء العلوي من الشق بحيث يتم سحب الشق معا بشكل طبيعي.
16. استخدم خيوط الحرير (مقاس 3-0) لإغلاق شق جدار العضلات بعقدة الجراح.
17. ضع قطرتين إلى ثلاث قطرات من بوبيفاكايين موضعيا باستخدام حقنة سعة 1 مل بدون إبرة متصلة ، وكرر الخطوات 2.9-2.17 على الجانب الآخر.
18. لإغلاق شق الجلد ، استخدم الشاش لتجفيف المنطقة من البوبيفاكايين الزائد ، واضغط على جانبي الجلد معا.
19. ضع مشبكا أو مشبكين جراحيين مقاس 7 مم ، مما يتيح مساحة للتورم كجزء من عملية الشفاء.
20. حرك الماوس إلى قفص الاسترداد ، وراقب عن كثب لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: يجب أن تستيقظ الحيوانات بسرعة. تأكد من مراقبة التنفس عن كثب لأنماط التنفس الصدري الطبيعية.

3. إعداد هرمون: الحقن تحت الجلد

1. اصنع محلول مخزون 1 مجم / مل من استراديول.
   1. قم بوزن 0.001 جم (1 مجم) من مسحوق استراديول في أنبوب معقم سعة 1.5 مل.
   2. أضف 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الأنبوب ، ودوامة لبضع ثوان.
      ملاحظة: سيبقى الإيثانول واضحا مع وجود بقع مرئية من مسحوق استراديول.
   3. لف الأنبوب بالفيلم لمنع أي تبخر للإيثانول.
   4. لف الأنبوب بورق الألمنيوم ، وضعه على هزاز طوال الليل لإذابة مسحوق استراديول تماما.
   5. خفف مخزون 1 مجم / مل في زيت السمسم إلى التركيز النهائي المطلوب.
      ملاحظة: مطلوب جرعات من 100 نانوغرام لمدة 3 أيام للتحضير قبل إزالة الترسيب الاصطناعي ، وجرعات منخفضة إضافية من 25 نانوغرام مطلوبة عند إعطاء البروجسترون. هذا لمكافحة حلقة التغذية الراجعة التي تتحكم في تعبير مستقبلات هرمون البروجسترون. لنقل الأجنة ، يلزم جرعتان من 100 نانوغرام في اليوم 1 واليوم 3 قبل نقل الأجنة في اليوم 4. في وقت نقل الأجنة ، يلزم أيضا جرعة منخفضة من 25 نانوغرام.
   6. ارسم الكمية المطلوبة من استراديول في الزيت في حقنة سعة 1 مل ، ثم قم بتوصيل طرف إبرة 26 جرام.
   7. حقن الجرعة المناسبة تحت الجلد (إما عند القفا أو الخاصرة ؛ 100 نانوغرام / 100 ميكرولتر أو 25 نانوغرام / 100 ميكرولتر للتحضير قبل نقل الأجنة أو إزالة الترسبات الاصطناعية أو في وقت نقل الأجنة) بالتردد المطلوب.
      ملاحظة: الزيت لزج للغاية ، لذا تأكد من الحقن ببطء وتوقف مؤقتا لبضع ثوان قبل إزالة الإبرة. سيؤدي ذلك إلى تقليل كمية الزيت التي تتسرب من موقع الحقن.
2. اصنع محلول مخزون 200 مجم / مل من البروجسترون.
   1. قم بوزن 0.4 جم (400 مجم) من مسحوق البروجسترون في أنبوب معقم سعة 5 مل.
   2. أضف 2 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الأنبوب ، ودوامة لبضع ثوان.
      ملاحظة: سيصبح الإيثانول أبيض اللون.
   3. كرر الخطوات 3.1.3-3.1.4.
   4. خفف مخزون 200 مجم / مل في زيت السمسم إلى التركيز النهائي المطلوب.
      ملاحظة: مطلوب جرعات من 2 ملغ يوميا لدعم نقل الأجنة.
   5. حقن الجرعة المناسبة (على سبيل المثال، 2 ملغ/100 ميكرولتر يوميا لدعم الحمل) تحت الجلد كما في الخطوات 3.1.6-3.1.7.

4. تحضير الهرمونات: كريات بطيئة الإطلاق

1. ضع رقاقة على سطح التدفق الصفحي أو غطاء السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.
2. ضع جميع المعدات (قفازات ، أطباق بتري ، محاقن سعة 1 مل ، ملقط ناعم) في غطاء المحرك ، وقم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة.
   ملاحظة: لا تقم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية مع وجود مادة مانعة للتسرب داخل الغطاء لأنها ستثبت.
3. اغسل أنبوب السيلاستيك بالإيثانول بنسبة 100٪ ، واتركه يجف في الهواء في الغطاء. بمجرد أن يجف ، ضع علامة على طول ~ 1 سم على طول الأنبوب ، واقطعه بمشرط.
4. قم بإزالة المكبس من حقنة ، واضغط في ~ 200 ميكرولتر من مانع التسرب. استبدل المكبس ، واضغط على كمية صغيرة من مانع التسرب من المحقنة.
5. ضع كمية صغيرة من المادة المانعة للتسرب على أحد طرفي الأنبوب ، وقم بتنعيمها بإصبع قفاز.
6. اتركيه حتى يجف طوال الليل أو لمدة 20-30 دقيقة في ضوء الأشعة فوق البنفسجية داخل الغطاء.
7. صب كمية مناسبة من هرمون البروجسترون في طبق بتري معقمة. باستخدام ملقط ، مغرفة الكريات في مسحوق البروجسترون لملء بيليه.
   1. اضغط على الطرف المختوم للحبيبات على سطح غطاء المحرك لتكثيف البروجسترون لأسفل. بدلا من ذلك ، استخدم نهاية الملقط المعقم لحشو البروجسترون. اترك مساحة كافية لمزيد من المواد المانعة للتسرب.
8. أغلق الطرف المفتوح بمادة مانعة للتسرب ، كما هو موضح في الخطوات 3.4-3.5.
9. لف طبق بتري الذي يحتوي على كريات البروجسترون بورق لحمايته من الضوء.
10. قم بتنشيط الكريات لمدة لا تقل عن 72 ساعة قبل إدخالها تحت الجلد عن طريق الحضانة في 1٪ FCS مجردة من الفحم (cs-FCS: PBS) عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن صنع الكريات بكميات كبيرة بنهاية واحدة مختومة مسبقا. ومع ذلك ، يجب استخدام هرمون البروجسترون الطازج لملئها في كل مرة. تأكد من تعقيم الكريات مسبقة الصنع بالأشعة فوق البنفسجية قبل ملئها بالبروجسترون. سوف تفرز الكريات ~ 500 ميكروغرام / يوم لمدة 6-10 أيام ، وهو دعم كاف لإجراءات إزالة الترسيب الاصطناعي ونقل الأجنة ، على الرغم من أنه قد تكون هناك حاجة إلى حقن هرمون الاستروجين بجرعة منخفضة إضافية للحفاظ على نشاط مستقبلات البروجسترون بعد 4-5 أيام. بعد 10 أيام ، قد تكون هناك حاجة إلى بيليه البروجسترون البديل.

5. إعداد هرمون: مضخات صغيرة التناضحي

1. تحضير البروجسترون بالتركيز المطلوب في محلول مائي ، واختيار نموذج المضخة الاسموزية الصغيرة المناسب (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: بالنسبة للقسم 7 (الإجراء التجريبي: نقل الأجنة) ، يلزم تسليم 2 ملغ / يوم لمدة 12 يوما. لذلك ، قم بإذابة 28 ملغ من هرمون البروجسترون في ~ 100 ميكرولتر من الماء المعقم لكل (اتبع تعليمات الشركة المصنعة للحجم المحدد). قد تكون هناك حاجة للتخفيفات التسلسلية. بالنسبة للقسم 8 (الإجراء التجريبي: إزالة الترسيب الاصطناعي) ، يلزم تسليم 500 ميكروغرام يوميا لمدة 3 أيام. لذلك ، قم بإذابة 1500 ميكروغرام من هرمون البروجسترون في ~ 100 ميكرولتر من الماء المعقم لكل. قم بإعداد حل إضافي لحساب الحجم المفقود أثناء إجراء التعبئة.
2. قم بإعداد المعدات (قفازات ، مناديل منخفضة الوبر ، أطباق بتري ، محلول ملحي معقم ، محاقن سعة 1 مل ، قوارب وزن صغيرة ، رقائق معدنية ، وموازين دقيقة تصل إلى 0.01 جم) داخل غطاء أمان بيولوجي من الفئة الثانية ، ثم قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة.
3. ضع محلول الهرمون في حقنة سعة 1 مل ، ثم قم بتوصيل أنبوب تعبئة معقم ، مع التأكد بعناية من عدم وجود فقاعات هواء.
4. قم بوزن المضخة ووسيط التدفق الخاص بها داخل قارب وزن معقم.
5. أدخل أنبوب التعبئة من خلال الفتحة الموجودة أعلى المضخة حتى لا تتمكن من المضي قدما.
6. أمسك المضخة في وضع مستقيم ، ادفع مكبس المحقنة ببطء لملء الأنبوب.
   ملاحظة: يجب تجنب التعبئة السريعة لأن ذلك يمكن أن يدخل فقاعات هواء في المضخة.
7. عندما يفيض المحلول من أعلى المضخة ، قم بإزالة أنبوب التعبئة برفق ، وامسح المحلول الزائد بمسح معقم منخفض النسالة.
8. أدخل وسيط التدفق من خلال الفتحة الموجودة أعلى المضخة حتى لا تتمكن من المضي قدما. بمجرد الدخول بالكامل ، اضغط بقوة على المضخة ومشرف التدفق معا.
9. قم بوزن المضخة المملوءة مع وجود وسيط التدفق في مكانه.
   ملاحظة: الفرق في الوزن الذي تم الحصول عليه من الخطوة 5.3 والخطوة 5.8 سيعطي الوزن الصافي للمحلول المحمل (أي زيادة 0.1 جم = 100 ميكرولتر من المحلول المضاف).
10. ضع المضخة المملوءة في طبق بتري معقم مملوء بمحلول ملحي معقم.
11. بمجرد ملء جميع المضخات ، لف طبق بتري بورق القصدير ، وضعه داخل حاضنة 37 درجة مئوية للتحضير لمدة 4-6 ساعات على الأقل (أو حتى يصبح جاهزا للاستخدام).

6. الإجراء الجراحي: إدخال كريات هرمون تحت الجلد ومضخات صغيرة

1. تحضير المنطقة حسب القسم 1 (التحضير الجراحي).
2. تخدير الحيوانات وفقا للخطوات 2.1-2.3.
3. حلق مساحة صغيرة عند قشرة الرقبة (~ 1 سم × 1 سم).
4. تطبيق 5 ملغ/ كغ كاربروفين من محلول مخفف عيار 1 ملغ/ مل تحت الجلد في خاصرة الساق.
5. اختبار لمنعكس قرصة إصبع القدم. إذا لم يكن هناك رد فعل ، يكون الحيوان في المستوى الجراحي العميق ، ويمكن أن يبدأ الإجراء.
6. ضع البيتادين على المنطقة الجراحية ، وقم بتغطيتها بستارة جراحية (شاش مع نافذة 2 سم × 2 سم مقطوعة).
7. باستخدام ملقط ذو أسنان الفئران ، اسحب الجلد عند الرقبة (في منتصف الطريق بين القفا الحقيقي وحدس الظهر) لأعلى ، وقم بعمل شق طولي ~ 5 مم.
8. باستخدام ملقط حاد ، تشريح حادة الجلد بعيدا عن طبقة العضلات الأساسية في اتجاه هبوطي.
   ملاحظة: لإدخال المضخة الصغيرة التناضحية ، قم بإنشاء جيب على طول جانب واحد من الحيوان بحيث لا تقيد المضخة حركة الحيوان أو تضغط لأعلى على موقع الشق.
9. بمجرد توفير مساحة كافية لحبيبات الهرمونات أو المضخة الصغيرة ، استخدم ملقط معقم لالتقاط الحبيبات أو المضخة الصغيرة ، وأدخلها في الجيب تحت الجلد المصنوع من تشريح حاد.
10. لإغلاق شق الجلد ، تأكد من أن الحبيبات أو المضخة الصغيرة بعيدة بما يكفي في الجيب بحيث لا تتلفها المشابك الجراحية.
11. ضع البوبيفاكايين موضعيا حسب الخطوة 2.17.
12. أغلق الجرح بمشبك جراحي واحد. حرك الماوس إلى قفص الاسترداد ، وراقب عن كثب لمدة 15 دقيقة. نظرا لأن هذا إجراء قصير ، يجب أن تكون الحيوانات متنقلة في غضون دقائق.

7. الإجراء التجريبي: نقل الأجنة

1. بالنسبة للحيوانات التي تم استئصال المبيض ، قبل 3 أيام من نقل الأجنة عن طريق الحقن تحت الجلد من 100 نانوغرام / 100 ميكرولتر استراديول (الخطوة 3.1).
2. قبل يوم واحد من نقل الأجنة، يتم إعطاء الحيوانات جرعة تحت الجلد من 2 ملغ / 100 ميكرولتر أسيتات ميدروكسي بروجستيرون (الخطوة 3.2).
3. تحضير المنطقة حسب القسم 1 (التحضير الجراحي).
4. تخدير الحيوانات وفقا للخطوات 2.1-2.3.
5. ابدأ الإجراء وفقا للخطوات 2.4-2.10.
6. تحت مجهر تشريح ، قم بإنشاء نقطة حقن داخل الرحم بطرف إبرة 26 جرام.
7. ماصة خمسة أكياس أريمية في قطرة وسائط M2 ، ثم نقلها إلى قرن الرحم.
8. لإغلاق شق جدار العضلات ، ارفع الجزء العلوي من الشق باستخدام ملقط بحيث يتم سحب الشق معا بشكل طبيعي.
9. باستخدام خيوط الحرير ، أغلق موقع جدار العضلات بعقدة الجراح. تطبيق قطرات من بوبيفاكايين موضعيا.
10. كرر الخطوات 7.5-7.8 على الجانب الآخر.
11. لإغلاق شق الجلد ، استخدم الشاش لتجفيف المنطقة من البوبيفاكايين الزائد ، واضغط على جانبي الجلد معا.
12. ضع مقطعا أو مقطعين جراحيين ، مما يتيح مساحة للتورم كجزء من عملية الشفاء.
    ملاحظة: إذا تم استئصال المبيض للحيوانات ، فإن الهرمونات الخارجية مطلوبة في وقت نقل الأجنة. إما حقن البروجسترون تحت الجلد (2 ملغ) أو إدخال بيليه البروجسترون تحت الجلد أو مضخة صغيرة تناضحية. لمكافحة البروجسترون الزائد ، يلزم حقن جرعة منخفضة تحت الجلد من هرمون الاستروجين (25 نانوغرام / 100 ميكرولتر) في وقت نقل الأجنة.
13. احمل الماوس بعناية إلى قفص الاسترداد ، وراقبه عن كثب لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: يجب أن تستيقظ الحيوانات بسرعة. تأكد من مراقبة التنفس عن كثب لأنماط التنفس الصدري الطبيعية.

8. الإجراء التجريبي: إزالة الترسيب الاصطناعي

1. هرمون رئيس الحيوانات مع 100 نانوغرام / 100 ميكرولتر استراديول في اليوم 1 واليوم 2 واليوم 3 ، وفقا للقسم 3 (إعداد الهرمونات: الحقن تحت الجلد) قبل 8 أيام من إزالة الترسيب الاصطناعي.
2. هرمون رئيس الحيوانات مع 5 نانوغرام / 100 ميكرولتر استراديول في اليوم 7 واليوم 8 واليوم 9 ، وفقا للقسم 3 (إعداد الهرمونات: الحقن تحت الجلد) قبل يومين من إزالة الترسيب الاصطناعي.
   ملاحظة: يجب أن يحدث الحقن النهائي بحد أدنى 3 ساعات (وبحد أقصى 4 ساعات) قبل إجراء إزالة الترسيب الاصطناعي.
3. الحيوانات الرئيسية الهرمونية مع حبيبات البروجسترون تحت الجلد أو مضخة تناضحية صغيرة (500 ميكروغرام / يوم) ، وفقا للقسم 4 ، القسم 5 ، والقسم 8 ، قبل يومين من إزالة الترسيب الاصطناعي.
4. تحضير المنطقة حسب القسم 1 (التحضير الجراحي).
5. تخدير الحيوانات وفقا للخطوات 2.1-2.2.
6. اختبر عمق التخدير باستخدام منعكس قرصة إصبع القدم. إذا لم يكن هناك رد فعل قرصة إصبع القدم ، يكون الحيوان في المستوى الجراحي العميق ، ويمكن أن يستمر الإجراء.
7. ضع الماوس في وضع الانبطاح ، وارفع الذيل ، وأدخل ببطء منظارا قطره 6 مم في المهبل.
8. مع الحفاظ على أنف الحيوان في مخروط الأنف المخدر ، ضع الجزء السفلي من جسم الحيوان بين الإصبعين الأول والثاني من اليد غير المهيمنة. استخدمي الإبهام لدفع الذيل برفق لأعلى للحفاظ على فتحة المهبل في الرؤية.
9. نقل 20 ميكرولتر من زيت السمسم إلى قرن رحم واحد باستخدام طرف نقل جنين غير جراحي (متصل بماصة 20 ميكرولتر).
   1. الحفاظ على مستوى ماصة مع فتحة المهبل ، أدخل الطرف في المهبل ومن خلال عنق الرحم في قرن الرحم. بمجرد أن يصبح الطرف في قرن الرحم ، اضغط برفق على الطرف على سطح بطانة الرحم (في حالة استخدام تقنية المناولة أعلاه ، ستشعر هذه الحركة بالإصبع الثاني) ، وطرد الزيت ببطء.
      ملاحظة: حافظ على مكبس الماصة مضغوطا ، وانتظر لمدة 10 ثوان للتأكد من تشتت كل الزيت ، وقم بإزالة طرف النقل ببطء مع إبقاء المكبس مضغوطا.
10. إزالة المنظار من المهبل.
11. احمل الماوس بعناية إلى قفص الاسترداد ، وراقبه عن كثب لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: يجب أن تستيقظ الحيوانات بسرعة. راقب تنفسهم عن كثب بحثا عن أنماط التنفس الصدري الطبيعية.
12. الحد من التعامل مع الحيوانات ، والاحتفاظ بها في بيئة هادئة لمدة 96 ساعة بعد العملية.
    ملاحظة: ستؤثر الضوضاء العالية أو التغييرات المفاجئة في دورة الضوء والظلام على نجاح الإجراء. في وقت تشريح الأنسجة ، يمكن قياس مدى نجاح إزالة الترسبات كنسبة من وزن الرحم إلى وزن الجسم. إجراء إزالة الترسيب الاصطناعي لديه معدل نجاح 80 ٪. لذلك ، استبعد الحيوانات التي تفشل في إزالة الترسبات ، وأخذ ذلك في الاعتبار عند اختيار أحجام العينات للتجارب.

9. الإجراء الجراحي: التعافي بعد الجراحة والمراقبة وإصلاح المشابك

1. اسمح للحيوانات باستعادة وسادات الحرارة نصف المنتظمة طوال الليل قبل إعادتها إلى قفصها المنزلي.
2. راقب الحيوانات يوميا لمدة 5 أيام بعد الجراحة ، مع إيلاء اهتمام وثيق لموقع الجرح بحثا عن علامات العدوى.
3. قم بإجراء إصلاح المشبك إذا لزم الأمر.
   1. تحضير المنطقة حسب القسم 1 (التحضير الجراحي).
   2. تخدير الحيوانات وفقا للخطوات 2.1-2.3.
   3. قم بإزالة المقطع الموجود باستخدام مزيل المشبك إذا كان المقطع لا يزال موجودا.
   4. ضع مشبكا جراحيا جديدا ، وفقا للخطوات 2.19-2.21.
4. قم بإزالة المشابك الجراحية بعد 7 أيام من الجراحة وفقا للخطوات 9.3.1-9.3.3 أو عندما يكون الحيوان تحت التخدير التالي (مثل نقل الأجنة أو إجراء إزالة الترسبات الاصطناعية أو الحقن تحت الجلد بعد الجراحة).

النتائج

تم وصف نموذج جيد التوصيف الاصطناعي في ورقة البروتوكول هذه (الشكل 1 أ). هنا ، خضعت إناث الفئران البالغة (8 أسابيع) لاستئصال المبيض الجراحي كما هو موضح في القسم 1 والقسم 2. ثم استراحت الفئران لمدة أسبوعين للتأكد من تبديد هرمونات المبيض الداخلية قبل دعمها بالهرمونات ا...

Discussion

توفر هذه المقالة إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية إجراء OVX وتوفير هرمونات خارجية للدراسات التي تركز على فهم مساهمات الرحم في الحمل والخصوبة. يتم توفير بروتوكولين مفصلين حول تطبيقين تجريبيين لهذه الطرق ، بما في ذلك إجراء نقل الأجنة وتحفيز إزالة الترسبات بشكل مصطنع.

في حين أن إجر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ALZET 1002 mini osmotic pumps	BioScientific	1002	Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotic pumps	BioScientific	1003D	Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization).
ALZET Reflex 7 mm clips	BioScientific	0009971	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip applicator	BioScientific	0009974	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
ALZET Reflex clip remover	BioScientific	0009976	Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference
Bupivicaine injection	Pfizer	NA	Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline
Estradiol	Sigma	E8875
Meloxicam	Ilium	NA	Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 400 mL cage water bottle, or as your institution's vet prescribes.
Michel clips	Daniels	NS-000242
Multi purpose sealant	Dow Corning	732
Non-surgical embryo transfer (NSET) device	ParaTechs	60010	Contains 6 mm speculum. Single use only.
Progesterone	Sigma	P0130	Soluble in ethanol. Use for  section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and  section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets)
Progesterone	Sigma	P7556	Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps)
Refresh eye ointment	Allergan	NA	42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin
Rimadyl Carprofen	Zoetis	NA	Stock 50 mg/mL. Use at 1 mg/ml (for 5 mg/kg dose)
Rubber tubing	Dow Corning	508-008	Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ±  0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm.
Sesame oil	Sigma	S3547
Sofsilk Silk sutures size 3-0	Covidien	GS-832